一种噬菌体及其应用的制作方法

1.本发明属于海洋生命科学技术领域，具体涉及一种以致病弧菌作为宿主的噬菌体。


背景技术：

2.弧菌(vibrio)属于弧菌科(vibrioaceae)，是海洋环境中最常见的细菌类群之一，广泛分布于海洋、近岸河口、海洋生物的体表等位置，是目前研究最多的海洋细菌，从1974年的《伯杰氏细菌学鉴定手册》仅收录5种弧菌到2004年已增至66种。弧菌是一类革兰氏阴性，具有极生鞭毛，能运动，无芽胞和荚膜的短杆状细菌，其中有的弧菌有一定的弯曲，呈弧状或逗点状。弧菌多为兼性厌氧菌，嗜盐，对营养要求不高，在含有nacl的普通蛋白胨水中即可生长，在ph为8.0
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9.0的碱性环境中生长更佳。部分弧菌是各种海洋生物重要致病菌，引起的弧菌病流行面积广，发病率高。目前，已发现的对水产养殖鱼虾类具有致病性的弧菌有十几种，主要是副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌和哈维氏弧菌等，同时，也有部分弧菌对哺乳动物特别是人类具有致病性。溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)属于弧菌科 (vibrionaceae)，弧菌属(vibrio)，革兰氏阴性短杆菌，无芽孢、荚膜，单独存在或尾端相连成“c”或“s”形，为嗜盐嗜温性、兼性厌氧海生弧菌，适宜温度为17～35℃。溶藻弧菌广泛分布于世界各地海水及河口处，并且数量居海水类弧菌之首，但其为嗜温菌，从夏季到冬季，由赤道向两极随着温度的降低其数量也明显减少。另外，溶藻弧菌也大量分布在海洋动物中，如意大利亚德里亚海海域采集的紫贻贝(mytilus galloprovincialis)，其中分离出的溶藻弧菌占弧菌总数的1/3左右。
3.溶藻弧菌为海洋中正常菌群之一，存在于多种海洋动物中，是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌。溶藻弧菌为嗜温菌，其对养殖动物的致病性多发生在夏季，在水温25～32℃下容易流行，另外动物体免疫机能下降或环境恶化时也容易发生，如中国台湾一些学者研究了虾在氨氮(1.10～21.60mg/l)、亚硝氮(1.12～21.40mg/l)、cu
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(1～20mg/l)胁迫下对溶藻弧菌的敏感情况，结果表明虾的免疫力降低、死亡率升高。此外溶藻弧菌对人的致病性也有大量报道，可引起人食物中毒、耳炎等等。
4.溶藻弧菌对宿主致病性主要取决于宿主、宿主所在的环境、菌本身之间的关系，致病过程包括粘附、侵袭、体内增殖及产生毒索等一系列过程，致病作用主要是通过在其侵袭和增殖过程中对机体造成的细胞和组织损伤以及其代谢产物(毒素)干扰和破坏机体的局部或全身的正常新陈代谢或机能而造成的。
5.噬溶藻弧菌噬菌体nf能特异性裂解溶藻弧菌，短时间内迅速降低样本中宿主数量。根据一步生长曲线数据，噬菌体nf的潜伏期仅为30分钟，30分钟后大量噬菌体完成复制，迅速裂解宿主菌，使原本浑浊的宿主菌菌液澄清。
6.目前为止，溶藻弧菌能够使其致病的已见报道的鱼类有很多，黑鲷sparus macrocephlus、大黄鱼pseudosciaena crocea等感染溶藻弧菌病的主要症状表现为：表皮发生溃疡、出血、常有黑斑，眼球凸起、充血，腹部充水肿胀，肾脏发白，脾脏肿大、常有小瘤
伴生，肝脏充血、损伤细菌通过在体内繁殖,产生、释放毒素直接导致细胞和组织损伤,而且还可通过其抗原性诱发免疫反应导致炎症。黄瑞芳等选用42种药物进行药敏试验,仅氨基糖苷类的几种药物对溶藻弧菌有抑制作用,可作为防治石斑鱼弧菌病的首选药物。近几年由于喹诺酮类、硝基呋喃类、四环素类等药物的普遍使用,使弧菌对这些药物产生较大的耐药性,治疗效果均不理想,且这些药物中多数为国家禁用药物。因此，采用药物治疗是暂时的应急措施。
7.溶藻弧菌可引起大量水产动物产生疾病，如其可引起黑鲷表皮溃疡、出血、有黑斑、眼球突出、充血、腹部肿胀、肝脏充血、肾脏苍白和脾脏肿大有小瘤。黄志坚等发现，溶藻弧菌可引起鲑点石斑鱼肌肉尾部溃烂、内脏充血、眼部突出且出血，病鱼一般于发病一周内死亡。溶藻弧菌也可引起大黄鱼弧菌病，其症状表现为病鱼离群、游动缓慢、摄食困难、解剖后肝脏呈现土黄色以及肠道有红点出现。中国明对虾的黑鳃、褐斑综合症、红腿病也是感染溶藻弧菌的表现，日本对虾、斑节对虾的白斑病也可由溶藻弧菌引起，贝类的弧菌病也多由溶藻弧菌引起。
8.国内已有将噬溶藻弧菌应用到预防海参疾病、控制大菱鲆疾病、防控刺身感染的实例。
9.现有技术为使用抗生素进行细菌进行抑制。而使用抗生素及化学消毒剂等传统的治疗方法产生了诸多问题，例如细菌产生耐药性、病原菌传播引发安全问题、养殖水环境微生态失衡、人类生存环境遭受毒害等。
10.而噬菌体作为一种新兴的微生态抗菌剂，因其具有替代抗生素治疗疾病的潜在可能，已受到越来越多的关注。


技术实现要素：

11.本发明的目的之一是提供一种噬菌体，另一目的是提供该噬菌体的具体应用，以弥补现有技术的不足。
12.一种噬菌体，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmcc no.21997；分类命名为：溶藻弧菌长尾噬菌体，保藏日期为2021年3月26日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
13.进一步的，所述噬菌体是一株能够特异性裂解溶藻弧菌的长尾噬菌体，尾部长109
±
1nm，头部约为55nm左右的正二十面体；该噬菌体nf的潜伏期约为30min，裂解期约为90min，裂解量为113pfu/cell；该噬菌体在ph值范围为4和12之间、温度
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20℃到45℃之间能保持活性的相对稳定。
14.更进一步的，所述噬菌体为一株能适应多种环境的烈性噬菌体。
15.进一步的，所述噬菌体能够用于裂解致病弧菌，具体为解藻酸弧菌。
16.更进一步的，该解藻酸弧菌的保藏号为：cgmcc no.22079，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；分类命名为：解藻酸弧菌，保藏日期为2021年3月26日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
17.所述噬菌体的分离方法包括以下步骤：
18.(1)通过0.22μm的海水与过夜培养的细菌混合后，进行双层平板法实验，挑选单个噬菌斑进行纯化，纯化三次后进行富集得到噬菌体悬浮液；
19.(2)纯化后效价达到10
10
‑
11
pfu/ml的噬菌体原液，取20ul滴于铜网上，待其自然沉淀15min，加1滴2％磷钨酸(pta)于铜网上，染色10min，干燥后用透射电子显微镜观察；经透射电子显微镜观察，此噬菌体为长尾噬菌体。
20.所述噬菌体能够用于致病弧菌的药物制备中，尤其是解藻酸弧菌引起的病症的药物制备中。
21.另外，所述的噬菌体在较大ph范围及温度跨度下都能保持活性，说明了其能在不同环境中裂解致病菌，起到抗菌效果。
22.本发明的优点和技术效果：
23.本发明提供的噬菌体特异性强，有较强的环境适应能力，能够应用于由致病弧菌导致的疾病中。本发明提供的噬菌体在治疗水产动物细菌性疾病方面有很大的优势：(1)不破坏正常菌群，有很强的特异性，只针对相对应的病原菌；(2)不会引起细菌耐药性，绿色环保； (3)可依靠宿主菌增殖，一次给药可达到其它抗菌药物多次给药的效果；(4)在机体内停留时间短，代谢快；(5)研发生产时间短；(6)不易引起细菌抗性。
24.本发明提供的噬菌体在防治水产动物由细菌引起的感染方面有着绝对优势，是抗生素以及其它抗菌药物无法比拟的。
附图说明
25.图1为本发明中噬菌体的显微镜观察图。
26.图2为本发明中噬菌体的生长曲线图。
27.图3为噬菌体在不同ph下的活性对比图。
28.图4为噬菌体在不同温度下的活性对比图。
具体实施方式
29.以下通过具体实施例并结合附图对本发明进一步解释和说明。
30.实施例1：
31.一种噬菌体的分离方法包括以下步骤：
32.(1)通过0.22μm的海水与过夜培养的细菌混合后，进行双层平板法实验。挑选单个噬菌斑进行纯化，纯化三次后进行富集得到噬菌体悬浮液。
33.(2)纯化后效价达到10
10
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11
pfu/ml的噬菌体原液，取20ul滴于铜网上，待其自然沉淀15min，加1滴2％磷钨酸(pta)于铜网上，染色10min，干燥后用透射电子显微镜观察 (如图1所示)，经透射电子显微镜观察，此噬菌体为长尾噬菌体。
34.生长特性实验
35.加入感染复数为0.01的噬菌体及其宿主菌各1ml。混匀，使其侵染1min。侵染完毕之后，用离心机13000g离心30秒，使用微量取液器将上清小心吸去，再用1ml液体培养基将沉淀重悬冲洗2次(13000g离心30sec)，弃上清。将重悬液吸入50ml液体培养基中，摇匀，置于28℃摇床中进行振荡培养，在0时刻和每隔15min取出，吸取悬液使用双层平板法测定噬菌体滴度。
36.将感染时间作为横坐标，测得的不同时间的噬菌体的滴度的对数为纵坐标，绘制一步生长曲线。图2为噬菌体的生长曲线图，可以得出潜伏期、爆发期和爆发量。由此得知，
噬菌体nf的潜伏期为30分钟，裂解量为113pfu/cell。
37.实施例2：噬菌体稳定性实验
38.(1)ph稳定性
39.为测定噬菌体的ph稳定性，100μl噬菌体液与900μl不同ph值的培养基(3.0，4.0， 5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0)进行混合处理。混合好的培养基25℃水浴一小时。处理过的噬菌体液用双层平板法进行仍存活的噬菌体的计数。
40.如图3所示，实验结果显示，噬菌体nf在ph值范围为4和12之间是较为稳定的。
41.(2)热稳定性
42.将噬菌体液在不同温度下进行水浴处理(
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20℃，0℃，25℃，35℃，45℃，55℃，65℃， 75℃)。处理一小时后，用双层平板法测定其存活的噬菌体的数量。
43.本实验对噬菌体在ph为7环境下的热稳定性进行了分析。如图4所示，该噬菌体效价在温度
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20℃到45℃之间没有显著差异。在45℃～75℃，存活的噬菌体逐渐减少。
44.噬菌体作为一种新兴的微生态抗菌剂，因其具有替代抗生素治疗疾病的潜在可能，已受到越来越多的关注。许多研究表明，噬菌体用于治疗弧菌病取得了良好效果。近几年由于喹诺酮类、硝基呋喃类、四环素类等药物的普遍使用,使弧菌对这些药物产生较大的耐药性,治疗效果均不理想,且这些药物中多数为国家禁用药物。采用药物治疗是暂时的应急措施，而使用噬菌体作为灭菌手段不会产生耐药性及生态污染，是抑制致病菌的潜在高效手段。