一种抗人乳头瘤病毒31型的单克隆中和抗体及其应用的制作方法

一种抗人乳头瘤病毒31型的单克隆中和抗体及其应用
1.本技术是中国专利申请cn 202110256302.5的分案申请，该申请的申请日为2021年3月9日，发明名称为“一种抗人乳头瘤病毒31型的单克隆中和抗体及其应用”。
技术领域：
2.本发明属于生物及医药技术领域，具体涉及抗人乳头瘤病毒31型的单克隆中和抗体及其应用。


背景技术：

3.人乳头瘤病毒(hpv)是无包膜的双联小dna病毒，主要侵及人的上皮组织，进而诱发各种良性及恶性增生病变。某些人乳头瘤病毒的型别与宫颈癌、喉癌、膀胱癌、食管癌等上皮恶性肿瘤相关。高危型hpv感染与多种恶性肿瘤的发生相关。hpv感染的流行范围广，所引发的相关致死性的恶性肿瘤对人类健康具有严重的危害性，开发安全有效的预防或治疗性疫苗具有重大意义。目前已经上市的疫苗，价型最多的疫苗为默沙东的9价疫苗(gardasil 9)，由hpv6、11、16、18、31、33、45、52和58型组成。hpv疫苗的研究发现，体外表达的hpv l1蛋白能够自组装成病毒样颗粒(virus
‑
like particles，vlp)，其结构与天然hpv高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表位，可诱导高滴度的中和抗体。
4.在hpv疫苗研发过程中，至少需要开展四个方面的测定，即工艺过程样含量检测、型别鉴定实验、抗原含量检测和体外效力检测。其方法均可以采用双抗体夹心法elisa。而体外效力检测要求至少有一株中和抗体用于elisa法检测，因此，单克隆抗体是疫苗研制过程中的重要工具，尤其是具有特异性和中和活性的抗体具有不可替代的作用。除此以外，利用中和抗体开发的抗体药，还可以应用于乳头瘤病毒引起的相关疾病的治疗作用。
5.在疫苗研发过程中，体外效力的检测，用双抗体夹心法elisa法检测，对所使用的抗体的要求，除了其中一个配对抗体是中和抗体以外，还必须要求具有特异性，因为多价疫苗，是多种hpv混合在一起的，要对每种hpv进行体外效力的测定，首先就必须能够特异性的检测到目的蛋白。目前已经上市的最多价型是9价，个别报道已经开展临床的有14价疫苗，但目前还未有文献报道更高价如15价特异的抗体。除了中和活性和特异性是必须的以外，作为体外效力检测用到的抗体，抗体识别的抗原表位最好是中和活性的优势表位，体外效力才有更佳的代表疫苗活力的意义。


技术实现要素：

6.针对现有技术的需求和不足，本发明人通过研究获得的抗人乳头瘤病毒31型的单克隆中和抗体，其是15价特异抗体，且具有中和优势表位，因而提出本发明。
7.本发明人提供一种抗人乳头瘤病毒31型的单克隆中和抗体，其重链中：cdr1序列为：dyamh；cdr2序列为：vmstyyddanynqkfkg；cdr3序列为：gplygnyvdysmdy；且其轻链中，cdr1序列为：kssqslldsdgktyln；cdr2序列为：lvsklds；cdr3序列为：qgthfprt；
8.或者其重链中：cdr1序列为：gygvn；cdr2序列为：miwgdgstdynsal；cdr3序列为：
ggssyyyamdy；且其轻链中，cdr1序列为：raseniysyla；cdr2序列为：naktlae；cdr3序列为：qhhygtplt。
9.优选地，所述单克隆中和抗体其重链全长氨基酸序列如seq id no：2所示；其轻链的全长氨基酸序列如seq id no：7所示；或者其重链全长氨基酸序列如seq id no：12所示；其轻链的全长氨基酸序列如seq id no：17所示。
10.更优选地，所述单克隆中和抗体，分别由单克隆抗体细胞株hpv31 19b4和hpv31 19c2产生的，其中，单克隆抗体细胞株hpv31 19b4和hpv31 19c2已于2020年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为cgmcc no.21416和cgmcc no.21417。
11.本发明还提供编码所述的单克隆中和抗体的多核苷酸。
12.进一步提供一种核酸表达载体，包括编码所述的多核苷酸。
13.还提供含有所述的核酸表达载体的重组宿主。
14.本发明还提供单克隆中和抗体细胞株hpv31 19b4，其保藏编号为cgmcc no.21416；单克隆中和抗体细胞株hpv31 19c2，其保藏编号为cgmcc no.21417。
15.本发明还提供所述的单克隆中和抗体的制备方法，包括：
16.培养所述的重组宿主，诱导所述单克隆中和抗体的表达；或培养所述的单克隆中和抗体细胞株，获得所述单克隆抗体。
17.本发明进一步提供前述的单克隆中和抗体在hpv31疫苗的检测中的应用，进一步地，所述检测是指hpv31疫苗功研制或制备过程中的过程样含量的检测，型别的鉴定，抗原含量的检测，或体外效力的检测，优选地采用双抗体夹心法elisa进行检测。
18.本发明还提供所述的单克隆中和抗体中的任意一种在制备防治人乳头瘤病毒引起疾病的药物中的应用，进一步所述疾病为进一步地，用于hpv6、hpv11、hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59、hpv68型人乳头瘤病毒引起的疾病，更进一步地所述疾病是宫颈癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌、阴茎癌、生殖器疣、扁平疣或寻常疣。
19.此外，本发明进一步提供人乳头瘤病毒31型检测或诊断试剂盒，其特征在于，包括前述任意一种单克隆中和抗体，优选采用elisa双抗体夹心法进行检测，并以另一种所述单克隆中和抗体作为包被抗体。
20.本发明获得的hpv31 19b4和hpv31 19c2单克隆抗体具有特别明显的优势，具有良好的灵敏度和特异性，具有中和活性，尤其两者是15价特异抗体，并且识别抗原优势表位。而目前一般hpv31抗体仅仅是9价特异抗体，也没有是否是优势表位的研究数据。因而，本发明的两个抗体在用于hpv31的临床诊断以及hpv病毒感染的治疗或预防中具有较大的应用价值。
21.其中，单克隆抗体细胞株hpv31 19b4已于2020年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.21416。单克隆抗体细胞株hpv31 19c2已于2020年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.21417。
附图说明
22.图1单抗与兔多抗阻断实验结果。
具体实施方式
23.本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。
24.本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
25.实施例一、单克隆抗体的杂交瘤细胞系研制及抗体纯化：
26.1、动物免疫
27.1)基础免疫：将hpv31 l1vlp抗原与福氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，共免疫6只小鼠，每只balb/c小鼠每次注射量为10μg。
28.2)加强免疫：加强免疫采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。在进行细胞融合前3天，经腹腔注射含15ug抗原的生理盐水溶液。实验结果如表1所示。
29.表1免疫小鼠血清检测(od450)
[0030][0031]
由上表可知，5号小鼠的血清滴度最高，选取该小鼠进行取脾，与sp20细胞融合。即选取信号最强的5号小鼠进行融合和后续的杂交瘤细胞的制备。
[0032]
2、杂交瘤细胞的制备和细胞系的建立
[0033]
按常规方法收集小鼠的脾细胞与sp2/0细胞按10:1的比例以500g/l的peg4000进行融合。用hat半固体培养液(含有1～3％甲基纤维素，1*hat，10～20％胎牛血清的imdm培养液)选择培养，培养10～20天，挑取1000个克隆到96孔板进行液体dmem培养基培养。继续培养5～10天，等细胞长起来，吸取一半培养基进行间接elisa法初筛克隆。
[0034]
间接elisa法的操作步骤如下：用200ng/孔的hpv31 l1 vlp包板，用免疫小鼠血清1:2000作为阳性对照，无克隆生长的培养基上清作为阴性对照，每孔加1:2000hrp
‑
山羊抗小鼠igg100μl，最后测定450nm od值。凡od450值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳性克隆。
[0035]
在1000个克隆初筛中，通过间接elisa法，od数值大于2倍阴性值的为12个克隆。
[0036]
表2初筛阳性克隆(注：表中读值为od450)
[0037] 19b419c219d619d1120a1120b1120f920f1020e1021e522g824d1阴性od4502.3262.5710.5630.6410.9591.2571.060.8582.0642.3021.8651.9540.058
[0038]
挑选初筛阳性的克隆，转移到24孔板继续培养，培养5～10天，等细胞长起来，吸取每孔的细胞培养液进行间接elisa法，复筛克隆，最终保留了其中6株阳性克隆。实验结果如下表3。
[0039]
表3复筛克隆结果总结表(注：表中读值为od450)
[0040] 19b419c219d619d1120a1120b1120f920f1020e1021e522g824d1阴性od4502.1582.3210.0880.0630.0460.0920.0840.0821.9082.5881.9812.3160.061
[0041]
初筛阳性的克隆，复筛后有部分转变为阴性。本实施例选取6株即19b4，19c2，20e10，21e5，22g8和24d1阳性克隆，进行细胞继续培养，传代，冻存等,进行后续实验腹水制备，抗体纯化等实验。
[0042]
3、腹水制备和抗体纯化
[0043]
选择成年balb/c小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5ml。7
‑
10天后腹腔接种杂交瘤细胞，每只小鼠1
×
106‑2×
106个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水。
[0044]
表4腹水量统计表
[0045][0046]
采集的腹水量，每株克隆均在合理水平。将腹水离心(13000r/min 30分钟)，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用protein g～sepharose cl
‑
4b进行纯化，上柱液为20mm的pbs缓冲液，柱层析洗脱液为：ph2.7,20mm的甘氨酸缓冲液，得到抗hpv31 vlp的单克隆抗体。
[0047]
表5抗体纯化量
[0048][0049]
由上述表5可知，21e5的抗体相对纯化后得到的量明显比其它抗体株低，其他抗体结果表明纯化2ml腹水抗体量均4.9mg以上。
[0050]
4.抗体的特异性鉴定
[0051]
使用15型vlp蛋白包板，进行elisa间接法评价克隆的特异性。间接elisa具体方法
如下：将vlp蛋白稀释至2μg/ml。以100μl/孔加至96孔酶标板，4℃包被过夜。封闭：将包被好酶标板甩干。以300μl/孔封闭液(2％bsa)加至板内，室温放置1
‑
2小时。样品稀释：用样品稀释液将抗体样品分别稀释至0.3μg/ml，混匀，100μl/孔加至酶标板内，室温放置1h。加二抗：将封闭后酶标板甩干，hrp标记羊抗鼠二抗以1:4000浓度，100μl/孔加至酶标板内，室温放置1h。显色：每孔300μl洗板5次，甩干。用卫生纸擦拭底部。以100μl/孔加入显色液，室温避光显色10分钟。终止：以100μl/孔加入终止液，终止反应。读数：将酶标板放入酶标仪中，od450进行读数和数据分析。结果如下表。
[0052]
表6特异性评价结果(od450)
[0053][0054]
按下述目标型别特异性判断：目标型别检测阳性，其余型别阴性，或者目标型od450读值大于其他型别od450读值5倍以上。因此，由表6可知，19b4，19c2，21e5，24d1为15价特异的抗体，20e10,22g8为15价非特异抗体。
[0055]
5.抗体的中和活性检测
[0056]
将本hpv31型假病毒与克隆细胞培养上清各50μl混合，1小时后加入到预培养的293ft细胞中。继续培养约72小时后，用i3多功能读板机检测每板各孔细胞的假病毒感染情况，从而判断克隆的中和活性。
[0057]
中和活性的阳性对照(pc)以相同体积细胞培养液代替克隆细胞上清，其余实验操作和其它实验组相同。加克隆细胞上清的实验组的检测数值越小，表明该克隆的中和活性越高。抗体中和试验中，若中和试验读值不大于50％pc对照组均值，则判断该克隆具有中和活性，否则判定为非中和活性。实验结果如表7所示。
[0058]
表7中和评价结果
[0059][0060]
表中读值293ft细胞被假病毒侵染后，激发绿色荧光的数值。结果表明，除20e10，22g8为非中和抗体，19b4，19c2，21e5,24d1为中和抗体。
[0061]
6.抗体的抗原表位检测
[0062]
对筛选出的4株中和抗体使用elisa竞争实验，分析这些中和抗体的抗原识别表位是否为中和优势表位。
[0063]
用hpv31 vlp包板，用梯度稀释的单克隆抗体与兔多克隆酶标抗体竞争，并设置不加单抗的非竞争对照组。计算竞争抑制率，以抑制率大于50％作为抑制标准。若单克隆抗体可以阻断兔多克隆抗体结合50％以上，则表明该单抗识别的是中和优势表位。
[0064]
计算抑制率＝(1
‑
实验组od/对照组od)
×
100％。
[0065]
计算抑制率及绘制不同单抗间抑制曲线。实验结果如下图1和表8所示。
[0066]
表8单抗与兔多抗阻断实验小结
[0067][0068]
结果表明，单抗19b4和19c2识别抗原优势表位，21e5和24d1识别vlp的非优势表位。
[0069]
综上所述，19c2和19b4的抗体纯化得率高，具有特异性,具有中和活性，并且识别抗原优势表位，是疫苗研发过程中所使用的抗体的最佳选择，作为进一步研究的对象。21e5和24d1也是中和活性且特异性抗体，但是均识别抗原的非优势表位，不是最佳选择。而20e10和22g8抗体不具有特异性，不具有中和活性，因此，不适合应用于疫苗的体外效力研究。其中19b4抗体的单细胞株的保藏号为cgmcc no：21416；19c2抗体的单细胞株的保藏号为cgmcc no：21417。
[0070]
实施例二、19b4和19c2抗体的鉴定
[0071]
1、抗体的构象表位鉴定
[0072]
各型的vlp蛋白通过碱变性和热变性处理，使之二级或三级结构破坏，一级结构保存。再与单克隆抗体进行反应，采用间接法elisa对其进行检测。通过本实验，不仅可以鉴定抗体对各型vlp的识别情况，还能鉴定该抗体是否是构象表位识别抗体。若蛋白质变性后与单抗反应的od450值明显降低，则证明该单抗为构象表位识别抗体，若变性后与单抗反应的od450值未有明显变化，则证明该单抗为线性表位识别抗体。
[0073]
实验步骤：vlp变性蛋白处理：0.2m碳酸钠，0.01m dtt，ph 10.6室温孵育30分钟后煮沸5分钟。将变性和未变性的vlp蛋白分别包被，进行间接elisa法检测，最后进行od450读数。检测结果如表9所示。
[0074]
表9构象表位检测
[0075][0076][0077]
结果表明，19b4和19c2克隆识别未变性hpv31 vlp的od450数值均大于2，为显著阳性结果，而识别变性hpv31 vlp的数值均小于2倍阴性值，为阴性结果。表明19b4和19c2单抗均为构象型识别单抗。这两株单抗除了识别未变性hpv31型vlp为阳性以外，与其它8型的未变性vlp的反应均为阴性，表明19b4和19c2均是特异的，构象表位单抗。
[0078]
2、抗体的亚型鉴定
[0079]
采用间接elisa法，使用抗小鼠各种igg亚型的抗体鉴定上述杂交瘤细胞产生的抗
体的igg亚型。结果如下表10所示。
[0080]
表10 19b4和19c2抗体的亚型鉴定
[0081][0082]
由上述结果可知，19b4和19c2均为κigg1型抗体。
[0083]
实施例三、应用19b4纯化抗体制备hpv31 vlp检测试剂
[0084]
应用elisa双抗体夹心法，进行了抗体的互相配对实验。本实施例确定以克隆19b4为包被抗体，用hrp标记克隆19c2作为检测抗体，确定了elisa检测方法。检测结果如表11所示。
[0085]
表11试剂盒的初步配对结果
[0086][0087][0088]
初步配对实验结果表明，用19b4包被，19c2
‑
hrp检测的配对组合信号更高，更适合用于elisa检测。故以此配对进一步开展elisa检测。
[0089]
检测方法：包被抗体19b4用ph 9.6的0.05mol/l的碳酸盐缓冲溶液稀释成10μg/ml，在酶标板的每孔加100μl，4℃下包被过夜，倾去包被液，用pbst洗涤2次，拍干，然后在每孔中加入200μl 3％的小牛血清白蛋白(bsa)，放入37℃恒温箱中封闭2小时后，用pbs洗涤1次，加入10％的蔗糖水溶液，室温保护1小时，拍干后经干燥后装铝箔袋抽真空后4℃保存。
[0090]
用辣根过氧化物酶标记19c2的抗体，得19c2
‑
hrp并保存。向酶标板中分别加入vlp样品100μl/孔，37℃孵育1.5小时，经洗板后再加入19c2
‑
hrp(0.5ug/ml)100μl/，37℃孵育1小时，经洗涤拍干后加入显色剂进行显色，37℃温育10min，加入终止液50μl/孔，用酶标仪450nm波长进行读数。
[0091]
试剂盒特异性试验：用上述建立的方法进行hpv15个型vlp的样品检测，vlp变性蛋白处理：0.2m碳酸钠，0.01m dtt，ph 10.6室温孵育30分钟后煮沸5分钟。96孔板每孔检测10ug/ml vlp 100ul。实验结果如下表12。结果表明，该试剂盒检测未变性hpv31 vlp信号良好，不识别变性的hpv31 vlp，并且与其它8型的hpv vlp无交叉。
[0092]
表12 elisa法检测hpv31 vlp特异性评价结果(od450)
[0093][0094]
因此，本实施例的试剂盒可以用于特异的检测具有生物活性的hpv31 vlp，在疫苗研发中，即使蛋白并未发生降解，只是因为构象变化引起的质量变化，通过elisa法就能够及时的体现od数值的变化，从而反应疫苗质量的变化。因此，可以广泛应用于hpv31疫苗研发。
[0095]
实施例四、克隆19b4和19c2的可变区序列测定
[0096]
将获得的19b4和19c2单克隆细胞分别提取mrna，反转录为cdna，使用可变区通用引物进行高保真pcr扩增，将pcr产物片段插入到t载体内进行dna序列测定，并将获得的序列翻译成蛋白质的氨基酸序列。将获得的序列进行比对后未显示有相同序列，说明所获得的序列为特异的序列。两个克隆的抗体相关序列如下：
[0097]
19b4重链的全长核苷酸序列如下(366bp)：
[0098]
gtgaagctgcagcagtcaggggctgagctggtgaggcctggggtctcagtgaagatttcctgcaagggttctggctacacattcactgattatgctatgcactgggtgaagcagagtcatgcaaagagtctagagtggattggagttatgagtacttactatgatgatgctaattacaaccagaagttcaagggcaaggccacaatgactgtagacaaatcctccagaacagcctatatggaacttgccagactgacatctgaggattctgccatctattactgtgcaaggggacccctgtatggtaactacgtcgactattctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca。
[0099]
19b4重链编码的氨基酸序列全长如下(122aa)：
[0100]
vqlqesgaelvrpgvsvkisckgsgytftdyamhwvkqshakslewigvmstyyddanynqkfkgkatmtvdkssrtaymelarltsedsaiyycargplygnyvdysmdywgqgttvtvss。
[0101]
按常规方法进行鉴定，可以得知，重链中：cdr1序列为：dyamh；cdr2序列为：vmstyyddanynqkfkg；cdr3序列为：gplygnyvdysmdy。
[0102]
其中，19b4轻链的全长核苷酸序列如下(336bp)：
[0103]
gatatccagctgacccagtctccactcactttgtcggttaccattggacaaccagcctccatctcttgcaagtcaagtcagagcctcttagatagtgatggaaagacatatttgaattggttgttacagaggccaggccagtct
ccaaagcgcctaatctatctggtgtctaaactggactctggagtccctgacaggttcactggcagtggatcagggacagatttcacactgcaaatcagcagagtggaggctgaggatttgggagtttattattgctggcaaggtacacattttcctcggacgttcggagcaggtaccaagctggagatcaaa。
[0104]
19b4轻链编码的氨基酸序列全长如下(122aa)：
[0105]
diqltqspltlsvtigqpasisckssqslldsdgktylnwllqrpgqspkrliylvskldsgvpdrftgsgsgtdftlqisrveaedlgvyycwqgthfprtfgagtkleik
[0106]
按常规方法进行鉴定，可以得知，轻链中：cdr1序列为：kssqslldsdgktyln；cdr2序列为：lvsklds；cdr3序列为：qgthfprt。
[0107]
19c2重链的全长核苷酸序列如下(354bp)：
[0108]
gtgcagctgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgcaccgtctcagggttctcattaaccggctatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgatatggggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcagcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccaggtactactgtgccatcggcggtagtagctattactatgctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca。
[0109]
19c2重链的全长氨基酸序列如下(118aa)：
[0110]
vqlqesgpglvapsqslsitctvsgfsltgygvnwvrqppgkglewlgmiwgdgstdynsalksrlsiskdnsksqvflk mnslqtddtaryycaiggssyyyamdywgqgttvtvss。
[0111]
按常规方法进行鉴定，可以得知，重链中：cdr1序列为：gygvn；cdr2序列为：miwgdgstdynsal；cdr3序列为：ggssyyyamdy。
[0112]
19c2l轻链的全长核苷酸序列如下(318bp)：
[0113]
gacattcagctgacccagtctccagcctccctatctgcatctgtgggagaaactgtcaccatcacatgtcgagcaagtgagaatatttacagttatttagcatggtatcagcagaaacagggaaaatctcctcagctcctggtctataatgcaaaaaccttagcagaaggtgtgccatcaaggttcagtggcagtggatcaggcacacagttttctctgaagatcaacagcctgcagcctgaagattttgggagttattactgtcaacatcattatggtactccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagatc。
[0114]
19c2重链的全长核苷酸序列如下(106aa)：
[0115]
diqltqspaslsasvgetvtitcraseniysylawyqqkqgkspqllvynaktlaegvpsrfsgsgsgtqfslkinslqp edfgsyycqhhygtpltfgagtklei。
[0116]
按常规方法进行鉴定，可以得知，轻链中：cdr1序列为：raseniysyla；cdr2序列为：naktlae；cdr3序列为：qhhygtplt。
[0117]
利用上述鉴定的序列，通过已知的抗体工程技术，可以制备各种基因工程抗体，例如嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体，双抗体等，并保留其所源自的单克隆抗体的生物学特性。