GhPOT8基因在调控植物耐盐胁迫能力中的应用及调控植物耐盐胁迫能力的方法与流程

ghpot8基因在调控植物耐盐胁迫能力中的应用及调控植物耐盐胁迫能力的方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种ghpot8基因在调控植物耐盐胁迫能力中的应用及调控植物耐盐胁迫能力的方法。


背景技术：

2.钾是植物生长发育所必需的三大营养元素之一，约占植物干重的 1％～10％，在植物细胞内以钾离子形式存在，在植物体中以第二丰富的阳离子广泛分布于植物的各种组织中，参与细胞中的多种生物化学过程，如维持细胞内的ph、细胞伸长、酶的激活、渗透调节(isabelle,c
é
cile et al.2014, ch
é
rel and gaillard 2019)。
3.在植物中，钠离子虽然是维持细胞生长所必需的微量元素，但在农业生产中，土壤中含有大量的钠而对植物造成毒害，而且处于高水平的钠离子土壤中，会引起细胞生理性缺水。盐渍化的土壤中，na

含量很高，而 na

在化学结构上与k

非常相似，盐胁迫下k

往往被na

取代，所以细胞质的na

毒害往往伴随着k

的缺失(blumwald,aharon et al.2000,silberbush, ben
‑
asher et al.2001)。所以钾转运基因在非生物胁迫中发挥重要作用。植物可以通过调整细胞内钾离子的转运以及从环境中对钾离子的吸收，来参与调节植物对非生物胁迫的耐受性。目前已见报道，在水稻中，oshak16 在一定的外部钾离子浓度范围内介导k

的吸收和从根到茎的运输，从而有助于维持水稻地上部分钾离子的动态平衡和耐盐性(feng,tang et al.2019)。oshak1在k

介导的水稻生长和水稻的耐盐性中起重要作用(guang,chenet al.2015)。phahak2在耐盐品种中的转录组数据显著高于敏盐系品种，且 phahak1可参与na

的吸收(takahashi,nishio et al.2007)。拟南芥atkup4 的t
‑
dna插入突变体atkup4株系和野生型对比，表现出根毛伸长受到抑制 (rigas,debrosses et al.2001)。
4.棉花作为我国重要的经济作物，对棉花的非生物胁迫的耐受性尚未见报道，而提高棉花的钾离子的转运及吸收从而调节棉花对非生物胁迫的耐受性尤为重要。
5.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的在于提供ghpot8基因在调控植物耐盐胁迫能力中的应用，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
7.本发明的第二个目的在于提供一种调控植物耐盐胁迫能力的方法。
8.本发明提供了ghpot8基因在调控植物耐盐胁迫能力中的应用；
9.所述ghpot8基因具有如seq id no.3所示的核苷酸序列。
10.进一步的，所述ghpot8基因表达含有如seq id no.4所示的氨基酸序列的蛋白。
11.进一步的，上调植物中ghpot8基因的表达，以增强植物耐盐胁迫能力。
12.进一步的，所述植物包括拟南芥和/或棉花。
13.此外，本发明还提供了一种调控植物耐盐胁迫能力的方法，包括调控植物中ghpot8基因的表达量；
14.所述ghpot8基因具有如seq id no.3所示的核苷酸序列。
15.进一步的，上调植物中ghpot8基因的表达，以增强植物耐盐胁迫能力。
16.进一步的，通过将ghpot8基因转入植物中以上调ghpot8基因的表达。
17.进一步的，将ghpot8基因构建至表达载体上，然后用得到的重组表达载体转化农杆菌，并用转化的农杆菌浸染拟南芥花序，筛选阳性转基因植株，实现ghpot8基因的过表达。
18.进一步的，所述表达载体包括pbi121。
19.进一步的，所述植物包括拟南芥和/或棉花。
20.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
21.本发明的发明人通过对植物内ghpot8基因的研究，发现上调该基因的转基因植株较野生型植株具有更高的耐盐胁迫能力，具体表现为叶绿素含量、超氧化物歧化酶活性、可溶性糖含量及脯氨酸含量均有所提高。通过过表达ghpot8基因能够有效提高植物的耐盐性能，能够提高植物在盐碱地的产量。本发明提供的ghpot8基因为培育高耐盐性能的植物新品种提供了宝贵的基因资源。
22.本发明提供的调控植物耐盐胁迫能力的方法，包括调控植物中ghpot8 基因的表达量，相比于传统的向植物施与生长素、细胞分裂素和脱落酸等外源物质，直接调控植物的基因能够更精准的调控植物的表型，调控效率高。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为本发明实施例5提供的ghpot8基因在转基因植株与野生型植株中转录水平的荧光定量验证结果图(wt为非转基因野生型拟南芥，oe1， oe2和oe3为三个转基因拟南芥株系)；
25.图2为本发明实施例5提供的将转基因t3代植株与野生型植株同等条件下在培养皿中正常生长15天侧根根系的结果图(wt为非转基因野生型拟南芥，oe1，oe2和oe3为三个转基因拟南芥株系)；
26.图3为本发明实施例5提供的将转基因t3代植株与野生型植株同等条件下在培养皿中正常生长4周的茎和叶片的切片结果图(wt为非转基因野生型拟南芥，oe1，oe2和oe3为三个转基因拟南芥株系)；
27.图4为本发明实施例5提供的将转基因t3代植株与野生型植株同等条件下在50mmol/l的培养基上生长15天的结果图(wt为非转基因野生型拟南芥，oe1，oe2和oe3为三个转基因拟南芥株系)；
28.图5为本发明实施例5提供的不同处理条件下植株叶绿素含量、超氧化物歧化酶活性、可溶性糖含量低、脯氨酸含量的结果图(a中156空为 pyl156空载株系，247为ghpot8沉
默株系，b为叶绿素含量，c为超氧化物歧化酶含量，d为可溶性糖含量，e为脯氨酸含量)。
具体实施方式
29.除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本技术中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
30.一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
31.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.根据本发明的一个方面，本发明提供了ghpot8基因在调控植物耐盐胁迫能力中的应用；
33.所述ghpot8基因具有如seq id no.3所示的核苷酸序列。
34.所述“具有”指的是所述ghpot8基因核苷酸序列可以是只如seq idno.3所示的核苷酸序列，也可以由seq id no.3所示的核苷酸序列和其他核苷酸序列组成，例如编码用于蛋白纯化的标签、荧光蛋标记物和dna的结合位点等功能单元的核苷酸序列，或者编码对基因转录和表达具有调节作用的元件，包括但不限于启动子、强启动子、增强子或转录因子结合位点等；所述“具有”还可以指如seq id no.3所示的核苷酸序列在ghpot8 基因中是不连续的，但是可以产生如seq id no.3所示的核苷酸序列的 cdna。
35.在一些可选的实施方式中，所述ghpot8基因表达含有如seq id no.4 所示的氨基酸序列的蛋白。
36.含有如seq id no.4所示的氨基酸序列的蛋白指的是，所述蛋白的氨基酸序列可以为全部如seq id no.4所示的氨基酸序列，也可以由如seqid no.4所示的氨基酸序列和其他氨基酸组成，其他氨基酸在蛋白中的作用包括但不限于组成用于蛋白纯化的标签、荧光蛋标记物和dna的结合位点等，在一些具体的实施例中例如可以为但不限于his、gst、myc、flag、 hsv、v5、ha、gfp、rfp、bfp、cat、dhfr、mbp、t7或硫氧还蛋白等。
37.盐胁迫过后植物会产生一些超氧化物自由基，这些物质的出现会影响植物细胞中正常的生理生化过程，超氧化物歧化酶可以降低这些超氧化物的含量，可溶性糖作为信号分子，其含量及脯氨酸含量都是反映植物抗逆境性强弱的指标。本发明的发明人通过对植物内ghpot8基因的研究，发现上调该基因的转基因植株较野生型植株具有更高的耐盐胁迫能力，具体表现为叶绿素含量、超氧化物歧化酶活性、可溶性糖含量及脯氨酸含量均有所提
高。通过过表达ghpot8基因能够有效提高植物的耐盐性能，能够提高植物在盐碱地的产量。
38.可以理解的是，所本发明中划分某一环境术语盐胁迫环境还是正常环境的准则与现有公知技术相符。例如，对于大多数植物，通常“耐盐胁迫能力”是指耐受盐浓度0.1％～0.2％(如nacl为20～50mm，较佳地25～40mm) 的能力。
39.本发明还提供了一种调控植物耐盐胁迫能力的方法，包括调控植物中 ghpot8基因的表达量；
40.所述ghpot8基因具有如seq id no.3所示的核苷酸序列。
41.由于ghpot8基因与植物耐盐性能相关，因此调控植物中ghpot8基因的表达量能够实现调控植物的耐盐胁迫能力，相比于传统的向植物施与生长素、细胞分裂素和脱落酸等外源物质，直接调控植物的基因能够更精准的调控植物的耐盐胁迫能力，调控效率高。
42.在一些可选的实施方式中，上调植物中ghpot8基因的表达，以增强植物耐盐胁迫能力。
43.优选地，通过将ghpot8基因转入植物中以上调ghpot8基因的表达。
44.其中，可以通过将携带有ghpot8基因的表达载体转入植物中，例如通过ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电穿孔的常规生物技术方法转入植物中，本发明对此不做限定。
45.具体地，可以将ghpot8基因构建至表达载体上，然后用得到的重组表达载体转化农杆菌，并用转化的农杆菌浸染拟南芥花序，筛选阳性转基因植株，实现ghpot8基因的过表达。
46.其中，重组表达载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。
47.优选使用pbi121作为本发明的表达载体。
48.下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
49.本发明实施例所用到的材料来源如下：
50.1.棉花材料
51.本实施例选取的棉花材料为tm
‑
1。对于田间实验，该品种种植于中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室试验田(安阳白璧)，管理措施为正常大田管理。
52.对于盐胁迫处理实验，将棉花种植于温室中，待棉花子叶展平进行基因沉默处理，在温室中生长直至阳性对照植株出现白化表型，对沉默植株进行200mmnacl处理，在棉花表现出对盐胁迫的响应时取样。
53.2.试剂和耗材
54.限制性内切酶，修饰酶、pcr反应体系相关酶、胶回收试剂盒、克隆试剂盒、质粒小题试剂盒购自宝生物工程大连有限公司，dna提取试剂盒购自omega公司。
55.其他药品：琼脂糖为西班牙原装产品，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，氨苄青霉素等购自宝生物工程大连有限公司，大肠杆菌感受态细胞dh5α购自北京天根生化科技公司
56.培养基：lb液体培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l、酵母提取物(yeastextract)
5g/l、氯化钠(nacl)10g/l；lb固体培养基：胰蛋白胨 (tryptone)10g/l、酵母提取物(yeast extract)5g/l、氯化钠(nacl)10g/l、琼脂粉15g/l，定容至1l；lb选择培养基：在lb铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55度时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板；1/2ms固体培养基： 1/2ms 22g/l，琼脂粉(agar powder)8g/l，蔗糖(sucrose)30g/l。
57.主要仪器：pcr扩增仪(bio
‑
rad)，高速离心机(hettich mikro 200r)、电泳设备(bio
‑
rad)、凝胶成像系统(bio
‑
rad)、荧光定量 pcr仪(abi7500)、电热恒温培养箱(上海森信)、恒温培养振荡器(上海智城)、人工气候试验箱(赛福)、人工气候室。
58.实施例1棉花ghpot8基因和启动子的克隆与生物信息学分析
59.从ncbi上获得ghpot8的基因序列，采用oligo 7软件设计引物，采用pcr(polymerase chain reaction)的方法从陆地棉tm
‑
1中扩增，其开放阅读框1791bp，编码596个氨基酸，蛋白的相对分子量为66.94kda，等电点为8.97。
60.上游引物f：5
’‑
atggcaattttttcagcagt
‑3’
(seq id no.1)；
61.下游引物r：5
’‑
taccaagtataccatcccaacttc
‑3’
(seq idno.2)。
62.开放阅读框序列为：
63.atggcaattttttcagcagtgtcaggattcgagctttcaatgtcc aaagaacaacatcgttatgtagaagttccagcagcttgtgccattttg gtattcttgtttgcactccaacattatgggaccaaccgggtggggttc ttgtttgcacccgttgtaataacatggctattgtgcatcagtgcaattg ggatttacaacatttgtgaatggaacccccatgtctaccaagcactct ctccatattacatgtacaagttcttgaagaagacccaaaagaaaggtt ggatgtcacttggtgggatcttgctttgtattacaggctcagaagctat gtttgctgatcttggacatttttcacagttgtctatcaaggttgctttc acctttgtggtttacccctctttaattcttgcatacatgggccaagctg cttatctttctaagcaccatatcaatgaaaccgactacaggatcggatt ctacgtgtccgtaccagagaaaataagatggccagttctggttatagc catacttgcagcagttgtaggaagtcaatccatcataactggaacatt ttctattatcaaacaatgttctgctttgggttgtttccctaagatcaaa atcatccacacttcatccaaaattcatggccagatttacatcccacaga tcaactggactttgatgctcttatgcttggctgtaaccatcggtttccg agacaccaaacgcatggggaatgcctctggtttggcagttattacagt tatgttggttacaacatgcttaatgtctctggttattgtgttatgctggc ataaaagtgtcttgttagctgttttctttctattcttctttggttccatt gaagcactgtatttctcagcatctctcatgaagttccttgaaggggct tgggttcccatagcccttgctttaatcttttcagtcataatgtacgttt ggcactatggaacactaaagaaatacgagtttgatgttcagaataagg tctcaataaattggctccttgctctcggtcctactttgggtatcgttcg ggttcgaggcatcgggcttatacataccgagctagtttccgggatccc ggctattttttctcactttgtcaccaaccttctagctttccaccaagta gtagtgtttctttgcatcaaatcagttccagtgccccatgttagtcccg gggaacggttcctagtcggaagagttggtccgaaagggtataggctt tatcggtgtattgcacggtatggatatcgagatattcacaaagatgata ttgaattcgagaaagatctcacttgcagcattgcggaattcatccggt cagaacggcccgaacatattaccagaatggaaaacgatgagaaaatg acagttattgggacatcatcatcgaattcacaaggtgtgtcaatttgt gcagatggtggtgatgatcatgaagattcatccgaaatagtaagcgca aagtcccctgagaagccaaggaaaagggtgaggtttgtggtcccgg aaagtccccagatcgacagtgaggcgagagaggaattgcgggaact aatggaagctagggaatcaggcatggcattcatattggggcattcatat gtaagagcaaagaaaggatcaaatttgatgaagagaatagtgataaa ttatggatatgatttcttgagaagaaactctagagagccaacttatgct ttaagcatttctcatgcatctacattagaagttgggatggtatacttgg tataa(seq id no.3)。
64.编码的氨基酸序列为：
65.maifsavsgfelsmskeqhryvevpaacailvflfalqhygtnrvgf lfapvvitwllcisaigiynicewnphvyqalspyymykflkktqkkgw mslggillcitgseamfadlghfsqlsikvaftfvvypslilaymgqaay lskhhinetdyrigfyvsvpekirwpvlviailaavvgsqsiitgtfsiikqc salgcfpkikiihtsskihgqiyipqinwtlmllclavtigfrdtkrmgnas glavitvmlvttclmslvivlcwhksvllavfflfffgsiealyfsaslmk flegawvpialalifsvimyvwhygtlkkyefdvqnkvsinwllalgpt lgivrvrgiglihtelvsgipaifshfvtnllafhqvvvflciksvpvphvs pgerflvgrvgpkgyrlyrciarygyrdihkddiefekdltcsiaefirse rpehitrmendekmtvigtsssnsqgvsicadggddhedsseivsakspe kprkrvrfvvpespqidseareelrelmearesgmafilghsyvrakkg snlmkrivinygydflrrnsreptyalsishastlevgmvylv(seq idno.4)。
66.具体克隆基因的过程为：
67.1.取样方法
68.取适量拟南芥叶片速冻于液氮，存于
‑
80
°
冰箱备用。
69.2.rna的提取
70.以下所有离心步骤均在室温下进行。
71.1)匀浆处理：100mg植物组织样品在液氮中迅速研磨成粉末，加入700μl sl(使用前加入β
‑
巯基乙醇)，立即剧烈震荡使样品混匀。注意1：对于预期rna得率小于10μg的植物样本，请使用100mg的起始样本量；对于富含淀粉的样本或成熟叶片，请将裂解液sl用量增加至700μl。注意2：由于植物多样性非常丰富，而且同种植物的不同生长发育阶段和不同组织的rna含量都不相同，请根据具体实验情况选择合适的植物材料的用量。
72.2)12,000rpm离心2min。
73.3)将上清液转移至过滤柱cs上，12,000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的rnase
‑
free的离心管中，吸头避免接触收集管中的细胞碎片。
74.4)加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将混合物转入吸附柱cr3 中，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
75.5)向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
76.6)dnasei工作液：取10μl dnasei储存液和70μl rdd溶液轻柔混匀。
77.7)向cr3中加入80μl的dnasei工作液，室温静止15min。
78.8)静置完后，向cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
79.9)向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw(使用前加入乙醇)，12,000rpm 离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
80.10)重复步骤。
81.11)12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，将吸附柱cr3放入一个新的rnase
‑
free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30
‑
50μl rnase
‑
freeddh2o，室温放置2min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心1min，得到rna溶液。注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。rna样品请在
‑
70℃中保存。如果预期rna得率大于30μg，可将步骤11中离心得到的rna溶液再加入吸附柱cr3中，室温放置2min， 12,000rpm(～13,400
×
g)离心
1min，得到rna溶液。
82.为预防rnase污染，注意事项：
83.1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致rnase污染；
84.2)使用无rnase的塑料制品和枪头避免交叉污染；
85.3)rna在裂解液sl中时不会被rnase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含rnase的塑料和玻璃器皿。
86.4)配制溶液应使用rnase
‑
free ddh2o。
87.3.反转录
88.rna的反转录方法参照采用takara的反转录试剂盒drr037a的说明书进行，rt的反应液的配置在冰上进行，具体操作如下：
[0089][0090]
反转录反应条件如下:
[0091]
37℃15min(反转录反应)，
[0092]
85℃5s(反转录酶的失活反应)，
[0093]
500ng rna反转录为cdna，将反转录产物cdna溶液稀释8倍作为 pcr反应模板。
[0094]
4.基因克隆的pcr反应体系、程序和产物检测
[0095]
1)pcr反应体系
[0096]
根据primestar gxl dna聚合酶说明书，pcr反应体系如下：
[0097][0098][0099]
2)pcr反应程序
[0100][0101]
3)pcr产物的检测
[0102]
取1μl pcr产物，加入11μl 10
×
loading buffer，混匀，点样于1％琼脂糖凝胶，电泳检测。
[0103]
5.pcr产物的胶回收
[0104]
1)在紫外灯下从电泳胶上切下所需回收的条带，注意刀片需消毒，胶块应尽量小，使之易融化完全；
[0105]
2)事先将一个eppendorf管称重，然后将胶块放入后再次称重，获得胶块的重量；
[0106]
3)以每100mg胶块加入300μl的量加入binding buffer，查看胶块是否浸在液体中；
[0107]
4)56℃水浴10min以融化胶块释放dna，期间每2
‑
3min需取出震荡；
[0108]
5)待胶块完全融化后按照每100mg胶块150μl的量加入异丙醇，充分震荡混匀；
[0109]
6)将high pure filter tube安装到collection tube上；
[0110]
7)将所有eppendorf管中的液体转移到high pure filter tube中去，注意不要超过700μl，若超过需分两次离心；
[0111]
8)12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；
[0112]
9)加入500μl wash buffer后再次离心1min；
[0113]
10)倒掉收集管中的液体后再次加200μl的wash buffer，12000rpm离心1min；
[0114]
11)小心将filter tube取下后装入一个新的effendorf管上；
[0115]
12)在滤芯的正中加上30μl的elution buffer，室温放置1min，12000 rpm离心1min
[0116]
6.胶回收产物与克隆载体pbi121连接
[0117]
1)在微量离心管中配制下列dna溶液，全量为10μl
[0118][0119]
37℃反应30min；立即置于冰上冷却待用。
[0120]
注)
①
室温(25℃)也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
[0121]
②
5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
[0122]
7.连接产物转化大肠杆菌
[0123]
1)向连接反应体系中加入100μl大肠杆菌dh5α感受态，冰浴30 min；
[0124]
2)42℃水浴热激45s；
[0125]
3)冰浴2min；加入900μl lb液体培养基，37℃，150rpm，孵育1h；
[0126]
4)离心收菌，4000rpm，3min，弃上层上清，留约100μl混匀后涂布含氨苄抗性的lb平板；
[0127]
5)37℃，恒温培养过夜；
[0128]
8.阳性克隆的检测及测序
[0129]
1)从转化平板上挑取白色菌落，放入含有kana的液体lb培养基中， 37℃恒温摇床培养8小时；
[0130]
2)菌落pcr验证阳性克隆，将验证正确的单克隆送到尚亚生物科技有限公司测序，每个序列测3个重复。
[0131]
9.阳性菌液的保存
[0132]
菌液pcr验证且测序正确的菌液中加入一定量的甘油，使甘油终浓度在20％左右，
‑
70℃保存。
[0133]
实施例2 pbi121
‑
ghpot8植物表达载体的构建
[0134]
1.带有特定酶切位点的目的基因片段的获得
[0135]
为了扩增基因编码区全长，并加上特定酶切位点，根据克隆到的 ghpot8的cdna序列，分别在起始密码子atg和终止密码子处设计含有适合酶切位点引物。所用酶切位点为xbai(t/ctaga)和sac i(gagctc)。
[0136]
ghpot8酶切位点引物序列如下：
[0137]
上游引物f：5
’‑
atggcaattttttcagcagt
‑3’
(seq id no.1)；
[0138]
下游引物r：5
’‑
taccaagtataccatcccaacttc
‑3’
(seq idno.2)。
[0139]
2.pbi121
‑
ghpot8植物表达载体的构建
[0140]
具体过程为：将重组子ghpot8的克隆载体和pbi121质粒分别用sac i 和xbai双酶切，电泳回收目的片段和pbi121载体的大片段产物；目的基因片段和pbi121的酶切大片段产物连接酶连接；连接产物转化大肠杆菌 dh5α，37℃培养过夜；挑取单克隆摇菌，测序验证序列的正确性。
[0141]
实施例3重组载体转化农杆菌感受态
[0142]
利用冻融法转化根癌农杆菌gv3101感受态细胞，具体转化过程如下：
[0143]
1)根癌农杆菌gv3101感受态细胞100μl中加入质粒1μg，混匀后冰浴30min；液氮速冻75s，37℃热激2～6min；
[0144]
2)冰浴5min，再加入600μl lb液体培养基；
[0145]
3)190rpm，28℃，培养4h后取100μl菌液涂在含有卡那霉素、庆大霉素和利福平的lb筛选培养基上，28℃培养大约36～48h，抗性菌落可见；
[0146]
4)挑选阳性克隆，在lb液体培养基上28度培养48h甘油终浓度在 15％左右，
‑
20℃保存备用。
[0147]
实施例4农杆菌介导的拟南芥的转化
[0148]
采用花序浸染法转化拟南芥
[0149]
1)将
‑
20℃保存的农杆菌菌液20μl接种到1ml lb液体培养基中，28℃、 180rpm振荡培养过夜，取活化菌液200μl加入到50ml lb液体培养基28℃、 180rpm振荡培养；
[0150]
2)待菌液od值约为1.2时，3000转/每分离心菌液收集菌体；
[0151]
3)转化介质配方为：1/2ms(大量元素减半，其他不变)、5％蔗糖， 0.01μg/ml苄氨基嘌呤(bap)，0.03％silwetl
‑
77，20mg/l乙酰丁香酮，koh 调ph值至5.7(steven et al.1998)；
[0152]
4)用上述转化介质悬浮菌体，调od至0.8开始浸染；
[0153]
5)将拟南芥花序置于转化介质中30
‑
50s，浸染后用保鲜膜将拟南芥包起来，暗培养一天后置于正常条件下培养；
[0154]
6)种子成熟后，收获，为t0代种子。
[0155]
实施例5转基因拟南芥植株的表型鉴定
[0156]
1.将收获的种子消毒后种植在含卡那霉素的1/2ms上，后进行4℃春化3天，转移到人工气候试验箱中，10天左右会阳性植株生长正常，而阴性植株叶片变黄，不再生长。
[0157]
2.将阳性拟南芥植株移栽至小花盆中种植，待生长一个月后提取dna 用pcr进行检测，检测时所用引物为：
[0158]
上游引物f：5
’‑
atggcaattttttcagcagt
‑3’
(seq id no.1)；
[0159]
下游引物r：5
’‑
taccaagtataccatcccaacttc
‑3’
(seq idno.2)。
[0160]
3.每一代的植株都要进行阳性株系的检测，直至繁殖至t3代，获得纯合转基因拟南芥株系。t3代株系做qrt
‑
pcr检测，荧光定量验证的过程如下：
[0161]
提取rna，反转录成cdna，分别设计ghpot8和拟南芥内参基因actin 荧光定量的引物：
[0162]
ghpot8：
[0163]
上游引物：5
’‑
gctgaatctcctcctccttct
‑3’
(seq id no.5)；
[0164]
下游引物：5
’‑
cgggaaccttcaacgtcctt
‑3’
(seq id no.6)。
[0165]
ghactin：
[0166]
上游引物：5
’‑
atcctccgtcttgaccttg
‑3’
(seq id no.7)；
[0167]
下游引物：5
’‑
tgtccgtcaggcaactcat
‑3’
(seq id no.8)。
[0168]
冰上配制qrt
‑
pcr反应体系，进行荧光定量pcr反应。
[0169]
pcr反应体系为：
[0170][0171]
pcr反应程序：
[0172][0173][0174]
融解曲线分析：
[0175]
95℃15s 60℃1min 95℃15s 60℃15s。
[0176]
荧光定量验证结果证实ghpot8基因在转基因植株中转录水平高于非转基因拟南芥，如图1。
[0177]
4.将转基因t3代植株与非转基因植株同等条件下在培养皿中正常生长15天，非转基因拟南芥的侧根根系没有转基因发达，如图2。
[0178]
5.取上述生长4周的拟南芥的茎和叶片，制作切片，切片结果如图3，非转基因拟南芥叶片细胞中的细胞壁区域染色较浅，木质部染色区域颜色浅，细胞排列松散，转基因拟南芥叶片细胞中的细胞壁区域染色较深，木质部染色区域颜色较深，细胞排列紧密。
[0179]
6.将转基因t3代与非转基因植株在50mmol/l nacl的培养基上生长 15天，非转基因植株表现出根系稀少，叶片发育较小，转基因拟南芥的植株表现出根系发达，侧根较多，叶片较大，如图4。
[0180]
7.将构建好的pyl156::ghpot8载体侵染棉花两周后，阳性对照出现白化表型，对棉花进行200mm nacl处理，直至156空载或基因沉默植株出现表型，取样，取0.1g研磨成粉末的棉花叶片用于测定相关物质的含量变化，和空载相比，基因沉默植株的叶绿素含量、超氧化物歧化酶活性、可溶性糖含量低、脯氨酸含量均表现出降低，如图5。
[0181]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。