尿液miR-548q在多发性骨髓瘤疾病中的应用的制作方法

尿液mir-548q在多发性骨髓瘤疾病中的应用
技术领域
1.本发明涉及尿液mir-548q的新用途，具体涉及尿液mir-548q在制备用于多发性骨髓瘤相关检测制剂中的应用。


背景技术：

2.多发性骨髓瘤（multiple myeloma, mm）属于b细胞恶性肿瘤，临床表现与多种因素有关，例如肿瘤压迫脊髓，细胞因子导致贫血，骨损伤引起疼痛，蛋白沉积肾脏导致肾损伤等。尿常规检测出现尿蛋白、红细胞、白细胞、管型，甚至出现慢性肾功能衰竭、高磷酸血症、高钙血症、高尿酸血症等，患者经常首诊于肾内科而贻误了治疗时间。因此寻找更为有效、无创的诊断指标有助于肿瘤的早期诊断和监测。
3.mirna是一类小非编码单链rna，约22个碱基长度。自1990年发现以来，已发现人类存在的mirna约有2500种。mirna参与了多种疾病的生理及病理过程，包括细胞分化、血管生成、凋亡、肿瘤发展、转移、药物抵抗等。识别mirna表达改变具有重要价值，如果将mirna的特定特征与正常生理病理状态相结合，可有望作为疾病早期标志物或疾病严重程度的生物标记物。
4.越来越多的研究证明mirnas参与了mm的发生、发展，它们不仅可用于mm诊断，还可用于疾病分层、预后评估及疗效判断。人类mir-548基因家族成员目前已知有80个。mir58q在肾细胞癌过度表达，通过阻断ilt2，增强nk细胞介导的hla-g依赖性细胞毒性，控制免疫效应细胞活性。此外，mir-548q在鼻咽癌诊断中发挥关键作用。本研究中结果显示mir-548q靶基因8个，分别参与mapk、ras、pi3k-akt、hippo 等信号通路，这些信号通路失调与癌症，包括mm的发生有关。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种尿液mir-548q在制备用于多发性骨髓瘤相关检测制剂中的应用。
6.优选地，所述尿液mir-548q的核苷酸序列如seq id no.1所示（ccgccauuac uuuugc）。
7.优选地，所述尿液mir-548q在多发性骨髓瘤患者中低表达。
8.优选地，所述制剂为多发性骨髓瘤患者尿液mir-548q检测试剂盒。
9.优选地，所述试剂盒包括反转录系统、扩增系统和定量内参标准化系统，其中，所述扩增系统由实时荧光定量pcr反应体系组成，所述实时荧光定量pcr反应体系包含能够与mir-548q反转录产物特异性结合的扩增引物、cdna、rnase-free水和sybr green聚合酶链式反应体系。
10.优选地，所述反转录系统由反转录体系试剂组成，其中，所述反转录体系试剂包括逆转录酶缓冲液、逆转录引物、逆转录酶。
11.优选地，所述定量内参标准化系统由内参引物组成。
12.发明人首先收集了正常健康体检组和多发性骨髓瘤患者的尿液标本，离心后取上清，采用mirneasy kit试剂盒提取rna，使用agilent human, release 21.0 (8*60k, design id: 070156)分析mm和正常对照组mirna差异表达， feature extraction software (version10.7.1.1, agilent technologies)获取图像和原始数据，genespring software (version 13.1, agilent technologies)进行分析。采用层次聚类的方法来显示样本间可区分的mirna表达模式，利用mirwalk 3.0和mirdb 6.0数据库，对筛选出的差异mirna进行靶基因预测。用student's t检验计算fold change和p值，筛选差异表达的mirnas。上调和下调基因的阈值设置为fold change >2.0，p<0.05具有统计学意义。
13.本发明通过研究证实与正常对照组相比，尿液mir-548q在多发性骨髓瘤患者的尿液中低表达，并在mm初诊组、复发组、缓解组均较正常对照显著减低。
14.roc曲线分析显示mir-548q产生的auc分别为0.924 (p = 0.000, 95% ci: 0.820-1.000)。从而提出检测尿液mir-548q可用于多发性骨髓瘤疾病的检测、监测或辅助诊断。
15.进一步，发明人将mir-548q与临床参数进行相关性分析，包括血红蛋白 (hemoglobin, hb), 血小板 (thrombocytes, plt)、白蛋白(albumin, alb)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, ldh)、血肌酐(creatinine, cr)、尿酸、血β2-微球 (β2-microglobulin, β2-mg)、c反应蛋白 (c-reactive protein, crp)、免疫球蛋白igg (immune globulin, igg)、免疫球蛋白 (igg iga igm) 和尿轻链（κ λ）。mm 患者, mir-548q与alb正相关 (r = 0.492 p = 0.009)，与尿轻链（κ λ）负相关 (r =
ꢀ-
0.469 p = 0.016)，与hb、plt、ldh、cr、β2-mg、igg、crp、免疫球蛋白 (igg iga igm) 不相关 (p > 0.05)。
16.本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测白蛋白及其多肽片段。
17.为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
18.图1是agilent芯片技术分析mm患者尿液差异mirna表达谱。
19.图2是qrt-pcr分析mir-548q在正常对照组、mm初诊组、复发组、缓解组患者尿液样本之间的差异表达。
20.图3是roc曲线分析mir-548q在mm中的诊断价值。
21.图4是 mm患者尿液中mir-548q与血清alb的相关性分析。
22.图5是mm患者尿液中mir-548q与尿轻链（κ λ）的相关性分析。
具体实施方式
23.实施例1 尿液标本的收集与处理收集2017-2019年首都医科大学附属北京世纪坛医院住院的多发性骨髓瘤mm）病例，其诊断分别符合美国国立综合癌症网络（nccn）标准。正常对照组（hc）为健康体检者。尿液收集后，400
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g离心5min，取上清，rnase-free管分装，-80℃冻存。研究对象的临床特征见表1
(a)聚合酶(neb, m0276l)，将poly (a) tail添加到rna的3 '端。加入引物和逆转录酶(vazyme r223-01)，用1μg总rna合成循环dna合成第一链，snrna u6做内参。mirna的相对表达量用2-δct.计算，表达倍数用2-δδct.计算。
27.发明人采用qrt-pcr技术，在27例mm（包括初诊12例、复发6例、缓解9例），12例正常对照者中对筛选出的mirna进行验证。与正常对照相比，mir-548q在mm初诊组、复发组、缓解组均较正常对照显著减低（p < 0.05），但是各组间无显著差异（p > 0.05）。
28.进一步，发明人检测了mm和正常对照者尿液中mir-548q的表达，建立roc曲线，曲线下面积为0.778，如图3所示，反应尿液mir-548q的灵敏度和特异度均较好。
29.实施例4 mir-548q与临床参数的相关性分析mir-548q与临床参数进行相关性分析，包括血红蛋白 (hemoglobin, hb), 血小板 (thrombocytes, plt)、白蛋白(albumin, alb)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, ldh)、血肌酐(creatinine, cr)、尿酸、血β2-微球 (β2-microglobulin, β2-mg)、c反应蛋白 (c-reactive protein, crp)、免疫球蛋白igg (immune globulin, igg)、免疫球蛋白 (igg iga igm) 和尿轻链（κ λ）。mm 患者, mir-548q与alb正相关 (r = 0.492 p = 0.009)，与尿轻链（κ λ）负相关 (r =
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0.469 p = 0.016)，与hb、plt、ldh、cr、β2-mg、igg、crp、免疫球蛋白 (igg iga igm) 不相关 (p > 0.05)。
30.虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。