癌细胞耐药性的标志物、逆转癌细胞耐药性的制剂组合及其应用的制作方法

1.本发明涉及肿瘤学技术领域，尤其涉及一种癌细胞耐药性的标志物、 逆转癌细胞耐药性的制剂组合及其应用。


背景技术：

2.多腺苷二磷酸核糖聚合酶(parp)抑制剂是一种能够影响癌细胞的 自我复制方式的医学用药，其可以与其他乳腺癌药物共同发挥抗癌作用， 此种药物还可以治疗卵巢癌、前列腺癌以及胰腺癌等拥有相同“流氓基 因”"的遗传性癌症；其还能够作为改善卵巢癌患者预后并应用于临床治 疗的新型分子靶向药物。
3.parp抑制剂主要通过作用于具有同源重组修复基因缺陷的肿瘤细 胞，导致其dna损伤不能修复从而引发dna损伤积累并最终导致细胞 死亡。全基因组分析表明，同源重组修复缺陷是高级别浆液性卵巢癌的 普遍特征，也因此大约50％的卵巢癌患者可能受益于parp抑制剂。目 前，奥拉帕尼(parp抑制剂之一)的已被批准用于铂敏感复发和brca1/2 突变卵巢癌患者的一线维持治疗，尼拉帕尼(parp抑制剂之一)也被批 准用于同源重组缺陷阳性的进展性卵巢癌。
4.尽管parp抑制剂在卵巢癌治疗中逐渐应用，但随之而来的耐药也 是影响其进一步改善患者预后的主要障碍，parp抑制剂的耐药性可能归 因于肿瘤细胞自身的继发性遗传事件或表观遗传事件。因此，研究parp 抑制剂造成肿瘤细胞耐药的机制对于提升parp抑制剂抗肿瘤效果是非 常有必要的。


技术实现要素：

5.parp抑制剂杀伤癌细胞的同时，有可能通过对肿瘤微环境中其他细 胞成分产生“副作用”导致肿瘤的进展和耐药。卵巢癌作为一类间质丰 富的肿瘤，现有技术关于其间质微环境对parp抑制剂的反应及其对治 疗效果的潜在影响研究却十分有限。有鉴于此，本发明的目的在于发现 parp抑制剂在卵巢癌间质微环境中的作用以及其与耐药的潜在关系，进 而对应开发提升parp抑制剂抗肿瘤效果、改善或逆转此种耐药的制剂 或药物。
6.为实现上述发明的目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明第一方面提供一种评价由parp抑制剂引起癌细胞耐药性的 标志物，所述标志物包括癌相关成纤维细胞的ccl5趋化因子及其编码 的基因，所述ccl5趋化因子的表达水平与癌细胞耐药性成正相关。
8.上述技术方案中，由所述parp抑制剂引起的癌细胞耐药性表现为 对癌细胞相关成纤维细胞的活化作用。
9.上述技术方案中，所述parp抑制剂对癌细胞相关成纤维细胞的活 化作用是通过活化nf
‑
κb信号，上调细胞间质中ccl5的表达得以实现。
10.本发明第二方面提供一种逆转癌细胞耐药性的制剂组合，包括抑制 癌细胞复制
的parp抑制剂和用于调节所述parp引起的癌细胞耐药性的 逆转剂；所述逆转剂包括下调癌相关成纤维细胞ccl5表达的调节剂、 ccl5的中和抗体和nf
‑
κb信号抑制剂中的至少一种。
11.上述技术方案中，所述下调ccl5表达的调节剂包括ccl5
‑
sirna、 ccl5
‑
shrna、非特异性下调ccl5的药物和ccl5受体ccr5抑制剂中 至少一种；所述ccl5的中和抗体包括小鼠抗人ccl5/rantes单克隆 抗体、兔抗人ccl5/rantes多克隆抗体和羊抗人ccl5/rantes多克 隆抗体中的至少一种；nf
‑
κb信号抑制剂包括抗氧化类抑制剂、 ikkα/ikkβ抑制剂、tbk1/ikdkε抑制剂、rel蛋白家族抑制剂、iκb家 族抑制剂以及新型抑制剂中的至少一种。
12.上述技术方案中，所述parp抑制剂包括奥拉帕尼、尼拉帕尼、瑞 卡帕布、他拉唑帕尼、ag14361、戈瓦替尼、依尼帕尼、替凡替尼和福 来替尼中的至少一种。
13.上述技术方案中，所述癌细胞包括卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、前列 腺癌细胞以及胰腺癌细胞中的至少一种。
14.上述技术方案中，所述parp抑制剂和所述调节剂可同时给药。
15.上述技术方案中，所述制剂组合被用于抗癌疗法。
16.本发明第三方面所述的制剂组合在制备抗肿瘤药物中的应用。
17.本发明创造性发现parp抑制剂通过活化nf
‑
κb信号通路上调ccl5 进而活化卵巢癌肿瘤相关成纤维细胞(cafs)，进而促进肿瘤对parp 抑制剂耐药；采用下调ccl5表达相关调节剂、ccl5中和抗体和/或靶 向nf
‑
κb逆转parp抑制剂诱导的cafs活化作用，抑制parp抑制剂 引起的癌细胞耐药性耐药作用，提升parp抑制剂杀伤癌细胞的效果。
附图说明
18.图1为本发明实施例1提供的parp抑制剂对卵巢癌细胞及cafs 的耐受性或敏感性相关图；图1a表示奥拉帕尼分别对不同卵巢癌细胞及 cafs的ic50图；图1b表示尼拉帕尼分别对不同卵巢癌细胞及cafs的 ic50图。
19.图2为本发明实施例2提供的parp抑制剂对卵巢cafs的分子活化 影响图；图2a表示奥拉帕尼分别对卵巢cafs的一些细胞因子的编码相 关基因mrna上调图；图2b表示尼拉帕尼分别对卵巢cafs的一些细胞 因子的编码相关基因mrna上调图；图2c表示奥拉帕尼和尼拉帕尼分别 对不同卵巢cafs中骨架蛋白α
‑
sma和gapdh蛋白的表达电泳图；图 2d表示奥拉帕尼和尼拉帕尼分别对cafs和mrc5
‑
cafs作用的荧光染 色图；图2e表示奥拉帕尼对不同卵巢cafs的胶原收缩凝胶摄影图；图 2f表示奥拉帕尼对不同卵巢cafs的胶原收缩比例结果图；图2f表示尼 拉帕尼对不同卵巢cafs的胶原收缩比例结果图；。
20.图3为本发明实施例3提供的parp抑制剂处理的小鼠皮下瘤组织 的影响图；图3a为奥拉帕尼和尼拉帕尼分别处理brca野生型和突变型 小鼠皮下瘤组织的处理流程示意图；图3b为奥拉帕尼和尼拉帕尼分别处 理不同小鼠皮下瘤组织的肿瘤比较结果图；图3c为奥拉帕尼处理skov3 型小鼠皮下瘤组织中的α
‑
sma表达的切片图；图3d奥拉帕尼和尼拉帕 尼分别处理不同小鼠皮下瘤组织的肿瘤的α
‑
sma表达情况图。
21.图4为本发明实施例4提供的parp抑制剂活化卵巢癌cafs的细胞 因子影响图；图4a表示奥拉帕尼和尼拉帕尼分别处理mrc5
‑
cafs的细 胞因子芯片检测图；图4b表示奥拉帕尼和尼拉帕尼分别处理mrc5
‑
cafs 的细胞因子芯片检测结果图；图4c表示奥拉帕尼和尼拉
帕尼分别处理 mrc5
‑
cafs的细胞因子芯片检测结果比较示意图；图4d表示奥拉帕尼 和尼拉帕尼分别处理cafs的细胞因子rna
‑
seq图；图4e表示奥拉帕尼 和尼拉帕尼分别处理cafs的ccl5表达量的rt
‑
pcr结果图；图4f表 示奥拉帕尼和尼拉帕尼分别处理cafs的ccl5表达量的elisa结果图； 图4g
‑
j分别表示表示奥拉帕尼和尼拉帕尼分别处理不同类型cafs的 ccl5表达量的免疫组化结果图。
22.图5表示本发明实施例5提供的ccl5中和抗体与卵巢癌cafs的体 外实验结果图；图5a对于原代cafs给予不同ccl5浓度梯度处理的关 于骨架蛋白α
‑
sma和gapdh蛋白表达情况图；图5b表示给予 mrc5
‑
cafs ccl5中和抗体后的细胞应该染色图；图5c表示给予 mrc5
‑
cafs ccl5中和抗体后的胶原收缩凝胶摄影图。
23.图6表示本发明实施例5提供的ccl5中和抗体与卵巢癌cafs的动 物实验结果图；图6d表示同时给予ccl5中和抗体及奥拉帕尼和尼拉帕 尼对于不同类型肿瘤组织重量结果图；图6e表示同时给予ccl5中和抗 体及奥拉帕尼和尼拉帕尼对于不同类型肿瘤组织体积结果图。
24.图7表示本发明实施例5提供的ccl5中和抗体与卵巢癌cafs的动 物实验结果图；图7f
‑
i表示ccl5中和抗体及奥拉帕尼和尼拉帕尼对于 不同肿瘤细组织间质的染色图。
25.图8表示本发明实施例6提供的parp诱导cafs的ccl5升高和 cafs活化的上游机制图；图8a表示parp抑制剂处理对nf
‑
κb信号的 影响结果的gsea图；图8b表示奥拉帕尼对不同cafs的处理荧光素报 告结果图。
26.图9表示本发明实施例6提供的parp抑制剂诱导cafs活化对肿瘤 间质p
‑
p65表达相关结果图；图9c表示奥拉帕尼对skov3肿瘤间质的 影响切片图；图9d为表示奥拉帕尼对skov3肿瘤间质p
‑
p65的影响免 疫组化结果图；图9e表示尼拉帕尼对skov3肿瘤间质的影响切片图； 图9f为表示尼拉帕尼对skov3肿瘤间质p
‑
p65的影响免疫组化结果图。
27.图10表示本发明实施例6提供的parp抑制剂及其nf
‑
κb通路 抑制剂bay117082共同作用对cafs中相关蛋白表达的western结果 图；图10g为奥拉帕尼对cafs细胞中p
‑
p65、p65和gapdh蛋白 表达结果图；图10h为尼拉帕尼对cafs细胞中p
‑
p65、p65和gapdh 蛋白表达结果图；图10i为奥拉帕尼和bay117082同时作用对cafs 细胞中p
‑
p65、p65、ccl5、αsma、gadph蛋白表达结果图；图为尼拉帕尼和bay117082同时作用对cafs细胞中p
‑
p65、p65、 ccl5、α
‑
sma、gadph蛋白表达结果图。图10g
‑
h中“ ”表示给予 ola或nira，“－”表示未给予；图10i
‑
j中“ ”表示给予ola、nira或 bay117082，“－”表示未给予。
28.图11为本发明实施例6提供的parp抑制剂与其nf
‑
κb通路抑制剂 bay117082共同作用诱导cafs活化对肿瘤间质p
‑
p65表达的elisa结 果图；图11k为elisa检测奥拉帕尼及其与bay117082同时给予对cafs 分泌ccl5的影响；图11l为elisa检测尼拉帕尼及其与bay117082同 时给予对cafs分泌ccl5的影响；图11m为胶原回缩实验检测奥拉帕 尼及其与bay117082同时给予对cafs收缩胶原能力(代表cafs活化 相关骨架蛋白的功能)的影响；图11n为胶原回缩实验检测尼拉帕尼及 其与bay117082给予对cafs收缩胶原能力(代表cafs活化相关骨架 蛋白的功能)的影响。
29.图12为本发明实施例7提供的临床验证parp抑制剂与卵巢癌间质 cafs的关系；图12a为免疫组化检测使用奥拉帕尼前后的卵巢癌患者配 对癌组织临床标本中α
‑
sma表达情况；图12b为奥拉帕尼前后的卵巢癌 患者配对癌组织临床标本中α
‑
sma表达阳性区域的定
量分析；图 12cmasson’s染色显示奥拉帕尼处理前后的卵巢癌患者配对癌组织临床标 本中间质成分；图12d为奥拉帕尼处理前后的卵巢癌患者配对癌组织临 床标本中ccl5表达情况及定量分析；图12e奥拉帕尼处理前后的卵巢 癌患者配对癌组织临床标本中p
‑
p65表达情况及定量分析；图12f为奥拉 帕尼使用前后卵巢癌患者标本中ccl5与α
‑
sma表达的相关性分析；图 12g为奥拉帕尼使用前后卵巢癌患者标本中ccl5与p
‑
p65表达的相关性 分析。
具体实施方式
30.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实 施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施 例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
31.研究表明，肿瘤微环境，尤其是以癌细胞相关成纤维细胞(cafs， cancer
‑
associated fibroblasts)为代表的肿瘤间质成分在肿瘤的治疗耐药中 起到重要作用，其通过与癌细胞的直接接触、分泌多种因子以及对肿瘤 基质的改造，促进肿瘤的发生、发展、转移甚至耐药性的发生。因此， 本发明实施例提供了一种评价由parp抑制剂引起癌细胞耐药性的标志 物，所述标志物包括癌相关成纤维细胞的ccl5趋化因子及其编码的基 因，所述ccl5趋化因子的表达水平与癌细胞耐药性成正相关。由此， 能够通过对cafs中ccl5趋化因子的表达情况进行检测和分析，如通过 rt
‑
pcr检测其mrna表达量，以此分析cafs中ccl5趋化因子的表达 情况，进而评估癌细胞耐药性情况。
32.其中，趋化因子是一类具有趋化吸引活性的小分子分别蛋白家族， 根据其一级结构中的氨基端2个残基位置分布不同可分为四大类：cxc、 cc、c以及cx3c，ccl5是cc类其中一种。ccl5为分子量为8kd的 小分子蛋白，由68个氨基酸组成，是一类调节正常t细胞表达和分泌的 细胞因子，又称为活化t细胞表达和分泌的。
33.其中，parp抑制剂引起的癌细胞耐药性表现为对癌细胞相关成纤维 细胞的活化作用。具体的，parp抑制剂对癌细胞相关成纤维细胞的活化 作用是通过活化nf
‑
κb信号，上调细胞间质中ccl5的表达得以实现。
34.本发明实施例还提供一种逆转或改善上述这种癌细胞耐药性的的制 剂组合，包括抑制癌细胞复制的parp抑制剂和用于调节所述parp引起 的癌细胞耐药性的逆转剂；所述逆转剂包括下调癌相关成纤维细胞的ccl5表达的调节剂、ccl5的中和抗体和nf
‑
κb信号抑制剂中的至少一 种。上述实施方式中，下调ccl5表达的调节剂包括ccl5
‑
sirna、 ccl5
‑
shrna、非特异性下调ccl5的药物和ccl5受体ccr5抑制剂中 至少一种；ccl5的中和抗体包括小鼠抗人ccl5/rantes单克隆抗体和 兔抗人ccl5/rantes多克隆抗体中的至少一种；nf
‑
κb信号抑制剂包 括抗氧化类抑制剂、ikkα/ikkβ抑制剂、tbk1/ikdkε抑制剂、rel蛋白 家族抑制剂、iκb家族抑制剂以及新型抑制剂中的至少一种。
35.其中，ccl5
‑
sirna和ccl5
‑
shrna用于对ccl5的转录过程进行 干扰和阻断，进而下调ccl5的表达。例如，可通过合成特异性 ccl5
‑
sirna分子(针对cafs)，并将其克隆至慢病毒表达载体 pgcsil
‑
gfp，再将重组ccl5
‑
sirna感染至cafs中，如此能够下调 cafs的ccl5表达，进而抑制cafs的活化作用，改善或者逆转癌细胞 的间质微环境，降低其对于parp抑制剂的耐药性。
36.其中，非特异性下调ccl5的药物具体如唑来膦酸(zoledronic acid， 如诺华公
司)、曲贝替定(trabectedin，如西班牙zeltia公司和美国琼森 公司)。
37.其中，ccl5受体ccr5的抑制剂具体如马拉维若(maraviroc，如美 国abmole)、vicriviroc(如chemegen公司)、bms
‑
813160(abmole 公司)和ccr5中和抗体leronlimab(范德生物科技公司)；
38.其中，ccl5的中和抗体包括小鼠抗人ccl5/rantes单克隆抗 (lsbio公司，货号ls
‑
c104450)体、兔抗人ccl5/rantes多克隆抗 体(lsbio公司，货号ls
‑
c9919)和羊抗人ccl5/rantes多克隆抗体 (af
‑
278
‑
na，r&d systems公司)中的至少一种。
39.nf
‑
κb信号抑制剂包括抗氧化类抑制剂、ikkα/ikkβ抑制剂、 tbk1/ikdkε抑制剂、rel蛋白家族抑制剂、iκb家族抑制剂以及新型 抑制剂中的至少一种。
40.其中，抗氧化类抑制剂举例如姜黄色素、二苄基丁内酯、槲皮黄酮、 n
‑
乙酰半胱氨酸。
41.其中，ikkα/ikkβ抑制剂举例如新型atp
‑
可逆转抑制剂sar母体 (结构式如)、bms
‑
34551(apexbio公司)、e6070 (medchemexpress公司)、sc
‑
514(美国abmole公司)、噻吩甲酰胺 类抑制剂(霍夫曼
‑
拉罗奇有限公司)、chs
‑
828(一种烟酰胺磷酸核糖 基转移酶抑制剂，别名gmx1778，medchemexpress公司)、eb
‑
1627 (gmx1778的前药，medchemexpress公司)、bay117082(selleck公 司)、6,8
‑
双取代基异喹啉、noraristeromycin(5h
‑
吡啶并(4,3
‑
b)吲哚
‑3‑ꢀ
胺,1
‑
甲基
‑
,乙酸酯)、二氢杨梅素。
42.其中，tbk1/ikdkε抑制剂举例如bx795、bx320。
43.其中，rel蛋白家族抑制剂举例如雷洛萨芬、硼替佐米、甲基巴多索 隆(bardoxolone methyl，美国adooq公司)、pdtc、苯基氮杂环丙烷 构成的混合物a(cpda)。
44.具体的实施方式中，parp抑制剂包括奥拉帕尼(olaparib)、维利 帕尼(veliparib)、尼拉帕尼(niraparib)、瑞卡帕布(rucaparib)、他拉唑帕尼 (talzenna)、ag14361(2
‑
[4
‑
[(二甲基氨基)甲基]苯基]
‑
5,6
‑
二氢咪唑并 [4,5,1
‑
jk][1,4]苯并二氮杂卓
‑
7(4h)
‑
酮)、戈瓦替尼(golvatinib)、依尼帕 尼(iniparib)、替凡替尼(tivantinib)和福来替尼(foretinib)中的至 少一种。
[0045]
具体的实施方式中，肿瘤细胞包括卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、前列 腺癌细胞以及胰腺癌细胞中的至少一种。
[0046]
具体的实施方式中，parp抑制剂和所述调节剂可同时给药。
[0047]
具体的实施方式中，制剂组合被用于抗癌疗法，所述抗癌疗法进一 步包括给予患者基于parp抑制剂的疗法。本发明实施例还提供了一种 上述实施例中的制剂组合在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0048]
下方结合具体实施例和实验加以验证parp抑制剂对肿瘤细胞相关 成纤维细胞的活化作用，以及对应的调节剂对提升parp抑制剂抗肿瘤 的效果。下述实施例和实验例中若无特殊说明，其中使用的试剂和设备 均为商业化产品。
[0049]
实验方法
[0050]
实验例1 卵巢癌细胞系培养
[0051]
卵巢癌细胞系及培养基：ov90、ovcar3、a2780、ovcar8和 skov3(均购于美国atcc
公司)均在mccoy's 5a培养基(美国gibco 公司)中培养，hcc1937和sw626在l15(美国gibco公司)培养基中 培养，mrc5在mem(美国gibco公司)培养基中培养。
[0052]
上述所有生长培养基均添加有1％青霉素/链霉素混合物、以及10％ 胎牛血清混合。细胞均为贴壁生长状态，且均被培养在37℃、含5％co2的培养箱中。
[0053]
实验例2 人卵巢癌相关成纤维细胞(cafs)的分离与纯化
[0054]
取10g新鲜卵巢癌组织(收集自华中科技大学同济医学院附属同济 医院妇产科)，用生理盐水冲洗3次，在细胞工作台无菌条件下将组织 剪碎至1mm3大小。将剪碎的组织块转移50ml无菌离心管，加入20ml 组织消化液，在37℃摇床中消化2
‑
4h。组织消化液由无血清dmem/f12 (赛默飞公司)培养基配成，内含终浓度1μg/ml的i型胶原酶(sigma 公司)、终浓度1μg/ml的i型dnaase(roche公司)、1％青霉素/链霉 素混合物。至组织块明显缩小、消化液变浑浊时终止消化，1000rpm常 温离心5min去上清。无菌条件下加入20ml红细胞裂解液，裂解10min 后离心去上清；无菌条件下加入适量pbs清洗剩余细胞，离心去上清。 根据所得细胞量加入适量dmem/f12完全培养基重悬细胞，后转移至无 菌培养瓶中培养，培养瓶置于湿度95％、温度37℃、含5％co2的培养 箱。当分离培养的细胞达到80％以上融合度后，适量无菌pbs润洗细胞 两遍。加入适量胰酶后，立即拿至显微镜下观察细胞形态变化，由于成 纤维细胞对胰酶较敏感，故镜下可见成纤维细胞先于肿瘤细胞被消化下 来(大约1min)，即可得到cafs细胞。立即吸取1/2消化液传至另一 培养瓶，加入适量完全培养基继续培养。每次传代培养均采用此梯度消 化法，大约传代3
‑
4次至成纤维细胞纯度达95％以上即可用于后续实验。
[0055]
mrc5诱导的cafs的培养过程说明：将mrc5用mem培养的 skov3培养液上清按照1:1比例混合诱导培养7
‑
10天，即得 mrc5
‑
cafs。
[0056]
实验例3 药物敏感性测定
[0057]
分别用胰酶消化实验例2中值制得的cafs细胞和mrc5
‑
cafs制备 单细胞悬浮液，将细胞以每孔1
×
104个的密度接种到无菌96孔板中。
[0058]
24h后，使用含有奥拉帕尼或尼拉帕尼的培养基溶液对孔板进行换 液。48h后，pbs润洗细胞，每孔加入100μl含10％cck
‑
8的无血清培 养基(美国gibco公司)。避光纸包裹96孔板以避光，放入培养箱孵育 2h后，用酶标仪(bio
‑
rad laboratories)测量每个孔在450nm波长处的 吸光度。细胞活性的计算如下：细胞活性(％)＝(药物组
‑
空白孔)od450/ (无药物组
‑
空白孔)od450
×
100％。每个处理设三个副孔。细胞活性越 低，说明对应的孔板中细胞对药物的敏感性越高。
[0059]
实验例4 动物实验
[0060]
此实验为研究parp抑制剂对癌细胞间质的作用及其耐药机制。
[0061]
balb/c裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)(体重20
‑
23g， 4
‑
6周)，并在无特定病原体的房间中于层流柜中培养，用作肿瘤异种移 植模型，动物实验由湖北省动物实验伦理委员会批准。将所有裸鼠分组 分别皮下注射brca基因野生型癌细胞：skov3、ovcar8、ov90和 brca1；突变型癌细胞hcc1937(“brca1 null”表示brca1基因缺 失的突变)，均按照2
×
106个细胞/只注射裸鼠(参见图3a)。
[0062]
接种后第8天，将小鼠随机分为给药组、处理组和对照组。对于处 理组，给小鼠腹腔内注射奥拉帕尼或尼拉帕尼(50mg/kg/天)。对照组 小鼠腹腔内注射等体积的含1％dmso
的生理盐水。给药组，给予小鼠 腹腔内注射奥拉帕尼或尼拉帕尼(50mg/kg/天)；或者给予小鼠腹腔内 注射奥拉帕尼(50mg/kg/天)和ccl5中和抗体(250ng/kg/天，af
‑
278
‑
na 多抗)的联合处理。
[0063]
皮下注射细胞后第36天(即分组处理后第28天)，将所有小鼠人 道地处死。记录肉眼可见的肿瘤病灶，解剖肿瘤组织块、称重并用石蜡 包埋以供随后检测。
[0064]
实施例5 western检测蛋白表达
[0065]
将实验例2制得的原代cafs和mrc5
‑
cafs分别用olaparib、 niraparib、ccl5中和抗体或bay117082处理48h，加入100μl含有蛋 白酶抑制剂的ripa裂解液冰上裂解30min。加入蛋白上样缓冲液混匀后 用bca试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白样置于100℃煮沸5分钟。利用 10％sds
‑
page凝胶进行电泳，pvdf膜进行转膜，随后用含有5％bsa 的tbst溶液室温封闭1小时。根据目的蛋白分子量的不同，将膜剪切 为若干条，分别与一抗在4℃孵育过夜。次日条带复温后用tbst充分洗 涤5次，每次5min，室温与相应二抗孵育1小时。随后tbst漂洗5次， 每次5min，即可用ecl显影液显色。bio
‑
rad曝光仪用于采集摄片。
[0066]
实验例6 免疫组化
[0067]
将福尔马林固定和石蜡包埋过的人卵巢癌组织(来源于实验例2和 实验例4)进行连续切片。石蜡切片在65
‑
68℃加热2小时后，立即置于 环保脱蜡液中脱蜡，随后利用四种不同浓度的乙醇溶液进行递进式补水。 组化pbs洗涤3次后，将切片置于抗原修复液中加热30min，自然冷却 至室温。利用3％h2o2消耗内源性过氧化物酶，并在37℃下用5％bsa 封闭30min。加入一抗α
‑
sma(1:200)，ccl5(1:200)，p
‑
p65(1:200) 4℃孵育过夜。第二天与相应的hrp二抗反应后，使用dab进行显色。 随后用苏木素染核，并在显微镜下观察并进行免疫组织化学评分。
[0068]
实验例7 天狼猩红染色和masson’s染色
[0069]
1、天狼猩红染色：将实验例6中的石蜡切片在65
‑
68℃加热2小时 后，立即置于环保脱蜡液中脱蜡，随后利用四种不同浓度的乙醇溶液进 行递进式补水。用天狼猩红染液(武汉赛维尔公司)孵育15min。无水乙醇 洗涤两遍，通风橱干燥，后用中性树脂封片。
[0070]
2、masson’s染色：将实验例6中的石蜡切片在65
‑
68℃加热2小时 后，立即置于环保脱蜡液中脱蜡，随后利用四种不同浓度的乙醇溶液进 行递进式补水。25％重铬酸钾常温媒染过夜(12
‑
18h)。流水冲洗8min， 至黄色消失。a液：b液按1：1配制的铁苏木素(现配现用)染液染色 3
‑
5min。流水洗，必要时盐酸酒精分化并再次流水洗。丽春红酸性复红 液染色5
‑
8min，蒸馏水快速冲洗(此步骤后，尽量不接触水)。磷钼酸 水溶液分化3min。甩掉磷钼酸，苯胺蓝染色5min，2％冰醋酸水溶液 分化苯胺蓝1s。脱水，置于通风橱中干燥，后用中性树脂封片。
[0071]
实验例8 cafs中mrna提取和rt
‑
pcr检测
[0072]
利用fastpure细胞/组织总rna分离试剂盒(中国诺唯赞生物科技 股份有限公司)提取cafs细胞中mrna；使用hiscript ii q rt supermix for qpcr试剂盒(中国诺唯赞生物科技股份有限公司)进行逆转录合成 cdna；使用chamq universal sybr qpcr master mix(中国诺唯赞生物 科技股份有限公司)进行rt
‑
pcr检测，以检测ccl5的表达量。
[0073]
实验例9 酶联免疫吸附实验(elisa)检测cafs中ccl5
[0074]
根据制造商的介绍，使用elisa试剂盒(r&d systems公司)测量 每种cafs培养物
上清液中ccl5的浓度。用酶标仪(bio
‑
radlaboratories)测量450nm处的吸光度。每次测量重复三次。
[0075]
实验例10 胶原蛋白凝胶收缩测定
[0076]
使用体外漂浮的胶原蛋白基质收缩模型来确定实cafs细胞的收缩 能力。每200μl包含：100μl dmem/f
‑
12培养基(赛默飞公司)，种植 6
×
104个cafs细胞、68.75μl dmem/f
‑
12培养基、31.25μl i型大鼠尾胶 原(赛默飞公司)、0.72μl 1n naoh。将200μl的该混合物加到96孔超 低粘附板(corning life sciences公司，corning，ny)的每个孔中，放 于37℃培养箱中孵育。在cafs细胞种植后12
‑
24h拍摄凝胶图像，并 使用imagej软件确定计算收缩面积。每个处理设置3个副孔。
[0077]
实施例11 nf
‑
κb荧光素酶报告系统实验
[0078]
常规在六孔板中种适量待转染的cafs细胞，待细胞贴壁且达到大约 60％融合度时进行转染。每个孔大约转染2μg报告质粒，将2μg报告质 粒加入到装有125μl opti
‑
mem的ep管中，轻轻搔刮使其混匀；将1μl 促转染试剂(x
‑
treme gene hp dna trasnfection reagent，roche)加入 到装有125μl opti
‑
mem的ep管中，轻轻搔刮使其混匀。将混有促转染 试剂的opti
‑
mem加入到混有质粒的opti
‑
mem中，轻柔吹打使其混匀， 常温孵育15min。孵育期间，对六孔板进行换液，每孔加入1.75ml完全 培养基。15min后，将孵育好的液体加入六孔板；轻轻摇晃孔板，使六 孔板内液体混匀，将六孔板放回培养箱。转染24h后，将孔内培养基更 换为新鲜完全培养基，并在相应孔中加入parp抑制剂进行处理，继续 放入培养箱培养。72h后，取出六孔板，按照荧光色酶检测试剂盒说明书 对nf
‑
κb活性检测。
[0079]
实验例12 rna
‑
seq分析
[0080]
用dmso、20μm的尼拉帕尼、30μm的奥拉帕尼各自处理cafs， 72h后用适量trizol收取细胞。细胞提取总rna，送测序公司利用 illumina novaseq6000测序平台完成测序。根据|log2ratio|≥1和q<0.05 差异标准，采用deseq进行差异基因筛选。使用基于web的基因集分析 工具包(webgestalt)(http://www.webgestalt.org/)进行gene ontology(go) 分析和kyoto encyclopedia of genes and genomes(kegg)分析。gsea 是使用来自broad institute的gsea 2.2.2软件进行的。
[0081]
实验例13 细胞因子芯片检测
[0082]
将原代cafs种于6cm培养皿，用30μm奥拉帕尼或20μm尼拉 帕尼预处理72h。用pbs洗涤3次后，加入无血清培养基3ml，常规培 养箱中孵育24h。将上清收于4ml无菌ep管中，常温3000rpm离心10 min，并将最终上清转至新的ep管中。对留在培养皿上的细胞进行计数 以标准化条件培养基，用无血清培养基稀释至相当于每1
×
106细胞产生1 ml条件培养基的浓度。按照锐博生物细胞因子芯片试剂盒采用夹心法进 行细胞因子panel检测。
[0083]
实验结果
[0084]
实施例1 parp抑制剂对卵巢癌细胞及cafs的耐受性或敏感性
[0085]
为了研究癌细胞(包括hcc1937乳腺癌细胞系、sw626、ovcar8、 skov3、a2780、ovcar3和ov90均为卵巢癌细胞系)及cafs在对 parp抑制剂的反应性，根据实验例3的方法，将卵巢癌肿瘤细胞、原代 cafs及mrc5诱
‑
cafs分别以不同浓度的奥拉帕尼(olaprib)和尼拉帕尼(niraparib)处理48小时，测定ic50。结果表明，总体上cafs相对于癌细 胞，分别对奥拉帕尼和尼拉帕尼的敏感性更差，耐受性更强(图1a,b)。
[0086]
实施例2 parp抑制剂对卵巢cafs的活化(分子水平)
[0087]
根据实验例8和实验例12的方法，将olaparib和niraparib处理的原 代cafs和mrc5
‑
cafs(实验例2中所得)进行rna
‑
seq测序发现，parp 抑制剂能够显著上调cafs中acta2等活化相关基因的mrna水平(图 2a,b)，进一步的蛋白水平检测(实验例9的方法)和胶回缩功能试验(实 验例10的方法)也证明了cafs活化相关的骨架蛋白α
‑
sma显著升高(图 2c，d)，胶原收缩能力增强(图2e
‑
g)。这些分子水平的结果表明，体外条 件下，parp抑制剂能够促进卵巢癌cafs的活化。
[0088]
实施例3 parp抑制剂对卵巢cafs的活化(动物水平)
[0089]
根据实验例4的方法，本发明实施例构建了parp抑制剂处理的 brca野生型(skov3和ovcar8、ov90)癌细胞和突变型(hcc1937) 癌细胞的小鼠皮下瘤模型(如图3a)，并根据实验例6进行免疫组化实 验。
[0090]
如图3所示，结果表明，olaparib显著抑制人卵巢癌细胞系skov3 皮下瘤体积的同时，肿瘤组织中α
‑
sma表达增加(图3b
‑
d)。niraparib 显著抑制人卵巢癌细胞系ovcar8、ov90(brca野生型)和人三阴性 乳腺癌细胞系hcc1937(brca突变型)皮下瘤体积的同时，肿瘤组织 中α
‑
sma表达增加(图3b
‑
d)。以上结果均提示在小鼠皮下瘤模型中， parp抑制剂在抑制肿瘤生长的同时，促进了肿瘤组织中cafs的活化。
[0091]
实施例4 parp抑制剂上调卵巢癌cafs中ccl5的表达
[0092]
参照实施例3的方法进行了体外实验，分别用dmso、olaparib和 niraparib处理cafs，并对处理后cafs中的cll5表达进行了相关检测。 结果如图4所示。
[0093]
结果表明，rt
‑
qpcr(实验例8的方法)和elisa检测(实验例9 的方法)提示olaparib和niraparib能够显著上调cafs的ccl5表达(图 4e，f)。在小鼠肿瘤组织中免疫组化实验(参照实验例6)也显示olaparib 和niraparib处理的cafs中ccl5表达上调(图4g
‑
j)。
[0094]
实施例5 ccl5中和抗体作为调节剂的作用
[0095]
本实施例进行体外给予原代cafs的ccl5处理实验和参照实验例4 进行动物实验，并对balb/c裸鼠解剖的肿瘤组织块进行相关检测，结 果如图5、图6、图7所示。
[0096]
如图5a所示，体外给予原代cafs梯度浓度的ccl5处理发现，ccl5 呈浓度依赖性促进cafs活化。对mrc5
‑
cafs和原代cafs进行爬片免 疫荧光显示奥拉帕尼能够促进cafs活化蛋白的α
‑
sma表达和cafs细 胞骨架形态的伸展(图5b)，提示parp抑制剂促进了cafs的活化表 型，而给予ccl5中和抗体逆转了parp诱导的cafs活化表型。胶原收 缩实验显示奥拉帕尼能够促进cafs收缩胶原的能力，而给予ccl5中和 抗体同样逆转了parp抑制剂诱导增强的cafs收缩胶原能力(图5c)。
[0097]
进一步的动物实验显示在brca野生型人卵巢癌细胞系skov3皮 下瘤模型中，联用ccl5中和抗体能够进一步促进奥拉帕尼对肿瘤重量 的抑制作用，如图6所示。同样情况见于brca野生型人卵巢癌细胞系 ovcar8、ov90和brca突变型人三阴性乳腺癌细胞系hcc1937中， 联用ccl5中和抗体进一步促进了尼拉帕尼对肿瘤重量的抑制(图6d)。 肿瘤生长曲线结果显示联用ccl5中和抗体与奥拉帕尼或尼拉帕尼均能 够进一步提高parp抑制剂的抑瘤能力(图6e)，以上结果提示中和ccl5 能够有效提高parp抑制剂对肿瘤的抑制作用。
[0098]
对小鼠皮下瘤组织进行masson和天狼星红染色显示，奥拉帕尼和尼 拉帕尼处理
后肿瘤组织与对照组相比有明显的间质成分富集和胶原堆 积，提示parp抑制剂促进了肿瘤间质cafs的活化，而ccl5中和抗体 能够逆转parp抑制剂诱导的间质富集(图7f
‑
i)，即进一步说明ccl5 中和抗体能够逆转parp抑制剂诱导的间质活化。
[0099]
由于肿瘤间质cafs活化在肿瘤耐药中具有公认的重要作用，因此， ccl5中和抗体可能通过抑制parp抑制剂诱导的间质cafs活化进而改 善了肿瘤细胞对parp抑制剂的抵抗，而进一步增加了parp抑制剂的治 疗效果。
[0100]
实施例6 parp抑制剂对nf
‑
κb信号通路的活化作用
[0101]
本实施例研究了为了parp抑制剂对nf
‑
κb信号通路的活化作用机 制，通过体外实验使用parp抑制剂处理cafs细胞(mrc5
‑
cafs和 cafs#11
‑
13)，使用rna
‑
seq技术进行gsea分析、荧光素酶报告分析， 结果如图8所示。图8a中，图上峰值在左侧，0以上nes为正值，表明 该nf
‑
κb信号被活化了。图8b中，奥拉帕尼处理后，cafs中nf
‑
κb信 号均被显著活化。
[0102]
本发明实施例还进行了参照实验例4的动物实验获得小鼠移植瘤组 织，结果如图9所示。图9c
‑
f为小鼠移植瘤组织的组化染色图，其结果 也提示parp抑制剂处理后肿瘤间质中nf
‑
κb通路显著活化且与ccl5 表达正相关(图9c
‑
f)。
[0103]
本发明实施例还进行对动物实验获得小鼠移植瘤组织间质nf
‑
κb信 号的相关蛋白进行了western(如图10)和elisa(如图11)分析。
[0104]
图10g
‑
h分别为处理组的相关nf
‑
κb信号通路相关蛋白表达量，图 10i
‑
j相对于图10g
‑
h中对应蛋白表达量下降，表明nf
‑
κb抑制剂 bay117082下调了nf
‑
κb信号通路相关蛋白，从而抑制了奥拉帕尼或尼 拉帕尼对cafs的活化作用，同时也下调了ccl5的表达。图11k
‑
n能够 得到相同的结论。
[0105]
实施例7 临床验证parp抑制剂与卵巢癌间质cafs的关系
[0106]
本实施例还在临床标本(来源于实验例2)中验证了parp抑制剂对 cafs的活化作用，本实施例收取了8例olaparib使用前后卵巢癌的配对 标本进行免疫组化相关实验，结果如图12所示。
[0107]
结果表明：olaparib治疗促进了卵巢癌肿瘤间质活化(α
‑
sma表达增 加，masson染色间质增加)(图12a
‑
c)，同时免疫组化连续切片显示卵 巢癌间质ccl5和nf
‑
κb信号通路活化且两者表达呈显著正相关(图 12d
‑
g)。以上结果提示parp抑制剂治疗能够促进卵巢癌患者肿瘤组织 间质活化。
[0108]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围 并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范 围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。