一种脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油的提取方法和应用与流程

1.本发明涉及农产品处理技术领域，特别是涉及一种脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油的提取方法和应用。


背景技术：

2.脐橙是芸香科柑橘属甜橙类中的一个品种，脐橙皮渣约占果重的25％。在橙汁加工过程中产生的大量脐橙皮渣多数以废弃物处理，浪费资源并且造成环境污染。橙皮富含精油和多种有效活性成分，若能对橙皮渣进行有效处理，则可变废为宝，有效保护环境。对脐橙果皮残渣进行精油提取是其处理方式之一。
3.一般的，对于果皮精油的提取方法主要有冷磨法、冷榨法和蒸馏法。这三种传统提取方法存在提取率低、纯度低或精油品质较差等缺点。果皮提取精油也会用到酶解法。中国专利cn106978257a使用酶解法来提取脐橙果皮精油，粉碎脐橙果皮与水混合，加入果胶酶和纤维素酶进行酶解，得到的酶解混合液需经过灭酶、萃取、精馏、脱萜等一系列后处理才能得到精制的脐橙果皮精油。一般的酶解法会同时提取出细胞内大量的多糖和黄酮，而多糖含量太高会影响精油品质，也会对防腐稳定性造成隐患；黄酮容易被氧化而变黄，导致精油品质下降。所以需经过一系列后处理纯化精油，步骤复杂，也会导致挥发性成分损失，收率低，成本高。
4.新鲜橙皮饱含水分，可提取出富含活性成分的细胞水加以利用。对于植物细胞水的提取，中国专利cn 106261332 a公开了一种水果细胞水的提取方法，柠檬经过去皮、切片、冷冻，再于真空度为0.08～0.095，温度40～45℃下提取细胞水。该方法主要是通过冷冻破坏柠檬细胞结构，从而促进细胞水的流出。其适用于水分较多的果肉细胞水的提取，而果皮水分含量少，该方法提取效果不显著，且其提取速度比较慢，不适合工业化生产。
5.中国专利cn109730948a公开了一种采用超声低温旋蒸法和酶法相结合制备牡丹鲜花细胞水的方法：首先通过压榨法得到榨汁和残渣1，再将残渣1旋蒸得到细胞水1和残渣2，最后将残渣2进行酶解后再旋蒸得到细胞水2。将榨汁、细胞水1和细胞水2混合后得到高收率牡丹花细胞水。该方法具有较高的提取效率，但是具有如下缺陷：(1)采用压榨法，后与真空提取法得到的液体混合，这样会带入多糖、色素和刺激气味，导致防腐和脱色问题；(2)工艺后期配合其他植物一起蒸馏，解决防腐问题，但是容易改变原有的牡丹花细胞水成分和气味，后期生产也无法控制品质。
6.现有技术中尚未有可同时提取出优质的橙皮细胞水和橙皮精油的方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于，提供一种脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油的提取方法，不仅提取速度快，而且能够控制脐橙果皮细胞水和精油的化学组成。
8.本发明是通过以下技术方案实现的：
9.一种脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油的提取方法，包括以下步骤：不加入溶剂，将
脐橙果皮在温度30℃～65℃、压力-60kpa～-101kpa下初步提取，提取过程中脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油形成蒸气，通过冷凝收集液体，提取1.5～2.5小时，得到初提液体和初提果皮残渣，在初提液体中加入初始脐橙果皮总重量为基准的0.2％～0.4％的纤维素酶和0～0.1％的果胶酶，再将初提液体加入初提果皮残渣中，在30℃～45℃、压力-60kpa～-101kpa条件下再次提取3～7小时，提取结束后将收集到的液体静置分层得到脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油。
10.脐橙果皮本身是片状的，将其切割成宽度为1～10mm的条状再进行提取，更有利于细胞水和精油的流出。
11.优选的，所述的初步提取温度为35℃～50℃、压力-80kpa～-101kpa条件。在优选的条件范围内，植物细胞内低沸点物质可被蒸发提取出来，提取速度快，同时提取温度接近室温，能够保留挥发出来的细胞水活性，使分离出的初提液体具有很好的渗透性。
12.初步提取时间是关键参数之一，如果时间太短，初提液体提取量过少，加入酶后液体很难浸润果皮残渣表面，导致酶解不能正常进行；如果初步提取时间过长，初提液体量过多，降低了后续提取效率，也增加了酶解时间，带来过度酶解的风险。本发明通过在初提液体中加入一定量的酶，再次投入容器中对果皮残渣进行提取，具有如下有益优点：第一、初提液体表面张力低，渗透性好；第二、初提液体ph为3～7，无需额外调节ph，有利于提高酶活性；第三、酶解能够加速破壁；第四、低温真空技术提取。通过四种效应的协同，能够在较低温度(30～45℃)下控制酶解速度，加快细胞液流出速度。再次提取步骤中的前1小时左右会蒸除掉倒回容器内的初提液体，加快酶解速度，缩短酶解的时长(此时初提液体的多少就至关重要，多了会延长酶解时间，少了会缩短酶解时间)，避免了传统酶解法需要加入大量的水稀释细胞液以及酶解过度带来的刺激气味。
13.关于初提液体的渗透性，通过实验发现，当采用脐橙果皮细胞水作为溶剂法的溶剂提取脐橙果皮残渣时，能够带出大量的黄酮和多糖等大分子物质以及易挥发活性成分；相比于纯水作为溶剂，采用脐橙果皮细胞水作为溶剂能够提取出多于30％的黄酮和多糖。
14.优选的，所述的纤维素酶加入量为0.25％～0.35％，果胶酶加入量为0.01％～0.06％。优选的酶加入量，再通过温度的控制，能够控制酶解的速度；而且，酶是大分子蛋白质，在上述加入量范围下，能够吸附在果皮细胞表面，难以在低温真空条件挥发出来，无需进行后续处理。
15.并且，本发明的方法不会提取出黄酮和多糖等大分子物质，进一步提升细胞水和精油的稳定性。
16.在提取过程中进行搅拌，搅拌速度为1～150转/分钟；防止局部高温，同时能够加快提取速度，且有利于充分提取出细胞水和精油。
17.收集过程中进行冷凝，冷凝温度为-10～8℃。
18.本发明所述的脐橙果皮为新鲜脐橙果皮，一般的，新鲜脐橙果皮饱含水分、硬朗有弹性、无腐烂和霉变，未经烤干或晒干。干的脐橙果皮水分含量低难以提取出挥发性物质。
19.通过本发明的方法制备得到的脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油，绿色天然，不含有机溶剂，芳香浓郁、纯正，可应用于护肤品、食品、保健品等领域。
20.本发明相比于现有技术，具有如下有益效果：
21.本发明通过低温-真空(减压)提取技术，先提取一定量的细胞液，然后利用初提液
体的高渗透性，加入酶后再次提取脐橙果皮残渣，酶解与低温-真空(减压)提取同时进行，能够加速细胞水和精油的提取效率，且避免了传统酶解法带来的酶解过度问题；相比于单一的低温-真空提取技术能够得到更多的细胞液(特别是精油更多)，而且含有的活性成分更多。
22.通过本发明方法得到的脐橙果皮细胞水，无色澄清透明，纯度高，含有70多种易挥发活性成分，具有宜人的脐橙果香，安全性高，而且具有一定的抑菌效果，无需添加任何外来防腐剂，也能起到自身防腐作用。并且通过本发明得到的脐橙果皮精油，不含有多糖和黄酮，稳定性好；主要活性成分含量高，芳香纯正，为优质精油。
附图说明
23.图1为实施例1脐橙果皮细胞水安全性测试数据。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
25.实施例和对比例所用的脐橙果皮为新鲜的信丰脐橙果皮。将脐橙果皮切割成宽度为3～5mm的条状，进行提取实验。
26.实施例1：
27.将50kg脐橙果皮投入150l低温真空提取设备，不加入任何溶剂，在40℃，压力-90kpa、60转/分搅拌下初步提取，脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油形成蒸气，冷凝收集(冷凝温度为-5℃)，提取2小时，分离后得到初提液体和初提残渣，在初提液体中加入初始脐橙果皮总重量为基准的0.32％的纤维素酶和0.04％的果胶酶，再将初提液体加入初提残渣中，在40℃、压力-90kpa、60转/分搅拌条件下再次提取脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油，提取6小时，提取结束后将收集到的液体静置分层得到33.1kg的脐橙果皮细胞水和285g的脐橙果皮精油。细胞水无色澄清透明，果香浓郁；精油澄清透明，芳香纯正。
28.实施例2：
29.将50kg脐橙果皮投入150l低温真空提取设备，不加入任何溶剂，在30℃，压力-101kpa、45转/分搅拌下初步提取，脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油形成蒸气，冷凝收集(冷凝温度为-5℃)，提取2.5小时，分离后得到初提液体和初提残渣，在初提液体中加入初始脐橙果皮总重量为基准的0.3％的纤维素酶和0.02％的果胶酶，再将初提液体加入初提残渣中，在35℃、压力-101kpa、60转/分搅拌条件下再次提取脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油，提取7小时，提取结束后将收集到的液体静置分层得到33.9kg的脐橙果皮细胞水和287g的脐橙果皮精油。细胞水无色澄清透明，果香浓郁；精油澄清透明，芳香纯正。
30.实施例3
31.将50kg脐橙果皮投入150l低温真空提取设备，不加入任何溶剂，在65℃，压力-60kpa、120转/分搅拌下初步提取，脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油形成蒸气，冷凝收集(冷凝温度为-5℃)，提取1.5小时，分离后得到初提液体和初提残渣，在初提液体中加入初始脐
橙果皮总重量为基准的0.28％的纤维素酶和0.03％的果胶酶，再将初提液体加入初提残渣中，在35℃、压力-101kpa、120转/分搅拌条件下再次提取脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油，提取6.5小时，提取结束后将收集到的液体静置分层得到33.5kg的脐橙果皮细胞水和289g的脐橙果皮精油。细胞水无色澄清透明，果香浓郁；精油澄清透明，芳香纯正。
32.实施例4：
33.将50kg脐橙果皮投入150l低温真空提取设备，不加入任何溶剂，在45℃，压力-90kpa、45转/分搅拌下初步提取，脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油形成蒸气，冷凝收集(冷凝温度为-5℃)，提取2小时，分离后得到初提液体和初提残渣，在初提液体中加入初始脐橙果皮总重量为基准的0.40％的纤维素酶和0.01％的果胶酶，再将初提液体加入初提残渣中，在45℃、压力-90kpa、45转/分搅拌条件下再次提取脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油，提取4.5小时，提取结束后将收集到的液体静置分层得到32.3kg的脐橙果皮细胞水和283g的脐橙果皮精油。细胞水无色澄清透明，果香浓郁；精油澄清透明，芳香纯正。
34.实施例5：
35.将50kg脐橙果皮投入150l低温真空提取设备，不加入任何溶剂，在50℃，压力-80kpa、45转/分搅拌下初步提取，脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油形成蒸气，冷凝收集(冷凝温度为-5℃)，提取2小时，分离后得到初提液体和初提残渣，在初提液体中加入初始脐橙果皮总重量为基准的0.35％的纤维素酶和0.04％的果胶酶，再将初提液体加入初提残渣中，在40℃、压力-90kpa、45转/分搅拌条件下再次提取脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油，提取5小时，提取结束后将收集到的液体静置分层得到32.7kg的脐橙果皮细胞水和281g的脐橙果皮精油。细胞水无色澄清透明，果香浓郁；精油澄清透明，芳香纯正。
36.对比例1：
37.将50kg脐橙果皮投入150l低温真空提取设备，不加入任何溶剂，在40℃，压力-90kpa、60转/分搅拌下提取脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油，通过冷凝收集(冷凝温度为-5℃)，提取8小时，结束后将收集到的液体静置分层得到28.1kg的脐橙果皮细胞水和53g的脐橙果皮精油。细胞水和精油均为无色澄清透明，香味较淡。
38.对比例2：
39.将50kg脐橙果皮投入150l低温真空提取设备，加入脐橙果皮总重量为基准的0.32％的纤维素酶和0.04％的果胶酶与5kg水，在50℃下搅拌45分钟，后在40℃，压力-90kpa、60转/分搅拌下提取脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油，通过冷凝收集(冷凝温度为-5℃)，提取8小时，结束后将收集到的液体静置分层得到38.5kg的脐橙果皮细胞水(含有5kg额外添加的水)和227g的脐橙果皮精油。细胞水和精油均为无色澄清透明，香味较淡且具有杂味，香味不纯正。
40.对比例3：
41.将50kg脐橙果皮投入150l提取设备，加入脐橙果皮总重量为基准的0.32％的纤维素酶和0.04％的果胶酶与5kg水，在40℃、常压、45转/分搅拌下提取脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油，提取8小时，分离掉残渣(两次过滤，第一次为离心、第二次为0.22微米滤芯过滤)后静置分层得到36.7kg的脐橙果皮细胞水(含有5kg额外添加的水)和9.6g脐橙果皮精油。细胞水颜色较深并且含有明显异味；精油中也可见少量悬浮有细小的悬浮物，并且有明显异味。
42.各项性能测试方法：
43.1.脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油挥发性活性成分分析：在80℃下进行顶空气质检测。
44.(1)仪器信息：agilent 7980a gc；ms:5975c；50/30μm car/pdms/dvb萃取纤维头，美国supelco公司。
45.(2)gc-ms条件：色谱柱为hp-innowax毛细管柱子(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)；载气为he，流速1ml/min，分离比5:1；进样温度为250℃；升温程序为起始温度为40℃，保持5min，以8℃/min，升至250℃，保持5min。
46.质谱条件：ei电离源，能量70ev；离子源温度230℃，四极杆温度150℃，接口温度250℃，扫描范围30-400m/z。
47.(3)样品前处理：将5ml样品、1g nacl置于20ml顶空瓶中，拧紧瓶盖。于搅拌模式80℃下平衡5min后，用固相微萃取针80℃下萃取5min，然后于进样口解析5min。
48.表1：实施例1的脐橙果皮细胞水的挥发性活性成分分析结果(匹配度和相对含量低的成分不列出)
49.50.51.52.[0053][0054]
表2：实施例1的脐橙果皮精油的挥发性活性成分分析结果(匹配度和相对含量低的成分不列出)
[0055]
[0056]
[0057]
[0058]
[0059][0060]
2.脐橙果皮细胞水防腐挑战测试：将脐橙果皮细胞水，添加到喷雾配方中(见表2)。接种一定数量的细菌和真菌，间隔0天、7天、14天、21天、28天按照美国药典usp32<51>微生物防腐功效测试的检测方法检测微生物数量变化情况。同时做空白对照，将脐橙果皮细胞水替换成去离子水。提供实施例1脐橙果皮细胞水的测试结果，见表3。
[0061]
表2：脐橙果皮细胞水喷雾防腐挑战测试喷雾配方：
[0062]
原料含量丁二醇2.4％甜菜碱0.04％甘草酸二钾0.05％可溶性蛋白多糖0.05％蜂王浆提取物0.05％脐橙果皮细胞水余量柠檬酸调节ph＝6-7
[0063]
表3：实施例1脐橙果皮细胞水防腐挑战测试数据
[0064]
[0065][0066]
由表4数据可知，经过28天水剂配方的喷雾的防腐挑战测试，实施例1中的脐橙果皮细胞水不需添加其他防腐剂14天就通过了防腐挑战测试。说明本发明方法提取得到的脐橙果皮细胞水具有一定的抑菌性。
[0067]
3.脐橙果皮细胞水安全性测试：hacat细胞为人永生表皮细胞系，对hacat细胞的细胞毒性，可作为对皮肤安全性的参考数据。正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质还原为带颜色的结晶状物质，沉积在细胞周围，该变化可通过酶标仪读取od值，通过od值与空白对照组的比较，可以得知细胞的相对生长情况。实施例1脐橙果皮细胞水测试结果见附图1。
[0068]
由图1数据得出，脐橙果皮细胞水对人体表皮细胞基本无毒性。
[0069]
4.黄酮和多糖含量的测试方法：
[0070]
总多糖含量检测方法：苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后醛衍生物与苯酚生成橙黄色化合物，就可以比色法测定。
[0071]
首先制作标准曲线，准确称取葡萄糖50mg于500ml容量瓶中定容，分别吸取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml及1.8ml标准葡萄糖溶液置于各试管中，分别用蒸馏水补至2.0ml，依次加入6％的苯酚溶液1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测吸光度，以2.0ml蒸馏水按同样操作为空白，重复三次。横坐标为多糖含量，纵坐标为吸光度值，绘制标准曲线。
[0072]
取待测样品，配置一定浓度，按照上述操作方法测490nm处吸光度值，根据标准曲线即得相应的糖含量。
[0073]
总黄酮含量检测方法：黄酮母核中含有碱性氧原子,一般又多带酚羟基，能和铝离子产生黄色络合物,又加入亚硝酸钠和氢氧化钠,使在碱性溶液中呈红色，溶液在510nm处有最大吸收，显色反应在60min内稳定。用芦丁作为对照品，用硝酸铝作为黄酮类比色测定的显色剂，吸光度与芦丁的浓度呈线形关系，采用分光光度法对总黄酮进行了含量测定。
[0074]
准确吸取0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml芦丁标准溶液，放入10毫升容量瓶内(写明标记)，分别加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0ml的60％乙醇溶液；再加入5％亚硝酸钠溶液0.5ml
摇匀，放置6min；加入10％硝酸铝溶液0.5ml，放置6min后；加入4％氢氧化钠溶液4.0ml，加60％乙醇定容，摇匀后，放置15min；(扫描找到最大吸收)在510nm处测定吸光度。用0.0ml作为空白，用芦丁含量的浓度作为横坐标，纵坐标作为一定浓度下所对应的吸光度，作标准曲线。
[0075]
吸取待测样品(根据样品的吸光度调整)1.0ml，放入10毫升容量瓶内(写明标记)，用60％乙醇加到2.0ml；加入5％亚硝酸钠溶液0.5ml摇匀，放置6min；加入10％硝酸铝，溶液0.5ml，放置6min后；加入4％氢氧化钠溶液4.0ml，摇匀后，加60％乙醇定容，放置15min；在510nm处测定吸光度。根据标准曲线计算总黄酮的含量。
[0076][0077]
a为标准曲线中的含量。
[0078]
测试结果见表4。
[0079]
实施例和对比例工艺结果分析：
[0080]
表4：实施例1和对比例1～3的脐橙果皮细胞水主要挥发性活性成分表
[0081][0082][0083]
表5：实施例1和对比例1～3的脐橙果皮精油主要挥发性活性成分表
[0084][0085]
综合分析实施例和对比例，本发明通过低温-真空(减压)提取技术与酶解技术的有机结合，同时利用初提细胞液的高渗透性，可提取得到挥发性活性成分组分多和含量高的优质脐橙果皮细胞水和脐橙果皮精油，提取率高。由对比例1可知，仅采用低温真空提取技术，细胞液和精油的提取率低，而且成分较少。由对比例2可知，先加入一定量的酶与水对脐橙果皮进行酶解后，再采用低温真空技术提取，会有酶解过度产生杂味的问题；而且由于水的渗透性差，并且额外加入的5kg水稀释了提取液，导致了得到的精油量少、细胞水香味清淡等缺陷。由对比例3可知，由单一的酶提取法，得到的脐橙果皮细胞水中含有大量的多糖和黄酮以及其它有色杂质，且异味重，挥发性活性成分浓度低，价值不高；且得到的精油量极少。