一种蚌类环境DNA宏条形码引物、鉴定方法及应用与流程

一种蚌类环境dna宏条形码引物、鉴定方法及应用
技术领域
1.本发明涉及分子生态学领域，具体涉及一种蚌类环境dna宏条形码引物、鉴定方法及应用。


背景技术：

2.蚌类属软体动物门(mollusca)、双壳纲(bivalvia)、蚌目(unionoida)，广泛分布于北美、欧亚大陆、中美洲、非洲和东南亚。蚌类是大型底栖动物，是生态系统中最重要的生物类群之一。作为食物链的一部分它们是小型动物如底层鱼类和一些鸟类的食物。作为滤食者，它们通过滤食营养物质、有机物和浮游生物来保持水质。它们在食物网中处于非常关键的位置，如果湖泊或是河流中的淡水双壳类消失将会引起一系列的生态问题。在最近的几十年中，全球蚌类种群密度和种类丰富程度等存在明显的下降，一些物种数量减少的速度超出了种群自我恢复能力的范围，以致一些物种濒临灭绝甚至灭绝。进入90年代全球范围内蚌类种群明显呈衰退趋势，且有学者认为蚌类是目前最受威胁的淡水生物类群。iucn濒危物种红色名录显示，蚌类是所有动物类群中灭绝数目最多的一类(version 2019
‑
3.http://www.iucnredlist.org)。
3.传统的调查方法即直接捕捉会破坏它们的生活环境及种群大小，造成二次伤害；当濒危物种种群数量较低时，数据不够准确；依赖于分类学知识和大量的人力、物力的投入，调查成本高；违背禁渔政策。对于蚌类来说，传统的采样技术不易采集，一些物种鉴定也有困难，原因在于它们存在于在高浊度或低能见度的生境、密度低、斑片状分布、与相近物种杂交以及潜在的隐藏种。传统的调查方法似乎是违背目前的禁渔政策的、低效的、选择性的、破坏性的、或者严格依赖于不断下降的分类专业知识。因此，亟需一种不违背目前政策的、高效率、低成本和高灵敏度的方法来监测和评估其生物多样性趋势。
4.环境dna宏条形码技术不仅提供了准确、快速的物种多样性监测手段，还颠覆了我们认识和解决环境问题的方式。环境dna(environmental dna，edna)指的是可以从环境样本(例如土壤、水样、空气)中提取的总dna，它不需要对任何目标生物体进行分离。宏条形码技术提供更为详细的物种组成信息，尤其是种以下水平的物种多样性，这些前所未有的信息将为我们重新审视环境问题提供契机。近年来，环境dna宏条形码技术已成功应用于鱼类和浮游动物等的生物多样性监测和群落结构研究。利用环境样本监测水生生物多样性的技术已有相关专利申请公开。中国专利申请201910216942.6公开了一种基于环境dna技术检测鱼类物种多样性的方法，包括取样、提取edna、pcr扩增、回收和纯化目的片段、构建目的片段文库、otu聚类、建立鱼类比对数据库、otus代表性序列与建立的鱼类数据库的数据信息进行比对分析，确定待测水域中鱼类的物种多样性组成。该专利申请方法取样简单，检测方便、快速、精度高，检测结果准确。本课题组前期研究成果[陈金萍等：鄱阳湖流域蚌类环境dna宏条形码引物的筛选验证]中公开了11对引物，在对蚌类进行普通pcr筛选引物时，8对引物不能稳定扩增出所有蚌，3对能够稳定扩增出所有蚌。
[0005]
上述方法也还存在一些缺陷，比如上述方法是针对鱼类鉴定技术领域，缺乏针对
蚌类一套基于蚌类的环境dna宏条形码技术的环境样采集样品处理提取edna pcr扩增基因测序物种注释的完整监测体系的构建。现有的用于蚌类环境dna宏条形码的引物监测的物种数不够多实用性较差，限制了它的应用。此外，参考数据库的完整性和质量直接决定了运用环境dna宏条形码技术进行物种鉴定的可靠性和准确度，因此，针对蚌类的环境dna宏条形码技术的数据库的需求日益迫切。


技术实现要素：

[0006]
基于现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种蚌类环境dna宏条形码引物，以及将上述引物用于蚌类群落结构研究的环境dna宏条形码鉴定方法和应用，本发明经过筛选优化适用于蚌类环境dna宏条形码的引物、构建数据库、准确鉴定蚌类物种，提供一种非侵入、灵敏、高效、准确的鉴定样品采集地蚌类物种多样性或如何更准确地对水生生态系统进行健康监测的方法。
[0007]
为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
[0008]
本发明一方面提供一种蚌类环境dna宏条形码引物，所述引物的名称为16spp300或者16spp147；
[0009]
其中，引物16spp300由seq id no：1所示上游引物和seq id no：2所示下游引物组成；
[0010]
引物16spp147由seq id no：3所示上游引物和seq id no：4所示下游引物组成。
[0011]
进一步地，所述引物的名称为16spp147，其由seq id no：3所示上游引物和seq id no：4所示下游引物组成。
[0012]
本发明另一方面提供一种用于蚌类群落结构研究的环境dna宏条形码鉴定方法，包括以下步骤：
[0013]
步骤(1)：蚌类环境dna宏条形码引物的筛选，得到上述引物；
[0014]
步骤(2)：蚌类环境dna宏条形码数据库构建；
[0015]
步骤(3)：根据蚌类群落所在水域的大小，设计采样点，采集水样；
[0016]
步骤(4)：将水样进行处理后，提取其中的总环境dna；
[0017]
步骤(5)：将总环境dna用步骤(1)筛选的引物进行pcr扩增；
[0018]
步骤(6)：高通量测序，out聚类与注释；
[0019]
步骤(7)：确定待测水域中蚌类的物种组成和群落结构。
[0020]
进一步地，步骤(2)所述蚌类环境dna宏条形码数据库构建包括以下过程：在genbank数据库上下载中国蚌类的线粒体基因组序列，包括母系和父系，若没有线粒体基因组序列的就下载16srrna线粒体片段，如果这两种都无，则提取该蚌的组织dna，并进行线粒体基因组序列测序。
[0021]
进一步地，步骤(3)所述水样采集的方法为：设置采样点，使用采水器在水下0.5
‑
1m处采集1l水样，做3次生物学重复，水样低温保存于无菌的广口瓶。
[0022]
进一步地，步骤(3)所述水域为鄱阳湖水域，鄱阳湖水域选自鄱阳湖通江水道、鄱阳湖主湖区、军山湖和青岚湖中至少一处。
[0023]
进一步地，步骤(4)中的水样处理方法为在24小时内用0.45μm的混合纤维素滤膜过滤，每次过滤前后，均对过滤器材进行消毒处理，避免交叉污染，且每次过滤设置1个阴性
对照。
[0024]
进一步地，所述pcr扩增的反应程序为：
[0025]
95℃下预变性2min；
[0026]
95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；
[0027]
72℃再延伸5min。
[0028]
进一步地，所述pcr扩增的反应体系为：
[0029]5×
fastpfu buffer 4μl，2.5mm dntps 2μl，fastpfu polymerase 0.4μl，5μm上游引物0.8μl，5μm下游引物0.8μl和dna模板10ng，去离子水补足总体积至20μl。
[0030]
进一步地，步骤(6)所述高通量测序，out聚类与注释包括：
[0031]
对原始数据的质量进行质控过滤，包括去除嵌合体，筛除拼接序列的overlap区允许的错配比率>0.2的序列，按照100％相似性对非重复序列(不含单序列)进行otu聚类；将otu代表序列与步骤(2)构建的蚌类环境dna宏条形码数据库进行比对、分类注释，并得到相应的otu丰度表。
[0032]
进一步地，步骤(7)所述蚌类物种组成的分析包括：
[0033]
去除比对到非蚌类的数据信息，筛选出比对至蚌类，且identity值≥97％，e
‑
value≤10
‑
10
的otu；将比对至同一物种的otu进行合并，若有otu无法比对至种水平，则往上一级如属、科等进行统计。
[0034]
进一步地，群落结构进行alpha多样性和beta多样性分析。
[0035]
采用本发明的用于蚌类群落结构研究的环境dna宏条形码鉴定方法，将环境dna的技术原理应用于调查研究，在获取水体中的环境时，只需在目标水体一定范围内进行水样的采集，与传统方法相比，不需要进行大量的捕捞作业，也不会伤害蚌类个体，不违背当前的“禁渔”政策。这样既可以节省大量的人力财力，也保护了蚌类的种群。在物种鉴定的时候，只需要用筛选好的特有引物进行扩增,然后进行测序，测序结果再与数据库中物种基因进行比对就可以来确定物种的种类。相对于传统的方法，不需要进行大量物种的形态学鉴定，省时省力且准确。在稀有物种的鉴定中，由于不需要依赖捕获的个体来确定物种的存在情况，其灵敏性和准确性得到很大的提高。该体系不会因为水生动物在于高浊度或低能见度的生境，并且蚌类种群密度低、斑片状分布、与相近物种杂交以及存在潜在的隐藏种、不易捕捞等问题的局限性而出现调查研究的障碍。因此，环境技术显示出了比较传统方法更为简单、快捷、灵敏和低成本的优点。在鉴定用的基因序列和引物的筛选过程中，也通过大量蚌类通用的比较，选择出了通用性和适用性良好、能够有效地达到鉴定目的的基因片段片段及其引物。采用的二代测序技术，能够在一个样品中获得几十万条序列，这样一个大规模的测序分析技术，效率远远要高于我们在常规捕捞方法时所获得的样品数，有利于统计和增加研究的精确性,同时降低了固定样品数下样品采集的成本。
[0036]
在本发明的另一方面，提供上述引物或者上述用于蚌类群落结构研究的环境dna宏条形码鉴定方法在蚌类生物多样性研究、蚌类濒危种和稀有种的监测、蚌类入侵物种的监测或蚌类生物量检测中的应用。
[0037]
进一步地，所述蚌类生物多样性研究包括蚌类物种组成和蚌类雄性物种鉴定研究。
[0038]
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：本发明无需捕捞蚌类，取样简单，不
违背当前政策；检测方便，无需进行蚌类形态鉴定；检测快速、精度高、结果准确。并可补充传统调查方法中难采到、濒危的蚌类动物丰度数据，且能鉴定雄性蚌类物种，有效提高了蚌类的鉴定水平、物种检测率及丰度评估准确度，是有效、可靠的蚌类群落结构调查新方法，具有实用价值。
附图说明
[0039]
图1使用引物16spp147扩增蚌类动物的结果(m:dna marker 500)；
[0040]
图2使用引物16spp300扩增蚌类动物的结果(m:dna marker 500)；
[0041]
图3采样图：其中，通江水道(1
‑
4)，主湖区(5
‑
11)，军山湖(12
‑
15)，青岚湖(16
‑
20)；
[0042]
图4鄱阳湖蚌类多样性指数；
[0043]
图5基于bray
‑
curtis距离矩阵的upgma样本层级聚类树；
[0044]
图6基于bray
‑
curtis距离矩阵的浮游生物群落的主坐标分析。
具体实施方式
[0045]
以下结合具体实施例对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐述本发明，而不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0046]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所诱导的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047]
实施例1：最为理想的蚌类环境dna宏条形码通用引物的筛选
[0048]
1)选择序列及设计引物
[0049]
选择线粒体16srrna基因全序列区段，设计产物为100
‑
300bp的通用引物2对，引物信息见表1：
[0050]
表1本专利设计的引物信息
[0051][0052]
2)普通pcr扩增筛选引物
[0053]
提取单个蚌类物种(共32种，为实验室积累样本，详见表2)的组织dna：取酒精固定的样本或
‑
80℃保存的样本的闭壳肌，使用蛋白酶k消化，试剂盒(genomic dna purification system)纯化，最后溶解于100μl灭菌双蒸水中。用设计的通用引物分别对这
30种蚌进行pcr测试，pcr反应条件：95℃预变性2min；95℃变性30s，退火(54～55℃)30s，72℃延伸30s，25个循环；72℃延伸5min；最后4℃保存。pcr反应体系(20μl)：5
×
fastpfu buffer4μl，2.5mm dntps 2μl，fastpfu polymerase 0.4μl，5μm上游引物0.8μl，5μm下游引物0.8μl和dna模板10ng，去离子水补足总体积至20μl。pcr反应所用的酶为high
‑
fidelity dna polymerase。选出可以同时扩增出这32种蚌且pcr产物长度、凝胶电泳条带清晰单一的引物对，并对pcr产物加以测序验证，确保为目的物种的序列。使用引物16spp147和16spp300扩增蚌科动物的结果如图1
‑
2所示(在图1
‑
2中，编号1
‑
32对应的蚌类名称如表2所示)。由图1
‑
2可知，引物16spp147和16spp300均能将这32个蚌类物种都扩增出来，扩增条带清晰明亮，且扩增产物大小符合预期大小。
[0054]
表2用于dna提取、pcr扩增所用的32个蚌科物种及高通量测序比对结果
[0055]
[0056][0057]
[0058]“ ”表示检测到该蚌；
“‑”
表示没有检测到.
[0059]
3)高通量测序验证筛选引物
[0060]
随机将这32种蚌类的dna混合，即每个蚌的dna各1μl装至1个管中，用上一步筛选出的引物进行高通量测序进一步筛选。对原液进行pcr扩增，pcr反应条件同上，pcr产物进行高通量测序，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物。然后采用illumina miseq测序平台进行测序，之后采用illumina公司的truseq nano dnalt library prep kit制备测序文库。最后对原始reads数进行整理过滤及质量评估，剔除嵌合体序列，如：1)5’端引物错配碱基数>1的序列；
[0061]
2)含有连续相同碱基数>8的序列等。产生的可操作性分类单元(operational taxonomic units，otus)通过blast在ncbi数据库中查找蚌科物种同源序列，以100％的序列相似度作为otu划分阈值，该阈值大致相当于分类学中物种(species)水平的序列差异。且e_value(e值)<1
×
10
‑
10
作为该序列的物种注释信息结果参见表2。
[0062]
由表2可知，引物16spp147的扩增产物注释到32种蚌，该引物辨识度达100％，且无假阳性。引物16spp300的扩增产物注释到26种蚌，该引物辨识度达81％，也无假阳性。
[0063]
4)水样高通量测序验证筛选出的引物
[0064]
对鄱阳湖的4个样点的水样用高通量筛选出的引物进行验证。在鄱阳湖进行水样采集，每个点用采水器采集1l表层水样于无菌广口瓶中，并做3次重复，并在相应采样点同时进行传统方法采集蚌(蚌耙采蚌)，水样和蚌的采集都在渔船上进行，采集活体蚌之后，当天返回实验室进行鉴定。
[0065]
水样于采集后24h内用0.45μm的混合纤维素滤膜过滤。每次过滤前后，均对实验器材进行消毒清洗，避免交叉污染。每次过滤设置1个阴性对照。过滤装置为(天津)津腾/jinteng玻璃砂芯过滤装置(溶剂过滤器)，容量为2000ml，rocker300无油真空泵，使用dneasy blood&tissue kit(qiagen)提取环境dna。qubit(thermo fisher scientific)测试dna浓度后进行pcr扩增。pcr反应程序为：95℃下预变性2min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；72℃再延伸5min；pcr反应体系为：5
×
fastpfu buffer 4μl，2.5mm dntps2μl，fastpfu polymerase 0.4μl，5μm上游引物0.8μl，5μm下游引物0.8μl和dna模板10ng，去离子水补足总体积至20μl；10℃保存。由上海派森诺生物科技股份有限公司进行高通量测序。质控步骤与上文一致。测序结果在ncbi数据库和本地数据库中进行比对验证，以97％的序列相似度，且e_value(e值<1
×
10
‑
10
)最小的，作为该序列的物种注释信息(因为e值越小准确度越高，可信度也越高)。在物种注释中，对于reads<3的otu不作统计，结果见表3。
[0066]
表3环境dna方法与传统方法的比较
[0067][0068]
由表3可知，16spp147检测到14个物种，16spp300检测到9个物种，传统方法采集到7个物种。16spp147引物检测到的物种涵盖了传统方法检测到的7个物种，16spp300引物与传统方法共同注释到4个物种，仅由16spp300引物检测到5种蚌，仅由传统方法检测到3种蚌。16spp147和16spp300引物的测序结果表明，16spp147引物检测到的物种更多，覆盖了传统方法检测到7种蚌，且检测到濒危种
‑
角月丽蚌，国家二级保护动物
‑
龙骨蛏蚌，表明本发明的环境dna宏条形码对濒危物种具有一定的敏感度。
[0069]
5)本地数据库构建
[0070]
蚌科动物线粒体的遗传不单单是母系遗传，还存在线粒体基因组遗传的一种特例即双单亲遗传现象。这种遗传方式使后代中雌性线粒体dna只来自母系(female
‑
transmitted,f type)，与严格的母系遗传相似；而雄性的线粒体dna来自双亲，在雄性的体细胞中存在f型线粒体dna，在精巢中存在父系线粒体dna(male
‑
transmitted,m type)。所以在构建蚌类环境dna宏条形码数据库时要考虑其双单亲遗传的特性。基本过程是：在genbank数据库上下载中国蚌类的线粒体基因组序列，包括母系和父系，若没有线粒体基因组序列的就下载16srrna线粒体片段，如果这两种都无，则提取该蚌的组织dna，并进行线粒体基因组序列测序。构建本地库之后，将otu代表序列比对到本地数据库，设置比对参数
identity≥97％，e_value(e值)<1
×
10
‑
10
，最后得到otu注释结果。
[0071]
表4蚌的线粒体基因本地库
[0072]
[0073]
[0074][0075]
注：f表示母系，m表示父系。
[0076]
实施例2：基于环境dna宏条形码的鄱阳湖蚌类多样性研究
[0077]
1)环境dna样品采集、过滤
[0078]
于2019年4月在鄱阳湖水域进行样品采集，共设置4个采样区(包括通江水道、主湖区、军山湖和青岚湖)，20个采样点，采样图参见图3，使用采水器在水下大约0.5
‑
1m处采集1l水样，做3次生物学重复，水样低温保存于无菌的广口瓶，并24小时内用0.45μm的混合纤维素滤膜过滤，每次过滤前后，均对过滤器材进行消毒处理，避免交叉污染。每次过滤设置1个阴性对照。采集水样的同时，用自制蚌耙进行传统方法采集蚌，应用形态特征进行蚌类物种鉴定。水样过滤方法同实施例1中的水样dna过滤方法。
[0079]
2)环境dna提取和pcr扩增
[0080]
使用试剂盒qiagen dneasy blood&tissue kit提取滤膜dna，提取步骤做了适当优化，如最后用60μl elution buffer洗脱dna，保存于
‑
20℃。用qubit(thermo fisher scientific)测试dna浓度。
[0081]
pcr扩增使用实施例1筛选出来的引物16spp147进行，反应体系和扩增程序见表5和表6。
[0082]
表5 pcr扩增反应程序
[0083][0084]
表6 pcr反应体系
[0085][0086]
2％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，用axyprep dnagel extraction kit(axygen biosciences,u.s.)按照说明纯化产物。
[0087]
3)文库构建和测序
[0088]
纯化后的pcr产物用(life invitrogen)进行定量，每24个条形码不同的扩增子均匀混合。根据illumina基因组dna文库的制备程序，将汇集的dna产物用于构建illumina基因组dna文库。扩增子文库在illumina miseq平台(上海biozeron co.，ltd)上按照标准协议进行配对端测序(2
×
250)。原始reads被存入ncbi sequence read archive(sra)数据库。测序由凌恩生物科技有限公司完成。
[0089]
4)otu聚类和物种注释
[0090]
数据下机后，对原始数据的质量进行质控过滤，包括去除嵌合体，筛除拼接序列的overlap区允许的错配比率>0.2的序列等。按照100％相似性对非重复序列(不含单序列)进行otu聚类。将otu代表序列与根据权利要求1所述步骤(2)构建的蚌类环境dna宏条形码数据库进行比对、分类注释，并得到相应的otu丰度表。
[0091]
5)数据分析
[0092]
蚌类物种组成分析：去除比对到非蚌类(如细菌、鸟类、两栖类、哺乳类等)的数据信息。筛选出比对至蚌类，且identity值≥97％，e
‑
value≤10
‑
10
的otu；将比对至同一物种的otu进行合并，若有otu无法比对至种水平，则往上一级如属、科等进行统计，结果见表7，
环境dna鉴定的蚌类f型和m型reads数结果见表8。
[0093]
表7环境dna方法与传统方法鉴定到的蚌类物种比较
[0094][0095][0096]
注：tj表示通江水道，ml表示主湖区，js表示军山湖，ql表示青岚湖，下同
[0097]
由表7可知，环境dna方法共监测到24种蚌，通江水道监测到23种蚌，主湖区监测到19种蚌，军山湖监测到17种蚌，青岚湖监测到20种蚌。洞穴丽蚌、角月丽蚌、背瘤丽蚌、中国尖嵴蚌、背角无齿蚌、蚶形无齿蚌、褶纹冠蚌、鱼尾楔蚌、龙骨蛏蚌、橄榄蛏蚌、扭状矛蚌、圆顶珠蚌、尖锄蚌这13种蚌在所在生境均监测到。三型矛蚌、射线裂脊蚌、棘裂脊蚌只在通江水道生境监测到。
[0098]
与传统方法进行比较，发现edna分析的物种检出率更高。表明该方法在野外水体中监测蚌类多样性具有一定的可行性和有效性。环境dna宏条形码监测的蚌类物种数，通江水道>青岚湖>主湖区>军山湖，主湖区监测到的蚌类不多，原因在于，其为湖心区，受风流影响大，底质主要为泥沙，部分样点底质为硬泥，所以主湖区的蚌类物种数量低于其他生境。
[0099]
环境dna注释到的蚌类物种中，丰度最高的是橄榄蛏蚌(38.09％)，其次是背角无齿蚌(23.36％)。在通江水道，监测到丰度高的蚌类有背角无齿蚌、中国尖嵴蚌、洞穴丽蚌、橄榄蛏蚌和圆顶珠蚌；主湖区，丰度高的蚌类有橄榄蛏蚌、扭形矛蚌和鱼尾楔蚌；在军山湖，
丰度高的蚌类有鱼尾楔蚌、圆顶珠蚌、褶纹冠蚌和河蚬；在青岚湖，丰度高的蚌类有背角无齿蚌、洞穴丽蚌、圆顶珠蚌、扭形矛蚌、褶纹冠蚌和角月丽蚌。
[0100]
表8环境dna鉴定的蚌类f型和m型reads数
[0101][0102]
由表8可知，环境dna鉴定的蚌类f型和m型reads数相差很大，总得来说，f型远少于m型，除了橄榄蛏蚌、背瘤丽蚌、三角帆蚌这三种蚌。
[0103]
本发明的数据库中有的物种有f型与m型，有的物种只有f型，所以有的能监测到m型，有的不会。本发明鉴定到的蚌类的f型与m型，m型数量很高，因为本发明在春季采样，大多数蚌类的繁殖期在春夏季节(4
‑
8月)，雄性会排出成熟精子到水中，雌蚌从水中滤食浮游生物，并会收集到排出的精子。所以水样中检测的雄性较多，如背角无齿蚌在3月
‑
4月初，圆顶珠蚌3月
‑
4月，鱼尾楔蚌4月
‑
6月等。三角帆蚌、背瘤丽蚌、橄榄蛏蚌这三种蚌雌性reads数多于雄性。三角帆蚌繁殖期在5月，本发明采样在4月，精子还未在水中释放，导致环境dna监测到的三角帆蚌雄性reads少于雌性；有研究证明，背瘤丽蚌总体来看处于雌性比雄性多的生长状态。橄榄蛏蚌在5
‑
6月进入繁殖期，大量排精，在鳃腔育儿囊中完成受精并发育成钩介幼虫，且橄榄蛏蚌一年繁殖一次，本发明采样在4月，所以在水中监测到的雄性少。
[0104]
有些环境dna研究会出现1个otu比对到多个物种，且identity值以及相关参数结果均没有明显差别，无法鉴定到某一个物种的情况。如陈世静(2020)研究发现有的otu可比对到罗非鱼属中的多种鱼类，无法鉴定到种；yamamoto等(2017)利用“mi fish
‑
u”引物监测海湾水域鱼类物种多样性时，对平鲉属和东方鲀属鱼类也无法进一步在种水平区分；kelly等(2014)利用通用引物“12s
‑
v5”检测水族箱中的鱼类组成时，检测到的最高分辨率也只能到属或科水平等。本发明没有出现这种情况，表明本发明的16spp147引物具有良好的特异性，即可以区分某些属中亲缘关系相近的物种。数据库在分类注释中尤为重要，是所有数据处理的基础，本发明建立了本地的蚌类数据库，比ncbi线上数据库更全面准确，因为线上数据库有未更新的序列，并且本地blast程序方便快捷，所以这也是本次研究较为成功的原因之一。引物的筛选设计也非常重要，因为这直接关系到物种注释结果。本发明设计筛选的蚌类环境dna宏条形码引物应用于鄱阳湖水体中，经检验分析，该引物能有效鉴定出水体中的蚌类，可以满足水样中环境dna应用研究的需求，为今后的蚌类研究提供了新的技术手段，对探讨水体中蚌类种群组成、群落结构和生物多样性具有重要的应用价值。
[0105]
6)蚌类群落结构分析
[0106]
(1)alpha多样性分析
[0107]
生物多样性指数分析：alpha多样性可以反映生物群落的丰度和多样性，包括一系
列统计学分析指数估计环境群落的物种丰度和多样性。常用指数有，chao1：用chao1算法估计样本中所含otu数目的指数，chao1在生态学中常用来估计物种总数，由chao(1984)最早提出。simpson：用来估算生物多样性指数之一，由edward hugh simpson(1949)提出，在生态学中常用来定量描述一个区域的生物多样性。simpson指数值越大，说明群落多样性越高。shannon：用来估算样本中生物多样性指数之一。它与simpson多样性指数常用于反映alpha多样性指数。shannon值越大，说明群落多样性越高。
[0108]
chao1指数
[0109][0110]
simpson指数
[0111]
dsimpson＝1
‑
∑p
i2
ꢀꢀꢀ
(3.2)
[0112]
shannon
‑
wiener指数：
[0113][0114]
pielou指数：
[0115][0116]
其中，s
chao1
＝估计的otu数；s
obs
＝实际观测到的otu数；f1和f2分别表示singletons(仅含有一条read的otu数)和doubletons(仅含有两条reads的otu数)的数目，ni＝第i个otu所含的序列数；n＝所有序列数；pi＝第i个otu序列数占所有序列数的比值。结果见表9和图4：
[0117]
表9鄱阳湖蚌类多样性指数
[0118]
[0119][0120]
由表9可知，鄱阳湖蚌类多样性指数如下：chao1丰富度指数平均为619.1(变幅10
‑
1609)，shannon
‑
weiner多样性指数平均为2.12(变幅0.22
‑
3.64)，simpson指数平均值为0.65(变幅为(0.07
‑
0.91)，pielou均匀度指数0.39(0.07
‑
0.73)。
[0121]
由图4可知，空间上，chao1指数，通江水道平均最高(838.75)，青岚湖次之(770.6)，主湖区最低(460.14)，无显著性差异；shannon
‑
weiner多样性指数，青岚湖平均最高(2.55)，军山湖次之(2.26)，主湖区最低(1.71)，无显著性差异；simpson指数，青岚湖平均最高(0.80)，通江水道次之(0.38)，青岚湖最低(0.20)，军山湖和青岚湖有显著性差异；pielou均匀度指数，青岚湖平均最高(0.46)，军山湖次之(0.40)，通江水道最低(0.33)。
[0122]
通江水道的chao1丰富度指数最高，说明其生物多样性高，种群丰富，鄱阳湖的通道水道大型底栖动物平均密度最高，双壳纲和腹足纲的密度和生物量较高。主湖区的chao1丰富度指数、shannon
‑
weiner多样性指数平均都最低，说明主湖区的蚌类多样性指数低。青岚湖的simpson指数和pielou均匀度指数都最高，说明青岚湖的蚌类多样性高且物种均一性高。因为青岚湖人工放养了鱼苗，如鳙、鲢、黄颡鱼等，而蚌类产下的钩介幼虫需要寄生在上述鱼类身上才继续发育，所以青岚湖的蚌类多样性高；青岚湖区大型水生植被丰富，底质主要为淤泥并含大量植物碎屑，适合蚌类生存。
[0123]
(2)beta多样性分析
[0124]
beta多样性分析主要通过聚类分析、主坐标分析(pcoa)两种方法，对群落数据结构进行自然分解并通过对样本排序，从而观测样本之间的差异。
[0125]
本发明对鄱阳湖的20个样本，基于蚌类丰度进行标准化转换后，采用最小连接法进行了upgma层级聚类分析。结果见图5所示，显示分成两支，军山湖大部分样点聚成一支，通江水道、主湖区和青岚湖聚成一支。各个样点比较零散。
[0126]
对tj、ml、js和ql四组样本(每个样本的所有样点均展示)在otu水平进行pcoa分析，结果见图6所示。横纵坐标上的刻度表示相对距离，无实际意义。横纵坐标轴pc1和pc2对样本组成差异的解释度分别为22.84％、9.29％。分组样本间整体有差异性且极显著(r2＝0.25，p＝0.002)。由分析图中可以看出ml和js样本点距离较远，表明两组样本的物种组成具有一定的差异，进一步的adonis分析也表明ml和js之间群落组成有显著性差异(r2＝0.17，p<0.05)；tj和js样本点距离近，有重叠区域，但通过adonis分析则表明tj和js之间群落组成仍有显著性差异(r2＝0.19，p<0.05)；ml和ql之间虽有部分重叠区域，但样本点的分布相对零散，通过adonis分析表明ml和ql之间群落组成有极显著性差异(r2＝0.21，p<0.01)；js和ql的样本点距离较远，adonis分析表明群落组成有显著性差异(r2＝0.24，p<
0.05)。基于环境dna宏条形码技术监测得到的鄱阳湖蚌类在生境之间具有显著的差异性。通江水道和主湖区没有显著性差异。
[0127]
pcoa分析表明主湖区和军山湖、通江水道和军山湖、主湖区和ql、军山湖和青岚湖各自都有显著性差异，说明各个生境的蚌类群落组成不一致，各生境特点明显，首先军山湖与青岚湖、主湖区三个生境的群落结构两两之间具有较大差异，聚类数也显示军山湖与其他生境差异较大，这可能是因为，其一，军山湖为养殖湖泊，但经过长达十年的生态修复，水质、生物多样性等均比其他两个生境更好，水体清澈，此外，军山湖区有斑块分布的水草，底质稳定，是蚌偏好的生境类型，相关文献中也证明底质越稳定越有利于底栖动物(包括蚌类)生存；青岚湖水体浑浊，水质差。其二，军山湖的沉积物类型为淤泥，青岚湖的沉积物类型为淤泥、沙质、泥沙，主湖区的沉积物类型为硬泥、泥沙、淤泥。通江水道与军山湖有显著性差异，因为它们各自的地理位置，通江水道与长江连通，与长江物种能量交换频繁，军山湖是阻隔湖泊，所以它们的蚌类物种组成不同。通江水道和主湖区没有显著性差异，因为它们为连通湖泊，所以群落结构差异不大。
[0128]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。