一种合成含有二硫键和/或巯基修饰的多肽核酸偶联物的方法与流程

1.本发明涉及生物分子合成领域，具体涉及含二硫键和/或巯基修饰的多肽核酸偶联物的合成方法。


背景技术：

2.多肽核酸偶联物是指一类通过共价键的方式将多肽单元与核酸单元偶联起来的分子嵌合体。这类化合物可以同时整合核酸与多肽的生物化学性质。例如，反义核酸类药物可以通过碱基互补配对的特异性的降解错误的mrna达到从基因层面的调控。然而核酸本身带有负电荷，难以穿过细胞膜。通过偶联上穿膜多肽(cpp)序列可以有效的进行目的核酸序列的细胞内递送。除此以外，多肽核酸偶联物在以下方面均有广泛的应用，(1)形成功能性生物材料；(2)杂交形成自组装系统；(3)形成以dna纳米结构为框架的多肽展示等。
3.多肽核酸偶联物的合成方法相对比较固定，一般分为两种。(1)“一步法”合成。具体地，利用多肽和核酸的固相合成方法，在固相载体上先合成目的多肽，完成后再接linker并进行后续核酸的合成。在完成全部序列的合成后，从载体上切除，脱保护，纯化。“一步法”的优势在于可以通过自动化的流程完成偶联物的合成。但是难点在于多肽与核酸合成一般不兼容，序列的选择会有限制，同时还需要开发新的兼容性保护基团。(2)“两步法”合成。具体地，先通过固相合成方法分别合成多肽及核酸序列，然后使用兼容多肽和核酸的偶联方法在溶液中将这两个单元共价结合起来。“两步法”虽然过程相对繁琐，但是由于兼容性良好，应用更为广泛。
4.两步法中使用的偶联反应一般也分为两种。(1)基于smcc(4
‑
(n
‑
马来酰亚胺基甲基)环己烷
‑1‑
羧酸琥珀酰亚胺酯)类似偶联试剂，将氨基修饰的核酸和含有巯基(半胱氨酸)修饰的多肽共价结合。(2)基于端炔和叠氮的化学点击反应。第一种方法无法偶联含有二硫键及含有巯基修饰的多肽，因为在有二硫键存在时用于修饰而额外引入的巯基会发生巯基交换反应从而破坏原有的二硫键；而如果原有序列含有巯基，额外引入巯基后进行的修饰反应没有选择性，会得到混合物。第二种方法虽然普适性更好，但是原料价格较为昂贵。


技术实现要素：

5.为解决含有二硫键和/或巯基修饰的多肽与核酸偶联的问题，本发明提出了一种基于巯基和马来酰亚胺基团反应的多肽与核酸偶联方法(如图1所示)，在维持低成本的同时，完成含有二硫键和/或巯基修饰多肽的偶联反应。同时和之前报导的类似方法相比，巯基核酸二硫键偶联产物和琥珀酰亚胺水解产物等反应副产物更少，转化率更高。
6.本发明一方面提供了一种合成多肽核酸偶联物的方法，所述方法通过多肽连接的马来酰亚胺基团与核酸连接的巯基反应使多肽与核酸偶联得到所述多肽核酸偶联物，其中，所述多肽含有巯基和/或二硫键，所述偶联反应在包含磷酸盐缓冲液的溶液中进行。
7.在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的ph值为6.2
‑
8.0。在一些优选实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的ph值为6.8
‑
7.6。在一些更优选的实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的ph值为6.8。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液浓度为10
‑
200mm。在一些优选实施方案中，所述磷酸盐缓冲液浓度为50
‑
150mm。在一些更优选的实施方案中，所述磷酸盐缓冲液浓度为100mm。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液选自磷酸氢钠、三乙基胺醋酸盐、磷酸氢钾或者pbs缓冲液。在一个具体实施方案中，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢钾缓冲液。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液为ph值6.8
‑
7.6，浓度50
‑
150mm的磷酸氢钾缓冲液。在一个具体实施方案中，所述磷酸盐缓冲液为ph值6.8，浓度100mm的磷酸氢钾缓冲液。本发明中所述磷酸缓冲液溶解所述连接巯基的核酸，并提供偶联反应所需的溶液。
8.本发明中所述多肽包含一个或多个氨基酸残基，特别是包含半胱氨酸残基或修饰的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述多肽是指包含1
‑
15个氨基酸残基的多肽。在另一些实施方案中，所述多肽是指包含2
‑
10个氨基酸残基的多肽。在一个具体实施方案中，所述所述多肽是指包含7个氨基酸残基的多肽。在另一个具体实施方案中，所述多肽是指包含8个氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，所述多肽通过n端或者氨基酸残基侧链的氨基来连接马来酰亚胺基团。在一些实施方案中，所述多肽通过n端连接马来酰亚胺基团。在一些实施方案中，所述多肽通过lys侧链的氨基连接马来酰亚胺基团。在一些实施方案中，所述多肽连接的马来酰亚胺基团选自马来酰亚胺基丙酸、马来酰亚胺基己酸、甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺或者4
‑
(n
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐。在一个具体实施例中，所述马来酰亚胺基团为马来酰亚胺基丙酸。
9.在一些实施方案中所述马来酰亚胺基团和肽链之间可选择地包含c6(
‑
(ch2)6‑
)、c3(
‑
(ch2)3‑
)、甲基环己烷或者聚乙二醇连接基团。
10.在一些实施方案中，所述多肽与核酸的偶联反应中多肽反应物当量为2.5
‑
25e.q.。在一些优选实施方案中，所述多肽反应物当量为5
‑
20e.q.。在一些更优选的实施方案中，所述多肽反应物当量为10
‑
20e.q.。在一个具体实施方案中，所述多肽反应当量为10e.q.。在另一个具体实施方案中，所述多肽反应当量为20e.q.。
11.在一些实施方案中，所述多肽和核酸的偶联反应中多肽反应物浓度为5
‑
25mm。在一些优选实施方案中，所述多肽反应物浓度为10
‑
20mm。在一些具体实施方案中，所述多肽反应物浓度为5mm。在另一个具体实施方案中，所述多肽反应物浓度为10mm。在一些具体实施方案中，所述多肽反应物浓度为20mm。
12.在一些实施方案中，所述多肽和核酸的偶联反应中多肽反应当量为5
‑
20e.q.，所述多肽反应物浓度为2.5
‑
25mm。在一些优选地实施方案中，所述多肽和核酸的偶联反应中多肽反应当量为10
‑
20e.q.，所述多肽反应物浓度为5
‑
20mm。在一些具体实施方案中，所述多肽和核酸的偶联反应中多肽反应当量为10e.q.，所述多肽反应物浓度为5mm。在另一些具体实施方案中，所述多肽和核酸的偶联反应中多肽反应当量为20e.q.，所述多肽反应物浓度为5mm。在一些具体实施方案中，所述多肽和核酸的偶联反应中多肽反应当量为20e.q.，所述多肽反应物浓度为10mm。在另一个具体实施方案中，所述多肽和核酸的偶联反应中多肽反应当量为20e.q.，所述多肽反应物浓度为20mm。
13.在一些实施方案中，所述多肽溶解于dmso、dmf或者乙腈中进行偶联反应。在一个具体的实施方案中，所述多肽溶解于dmso中进行偶联反应。
14.在一些实施方案中，所述多肽和核酸的偶联反应在4℃
‑
45℃恒温反应2h
‑
24h。在一些优选实施方案中，所述多肽和核酸的偶联反应在25℃
‑
40℃恒温反应3
‑
12h。在一些更优选的实施方案中，所述多肽和核酸的偶联反应在37℃恒温反应过夜。
15.在一些实施方案中，所述核酸连接的巯基是通过还原核酸二硫键保护基团后得到的。本发明中所述核酸可选自dna、rna或pna(肽核酸)。所述核酸连接巯基通常是指在核酸的3’或者5’端连接巯基，核酸连接的巯基是通过还原3’或者5’端巯基保护基团得到的。在一些实施方案中，3’或者5’端巯基保护基团可选自c6
‑
s
‑
s(
‑
(ch2)6‑
s
‑
s
‑
)或者c3
‑
s
‑
s(
‑
(ch2)3‑
s
‑
s
‑
)。在一个实施方案中，5’端巯基保护基团为c6
‑
s
‑
s。在一个具体的实施方案中，所述核酸连接巯基是指在核酸的5’端连接巯基，核酸连接的巯基是通过还原5’端巯基保护基团c6
‑
s
‑
s得到的。
16.本发明具体提供了一种合成含二硫键和/或巯基修饰的多肽核酸偶联物的方法，所述方法包括：
17.(1)将连接巯基的核酸溶解于ph值为6.8
‑
8.0的磷酸盐缓冲液中；
18.(2)向步骤(1)加入dmso溶剂溶解的多肽，充分混匀，在37℃恒温反应过夜。
19.在一些实施方案中，所述步骤(1)之前包括对核酸二硫键保护基进行还原反应得到连接巯基的核酸。
20.在一些实施方案中，所述步骤(1)中所述磷酸盐缓冲液选自磷酸氢钠、三乙基胺醋酸盐、磷酸氢钾或者磷酸盐生理盐水缓冲液。在一个具体实施方案中，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢钾缓冲液。
21.本发明上述合成含二硫键和/或巯基修饰的多肽核酸偶联物的方法，进一步包括纯化步骤。在一些实施方案中，所述纯化步骤包括加入氯化钠和乙醇沉降洗涤。在一个具体实施方案中，所述纯化步骤包括加入加入10％5m nacl和2.5e.q.的冰乙醇在
‑
20℃条件下进行沉降1小时，并用冰乙醇洗涤。
22.本发明合成多肽核酸偶联物的方法，反应获得偶联物后，进一步包括过hplc检测偶联反应的偶联效率。在一些实施方案中，所述hplc检测所述偶联反应的偶联效率为42％
‑
90％。
23.本发明还提供了一种通过所述合成方法制备得到的多肽核酸偶联物。
24.本发明所述的多肽核酸偶联物在核酸的穿膜递送、核酸的靶向结合、核酸纳米骨架上进行的多肽展示或者以核酸为模板的多肽合成反应中的应用。
25.在该发明所使用的条件下，可以将含有巯基和/或二硫键修饰的多肽通过巯基与马来酰亚胺反应与核酸结合而不会产生巯基核酸二硫键偶联产物和琥珀酰亚胺水解产物等反应副产物。
26.术语解释
27.反应物当量：符号e.q.，化学上指某物质与另一物质特定反应中质量比例的数值；泛指以某个质量数值为基准，跟这个基准相对应的质量数值。在本发明中，多肽反应物当量是指在多肽核酸偶联反应过程中，与加入的巯基引物完全反应时，所需要多肽反应物的质量为基准质量，5e.q.是指多肽反应物基准质量5倍的质量数，10e.q.是指基准质量10倍的质量数，20e.q.是指基准质量的20倍的质量数。
28.本发明所述还原效率、偶联反应转化率(即偶联效率)的计算方式：均是先用hplc
(型号：岛津lc
‑
20ad)对应的积分软件(labsolutions)计算出不同峰对应的积分面积(area)，本发明所有的还原效率和偶联反应转化率的计算公式均为area
产物
*100％/(area
产物
area
反应物
area
副产物
)。
29.经过条件优化及结构设计，使核酸与含有二硫键和/或巯基修饰的多肽成功偶联。同时和之前的文献报导相比，减少了副产物，提升了转化率。
附图说明
30.图1为巯基核酸与马来酰亚胺修饰的多肽偶联反应；
31.图2为巯基核酸(oligo1)还原产物hplc图谱；
32.图3为巯基核酸(oligo1)还原产物ms图谱；
33.图4为不同ph的反应溶液中多肽核酸偶联反应产物的hplc图谱；
34.图5为不同精细条件下多肽核酸偶联反应产物的hplc图谱；
35.图6为实施例4多肽核酸偶联反应产物的hplc图谱；
36.图7为实施例4多肽核酸偶联反应产物的ms图谱。
具体实施方式
37.本发明通过以下实施例作进一步举例说明，这些实施例不应解释为对本发明的限制。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
38.巯基核酸序列：
39.oligo1:5
’‑
c6
‑
s
‑
s
‑
acaacatatagcgcag(理论分子量：5211.4，二硫键还原后的理论分子量：5079.3，由genscript合成，请见服务链接：https://www.genscript.com/dna_oligo.html)
40.多肽序列:
41.peptide1:male
‑
chaagdyc(male:马来酰亚胺基丙酸；且多肽链上有二硫键修饰，理论分子量：987.9，由genscript合成，请见服务链接：https://www.genscript.com/peptide.html)peptide2:male
‑
c(stbu)haagdy(male:马来酰亚胺基丙酸，理论分子量：975.0，由genscript合成，请见服务链接：https://www.genscript.com/peptide.html)
42.实施例1巯基核酸还原反应
43.向含有40nmole的二硫键保护的巯基核酸(oligo1)的1.5ml离心管中加入100ul 150mm硼酸钠缓冲溶液(ph 9.4)溶解。加入2.5mg tcep(三(2
‑
羧乙基)膦)并震荡至充分溶解。将反应至于震荡混匀仪中在室温1200rpm的条件下反应1小时。完成反应后加入10％5m nacl和2.5e.q.的冰乙醇在
‑
20℃，1小时的条件下进行沉降。用85％的冰乙醇洗两遍。完成沉降后，将样品溶于水中进行hplc/ms来检测还原效率。hplc图谱见图2，hplc/ms的ms图谱见图3，hplc检测的保留时间、ms的理论分子量和观测分子量如表1所示。
44.表1 hpcl/ms检测结果
45.保留时间(分钟)观测到的分子量(da)理论分子量(da)6.5575078.55079.3
46.结果:使用提供的条件，二硫键保护的巯基引物(oligo1)可以被完全还原。
47.实施例2反应溶液的ph值优化
48.在1.5ml离心管中用20ul100mm磷酸氢钾(调节不同ph值分别为5.8、6.2、6.8、7.6，见表2)的缓冲溶液溶解实施例1中被充分还原的巯基引物(20nmol)。向其中加入对应当量的多肽(peptide1)dmso溶剂(分析纯)并震荡至充分混匀。将反应置于震荡混匀仪中在1200rpm，室温的条件下震荡反应过夜。完成反应后加入10％5m nacl和2.5e.q.的冰乙醇在
‑
20℃，1小时的条件下进行沉降。用85％的冰乙醇洗两遍。完成沉降后，将样品溶于水中进行hplc来检测偶联效率，检测的hplc图谱见图4，偶联的转化率见表2。剩余的样品使用hplc进行纯化，冻干后得到纯品。
49.表2不同ph的反应溶液中核酸多肽偶联反应的转化率
50.条件多肽反应物当量多肽反应物浓度ph转化率a10e.q.5mm5.832.9％b10e.q.5mm6.240.2％c10e.q.5mm6.851.3％d10e.q.5mm7.648.4％
51.结论：
52.在进行反应缓冲溶液的筛选中，我们发现在ph 6.8的条件下偶联反应的转化率达到最高。后续进行进一步优化反应。
53.实施例3多肽核酸偶联反应的精细条件优化
54.在1.5ml离心管中用20ul100mm磷酸氢钾(调节ph值为6.5或6.8)的缓冲溶液溶解实施例1中被充分还原的巯基引物。向其中加入不同当量的多肽(peptide1，10e.q.或20e.q.，实验设计见表3)dmso溶剂(分析纯)并震荡至充分混匀。将反应置于震荡混匀仪中在1200rpm，室温的条件下震荡反应过夜。完成反应后加入10％5m nacl和2.5e.q.的冰乙醇在
‑
20℃，1小时的条件下进行沉降。用85％的冰乙醇洗两遍。完成沉降后，将样品溶于水中进行hplc来检测偶联效率，检测的hplc图谱见图5，偶联转化率见表3。剩余的样品使用hplc进行纯化，冻干后得到纯品。
55.表3不同精细条件下多肽核酸偶联反应的转化率
56.条件多肽反应物当量多肽反应物浓度ph转化率a10e.q.5mm6.549.5％b20e.q.10mm6.564.9％c20e.q.5mm6.559.2％d10e.q.5mm6.855.9％e20e.q.10mm6.869.5％f20e.q.5mm6.860.0％
57.结论:
58.在反应过程中，使用过量的多肽可以保证还原后的巯基核酸优先与多肽的马来酰亚胺反应而不会打开已有的二硫键从而破坏多肽的结构。因此该方法也可以避免使用smcc而引入的副反应。经过进一步优化反应条件，我们将转化率提升到了69.5％。
59.实施例4多肽核酸偶联反应(含有二硫键修饰的多肽)
60.在1.5ml离心管中用20ul 100mm磷酸氢钾(调节ph值为6.8)的缓冲溶液溶解实施
例1中被充分还原的巯基引物。向其中加入20ul，40mm的多肽(peptide1)dmso溶剂(分析纯)并震荡至充分混匀，该混合反应液中多肽反应物浓度则为20mm。将反应置于震荡混匀仪中在1200rpm，37℃的条件下恒温反应过夜。完成反应后加入10％5m nacl和2.5e.q.的冰乙醇在
‑
20℃，1小时的条件下进行沉降。用85％的冰乙醇洗两遍。完成沉降后，将样品溶于水中进行hplc/ms来检测偶联效率，检测的hplc图谱见图6，ms图谱见图7。剩余的样品使用hplc进行纯化，冻干后得到纯品。
61.表4 hplc/ms来检测结果
[0062][0063]
应用上述的方法，如表4中显示的观测分子量与理论分子量相当，说明含有二硫键修饰的多肽可以被正确偶联在巯基修饰的核酸上
[0064]
实施例5偶联后还原反应(含有裸露巯基修饰的多肽)
[0065]
在1.5ml离心管中用20ul 100mm磷酸氢钾(调节ph值为6.8)的缓冲溶液溶解实施例1中被充分还原的巯基引物。向其中加入20ul，40mm的多肽(peptide2)dmso溶剂(分析纯)并震荡至充分混匀，该混合反应液中多肽反应物浓度则为20mm。将反应置于震荡混匀仪中在1200rpm，37℃的条件下恒温反应过夜。完成反应后加入10％5m nacl和2.5e.q.的冰乙醇在
‑
20℃，1小时的条件下进行沉降。用85％的冰乙醇洗两遍。完成沉降后，将样品溶于水中进行hplc/ms来检测偶联效率。
[0066]
在确认偶联反应完全后，在1.5ml离心管中用100ul，150mm硼酸钠(ph 9.4)的缓冲溶液溶解上一步中已完全反应的巯基引物。加入2.5mg tcep(三(2
‑
羧乙基)膦)并震荡至充分溶解。将反应至于震荡混匀仪中在室温1200rpm的条件下反应1小时。完成反应后加入10％5m nacl和2.5e.q.的冰乙醇在
‑
20℃，1小时的条件下进行沉降。用85％的冰乙醇洗两遍。完成沉降后，将样品溶于水中进行hplc/ms来检测还原效率。