基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒的制作方法

基于恒温无酶多级扩增的mirna化学发光检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于分子生物学和医学检测领域，具体涉及到一种基于恒温无酶多级扩增的mirna化学发光检测试剂盒。


背景技术：

2.microrna(mirna)是一类内生的、长度约为20
‑
24个核苷酸的小rna，在细胞内具有多种重要的调节作用，其异常表达与癌症的进程密切相关，可以作为肿瘤标志物，为癌症的早期诊断、预后和相关生物学功能研究提供重要信息。
3.然而，由于mirna序列短、含量低、同源性高等特点，限制了mirna的检测应用。因此，发展高灵敏度、高特异性的mirna检测方法对实现癌症的早期诊断具有重要意义。核酸扩增技术是生物学和医学等领域的一项重要技术，广泛应用于目标物检测，可以对一些特异性的病原体或疾病标记物进行识别。其中，恒温无酶核酸扩增技术对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，且反应条件也不受酶反应环境的制约，主要包括催化发夹自组装(cha)、杂交链式反应(hcr)和核酸酶(dnazyme)介导的反应，适用性更强，相比于传统检测手段，该试剂盒更简单灵敏。但是目前还没有一种基于恒温无酶多级扩增的mirna化学发光检测试剂盒。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种基于恒温无酶多级扩增的mirna化学发光检测试剂盒。
5.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种基于恒温无酶多级扩增的mirna化学发光检测试剂盒，其中，所述mirna
‑
21的序列如表1所示，具体为uagcuuaucagacugauguuga。
6.基于恒温无酶多级扩增的mirna化学发光检测试剂盒由dna粉末、反应底物和缓冲溶液组成，所述的dna粉末包括发卡h1、发卡h2、发卡h3、发卡h4、发卡h5、发卡h6、发卡h7，具体序列如下：h1核酸分子序列如seq id no：1，h2核酸分子序列如seq id no：2，h3核酸分子序列如seq id no：3，h4核酸分子序列如seq id no：4，h5核酸分子序列如seq id no：5，h6核酸分子序列如seq id no：6，和/或h7核酸分子序列如seq id no：7。
7.所述的反应底物包括氯化血红素、鲁米诺和过氧化氢溶液；所述的缓冲溶液为hepes缓冲液(10mm hepes缓冲溶液，ph＝7.5，含有600mm氯化钠和50mm氯化钾)。
8.发卡h1、发卡h2、发卡h3、发卡h4、发卡h5、发卡h6的摩尔浓度比为1
‑
2：1
‑
2：6
‑
7：8
‑
9：7
‑
8：8
‑
9；或者所述的发卡h1、发卡h2、发卡h3、发卡h4、发卡h5、发卡h6、发卡h7的摩尔浓度比为1
‑
2：1
‑
2：6
‑
7：8
‑
9：7
‑
8：8
‑
9：0.3
‑
0.8。
9.作为优选方案，所述的发卡h1、发卡h2、发卡h3、发卡h4、发卡h5、发卡h6的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8；或者所述的发卡h1、发卡h2、发卡h3、发卡h4、发卡h5、发卡h6、发卡h7的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8：0.5。
10.基于恒温无酶多级扩增的mirna化学发光检测试剂盒检测mirna
‑
21的方法，包括如下步骤：(1)用hepes缓冲溶液分别将发卡h1、发卡h2、发卡h3、发卡h4、发卡h5、发卡h6、发卡h7粉末配制为100μm溶液，震荡分散均匀，然后分别退火，再按摩尔浓度比进行混合，加入目标物mirna
‑
21，共同孵育12小时，再加入氯化血红素溶液，孵育1小时得到反应液，然后将反应液稀释20倍；(2)向稀释20倍的反应液中加入鲁米诺溶液后，置于发光杯中，快速注入过氧化氢溶液，通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号，实现对mirna
‑
21的检测；所述的h1核酸分子序列如seq id no：1，h2核酸分子序列如seq id no：2，h3核酸分子序列如seq id no：3，h4核酸分子序列如seq id no：4，h5核酸分子序列如seq id no：5，h6核酸分子序列如seq id no：6，和/或h7核酸分子序列如seq id no：7。
11.步骤(1)中发卡h1、发卡h2、发卡h3、发卡h4、发卡h5、发卡h6的摩尔浓度比为1
‑
2：1
‑
2：6
‑
7：8
‑
9：7
‑
8：8
‑
9；或者所述的发卡h1、发卡h2、发卡h3、发卡h4、发卡h5、发卡h6、发卡h7的摩尔浓度比为1
‑
2：1
‑
2：6
‑
7：8
‑
9：7
‑
8：8
‑
9：0.3
‑
0.8。
12.作为优选方案，所述的发卡h1、发卡h2、发卡h3、发卡h4、发卡h5、发卡h6的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8；或者所述的发卡h1、发卡h2、发卡h3、发卡h4、发卡h5、发卡h6、发卡h7的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8：0.5。
13.本发明的又一技术方案是将所述的基于恒温无酶多级扩增的mirna化学发光检测试剂盒在制备检测细胞裂解液中的mirna
‑
21的含量的药物上的应用。
14.所述的基于恒温无酶多级扩增的mirna化学发光检测试剂盒通过检测细胞裂解液中的mirna
‑
21的含量在制备区分肿瘤细胞与正常细胞的药物中的应用，所述的肿瘤细胞包括hepg2、或hl
‑
7702细胞。
15.本发明具有以下优点：本发明的试剂盒中，mirna
‑
21能引发上游cha反应，生成的产物能够继续引发下游hcr，同时激活dnazyme，产生多重级联放大的化学发光信号，具有稳定性好、灵敏度高和特异性强的优点。当存在mirna
‑
21时，能形成含有多个g
‑
四链体结构的dna纳米线，与氯化血红素复合后，大大提高催化活性；另外，基于核酸纳米结构的限域化作用，还能大大增加了反应物的利用率。本发明试剂盒不需外部激发光源，可以避免自发荧光、荧光漂白和串光等问题，具有较低的背景信号；本发明试剂盒所使用的发卡探针不需经过荧光基团修饰，大大减低检测成本；本发明试剂盒基于恒温无酶多级串联cha
‑
hcr
‑
dnazyme核酸扩增反应，能够有效提高mirna检测的特异性和灵敏性，为癌症的早期诊断、治疗和预后判断提供高效的新方法。通过改变功能发卡h7的序列，也可以对其他核酸、蛋白等生物分子进行检测。
16.表1：文中所涉及核酸分子的序列
附图说明
17.附图1为本发明检测目标物的原理图。
18.附图2为cha与hcr比值优化图。
19.附图3为机理验证图。
20.附图4为优化发卡h3浓度图。
21.附图5为优化发卡h5浓度图。
22.附图6为优化发卡h1浓度图。
23.附图7为cha
‑
hcr
‑
dnazyme、cha
‑
dnazyme及hcr
‑
dnazyme的信号扩增效果图。
24.附图8为基于恒温无酶多级扩增的mirna化学发光检测试剂盒对不同浓度mirna
‑
21的检测图。
25.图9为基于恒温无酶多级扩增的mirna化学发光检测试剂盒对不同细胞裂解液中mirna
‑
21的检测图。
具体实施方式
26.下面结合附图及实施例对本发明做进一步描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。
27.本发明的实施例中所用到的各试剂如下：hepes：购自sigma，99.5％；hepes钠盐：购自sigma，96％；氯化钠：购自sigma，99％；氯化钾：购自国药集团化学试剂有限公司，含量≥99.5％；鲁米诺：购自sigma，≥97％(hplc)；氯化血红素：购自sigma，≥97％(hplc)；
30％过氧化氢溶液：购自成都市科隆化学品有限公司；二甲亚砜：购自国药集团化学试剂有限公司；depc水：多聚甲醛和焦碳酸二乙酯处理过的水，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
28.hepes缓冲液(10mm hepes缓冲溶液，ph＝7.5，含有600mm氯化钠和50mm氯化钾)配制方法：称取0.834g hepes、0.2603g hepes钠盐、17.49g氯化钠、1.8638g氯化钾于烧杯中，加入depc水溶解后定容至500ml，然后在25℃条件下用1m的氢氧化钠溶液调ph至7.5；dna母液(100μm)的配制方法：dna粉末经te buffer(ph＝8.0)按照dna管上标签提示量溶解，
‑
20℃保存。
29.氯化血红素溶液(4μm)的配制方法：称取0.0326g氯化血红素粉末溶于5ml二甲亚砜，得到10mm的氯化血红素溶液，用二甲亚砜逐级稀释至4μm即可；鲁米诺溶液(250μm)的配制方法：称取0.025g鲁米诺粉末溶于2.5ml浓氨水中，再加入25ml depc水进行稀释，得到5mm鲁米诺溶液，再取1μl 5mm鲁米诺溶液加入19μlhepes溶液，得到250μm的鲁米诺溶液；h2o2溶液(1.5mm)的配制方法：取2μl 30％h2o2溶液溶于17.58μl hepes溶液中，得到1m的h2o2溶液，取1μl 1m的h2o2溶液溶于9μl hepes溶液中，得到100mm的h2o2溶液，最后取1.8μl 100mm的h2o2溶液溶于118.2μl hepes溶液中，即可得到浓度为1.5mm的h2o2溶液。
30.发卡探针的设计构思如下：运用nupack软件设计相关发卡探针，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成相关核酸序列。附图1为多级扩增反应用于目标物检测的原理图，目标物i首先通过链置换反应打开发夹h1得到i
‑
h1中间体，随后发夹h2取代i
‑
h1中的i，生成产物h1
‑
h2，取代下来的i继续参与h1和h2的反应生成多个双链产物h1
‑
h2。产物h1
‑
h2使t的两部分序列靠近，从而引发下游hcr。t通过链置换反应，依次打开发夹h3、h4、h5和h6，生成中间产物t
‑
h3
‑
h4
‑
h5
‑
h6，并露出与t相同的序列，继续引发发夹的依次打开，最后生成长的双链dna纳米线，即t
‑
(h3
‑
h4
‑
h5
‑
h6)
n
。dna纳米线能够拉近修饰在发夹h3和h5上的两部分g4序列的距离，形成完整的g4，加入hemin之后，形成具有类辣根过氧化物酶催化活性的g4/hemin dnazyme，在过氧化氢的存在下，dnazyme催化鲁米诺发光，且发光强度与目标物浓度呈正相关，通过此种方法达到检测目标物的目的。
31.实施例1为了提高信号放大效果，对dna孵育溶液中cha(包括发卡h1、h2)和hcr(包括发卡h3、h4、h5、h6)反应物的浓度比值进行优化。具体为cha和hcr的发卡反应物浓度比值为4：1、2：1、1：1、1：2、1：4。
32.首先将1μl单个发卡母液与15.67μl hepes缓冲液混合均匀后，得到浓度为6μm的单个发卡溶液，再通过pcr仪在95℃保持5min、25℃保持2h的条件下分别进行退火。
33.然后，按照不同的浓度比值将反应物发卡混合，例如，cha和hcr浓度比值为4：1时的具体操作为，取5.83μl的发卡h1和h2，以及1.46μl的发卡h3、h4、h5和h6，加入25μl hepes缓冲液，得到cha和hcr浓度比值为4:1的核酸孵育液。其他比例关系依此进行换算，不同cha和hcr发卡浓度比的核酸孵育液与1.25μl i(可以引发cha反应和cha
‑
hcr
‑
dnazyme反应的目标物)共孵育12小时，加入9.85μl浓度为4μm的氯化血红素溶液，1小时后得到含有g
‑
四链体/氯化血红素dnazyme的反应液，将反应液稀释20倍，向稀释20倍的反应液中加入13.13μl
浓度为250μm的鲁米诺溶液，混合均匀后放入发光杯中，随后注入108.27μl浓度为1.5mm的过氧化氢溶液，立即通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号。试验结果如图2所示，通过对比不同cha和hcr发卡浓度比值下的信背比，发现当比值为1:4时，信背比最大，所以最终确定1:4为最优的cha和hcr发卡浓度比值。
34.实施例2本实施例设计了反应体系中依次缺少单个发卡的对照实验，检测不同实验组产生的化学发光信号，方法及各原料的量同实施例1。
35.实验结果如附图3所示。当从上游cha中去掉发夹h1或h2，或者从下游hcr中去掉发夹h3、h4和h5时，目标物引发的反应荧光均较低，证明上游cha或者下游hcr被阻断时，cha
‑
hcr
‑
dnazyme无法发生信号放大。当从下游hcr中去掉发夹h6时，目标物引发的反应会产生较小的荧光，这是由于此时的反应等同于cha反应，缺发夹h6的hcr只能作为信号输出工具，而不再放大信号。同样的，在无目标物的缺发夹体系中荧光也较低。由此说明cha
‑
hcr
‑
dnazyme反应只能在上游cha和下游hcr的反应物共同存在时，加入目标物之后，才能产生多级放大的化学发光信号。
36.实施例3本实施例对发卡浓度进行了优化。通过缺发卡试验，得出发卡h1、h3和h5产生的背景信号较大，进一步优化h1、h3或h5单个发卡的浓度，得到最佳反应浓度，具体操作步骤及其他试剂的量均同实施例1。具体调节内容如下：h3：500nm、600nm、700nm、800nm，结果如图4所示。
37.h5：500nm、600nm、700nm、800nm，结果如图5所示。
38.h1：50nm、100nm、150nm、200nm，结果如图6所示。
39.通过改变上述h1、h3、h5的发卡浓度，发现当发卡h1为200nm、h3为600nm及h5为700nm时的信背比最高，所以最终确定核酸孵育液中，发卡h1、h2、h3、h4、h5和h6的浓度依次为200nm、200nm、600nm、800nm、700nm、800nm。
40.实施例4为了验证多级信号扩增效果以及检测能力，我们通过设计了二级cha
‑
dnazyme和hcr
‑
dnazyme反应，将其与多级cha
‑
hcr
‑
dnazyme反应的检测效果进行比较。
41.多级cha
‑
hcr
‑
dnazyme反应由42.5μl的dna孵育溶液和131.25μl的反应底物溶液组成。所述dna孵育溶液包括1.46μl发卡h1、1.46μl发卡h2、4.38μl发卡h3、5.83μl发卡h4、5.11μl发卡h5、5.83μl发卡h6和18.43μl hepes缓冲液；131.25μl的反应底物溶液包括9.85μl氯化血红素溶液、13.13μl鲁米诺溶液和108.27μl过氧化氢溶液。取1μl 100μm的单个发卡母液，与15.67μl hepes缓冲液混合均匀后，得到浓度为6μm的单个发卡溶液。将6μm的单个发卡溶液通过pcr仪在温度为95℃保持5min、25℃保持2h的条件下进行退火。退火之后按照上述发卡体积进行混合，混合后加入1.25μli(可以引发cha
‑
dnazyme反应和cha
‑
hcr
‑
dnazyme反应的目标物)，最终保证在整个核酸孵育液中发卡h1和h2浓度为200nm，发卡h3为600nm、h4为800nm、h5为700nm和h6为800nm。6个发卡与i共孵育12h后，加入4μm的氯化血红素溶液，反应1h后得到反应液，将反应液稀释20倍，再加入13.13μl的250μm的鲁米诺溶液，混合均匀后放入发光杯中，随后注入108.27μl的1.5mm的过氧化氢溶液，立即通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号。
42.实施例4
‑
1为证明该检测试剂盒具有较高的灵敏性和放大效果，将其与其它两种试剂盒做对比：即基于二级cha
‑
dnazyme核酸扩增反应的化学发光检测试剂盒：目标物为i(能够引发cha
‑
dnazyme和cha
‑
hcr
‑
dnazyme反应的目标物)，由42.5μl的dna孵育溶液和131.25μl的反应底物溶液组成；所述的dna孵育溶液包括1.46μl发卡h1、1.46μl发卡h2、4.38μl发卡h3、5.83μl发卡h4、5.11μl发卡h5和24.26μl hepes缓冲溶液；发卡退火浓度及反应底物溶液与基于恒温无酶多级核酸扩增反应的mirna化学发光检测试剂盒相同。
43.实施例4
‑
2基于二级hcr
‑
dnazyme核酸扩增反应的化学发光检测试剂盒：目标物为t(能够引发hcr
‑
dnazyme反应的目标物)，由42.5μl的dna孵育溶液和131.25μl的反应底物溶液组成；所述的dna孵育溶液包括4.38μl发卡h3、5.83μl发卡h4、5.11μl发卡h5、5.83μl发卡h6和21.35μl hepes缓冲溶液，发卡退火浓度及反应底物溶液与基于恒温无酶多级核酸扩增反应的mirna化学发光检测试剂盒相同。
44.实施例4、实施例4
‑
1、实施例4
‑
2三种试剂盒对不同浓度的目标物的检测结果如附图7所示，实施例4中的测试剂盒相比于其它两种检测试剂盒，可以检测更低浓度的目标物，且对同一浓度的目标物检测时，信号放大效果更明显，如图所示，在目标物浓度为5nm时，基于二级cha
‑
dnazyme核酸扩增反应的化学发光检测试剂盒的化学发光强度只有2300左右，基于二级hcr
‑
dnazyme核酸扩增反应的化学发光检测试剂盒的化学发光强度只有1600左右，而基于多级cha
‑
hcr
‑
dnazyme核酸扩增反应的化学发光检测试剂盒的化学发光强度有6800左右，证明本发明所设计的多级扩增试剂盒的信号扩增效果更好，而且，通过线性曲线计算可得，cha
‑
dnazyme、hcr
‑
dnazyme和cha
‑
hcr
‑
dnazyme的检测限分别为0.41nm、2.67nm和0.021nm，明显可以看出，本发明所设计的多级扩增试剂盒的检测灵敏度更高。
45.实施例5一种基于恒温无酶多级扩增的mirna化学发光检测试剂盒用于溶液中mirna
‑
21的检测。
46.所述试剂盒由43.75μl的核酸孵育溶液和131.25μl的反应底物溶液组成；所述的核酸孵育溶液包括1.46μl发卡h1、1.46μl发卡h2、4.38μl发卡h3、5.83μl发卡h4、5.11μl发卡h5、5.83μl发卡h6、2.19μl发卡h7、1.25μl mirna
‑
21和16.24μl hepes缓冲溶液；131.25μl的反应底物溶液包括9.85μl氯化血红素溶液、13.13μl鲁米诺溶液和108.27μl过氧化氢溶液。发卡h1
‑
h6在浓度为6μm时、发卡h7在浓度为1μm时进行退火，退火条件为95℃保持5min、25℃保持2h，退火之后按照上述发卡体积进行混合，再加入1.25μl不同浓度的mirna
‑
21，保证在核酸孵育液中发卡h1和h2浓度为200nm，发卡h3为600nm、h4为800nm、h5为700nm、h6为800nm、h7为50nm。发卡与mirna
‑
21共孵育12h后，加入4μm的氯化血红素溶液，室温下反应1h，将反应液稀释20倍，再加入13.13μl的250μm的鲁米诺溶液，混合均匀后放入发光杯中，随后注入108.27μl的1.5mm的过氧化氢溶液，立即通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号。该检测试剂盒的检测效果如附图8所示，化学发光强度与mirna
‑
21浓度呈现良好的线性关系，在mirna
‑
21浓度为0
‑
100pm范围内，得到线性曲线为y＝11738.11795 29.7558*x(r2＝0.9939)，计算出检测限为16pm，能够通过检测化学发光强度来计算样品中mirna
‑
21的浓度，从而实现mirna
‑
21的高灵敏检测。
47.实施例6一种基于恒温无酶多级扩增的mirna化学发光检测试剂盒用于细胞中mirna
‑
21的检测。
48.用胰酶分别将2
×
106个人肝癌细胞(hepg2)和人正常肝细胞(hl
‑
7702)消化，分散在1ml的pbs溶液中，在1000rpm下离心5min，除去pbs溶液，将细胞重新分散在250μl的tris
‑
hcl溶液中，通过超声波细胞粉碎机在0℃下粉碎20min，最后在4℃下，12000rpm离心20min，得到的上清液为细胞裂解液。
49.所述试剂盒由43.75μl的核酸孵育溶液和131.25μl的反应底物溶液组成；所述的核酸孵育溶液包括1.46μl发卡h1、1.46μl发卡h2、4.38μl发卡h3、5.83μl发卡h4、5.11μl发卡h5、5.83μl发卡h6、2.19μl发卡h7、1.25μl mirna
‑
21和16.24μl hepes缓冲溶液；131.25μl的反应底物溶液包括9.85μl氯化血红素溶液、13.13μl鲁米诺溶液和108.27μl过氧化氢溶液。发卡h1
‑
h6在浓度为6μm时、发卡h7在浓度为1μm时进行退火，退火条件为95℃保持5min、25℃保持2h，退火之后按照上述发卡体积进行混合，再分别加入1.25μl不同细胞裂解液，保证在核酸孵育液中发卡h1和h2浓度为200nm，发卡h3为600nm、h4为800nm、h5为700nm、h6为800nm、h7为50nm。发卡与细胞裂解液共孵育12h后，加入4μm的氯化血红素溶液，室温下反应1h，将反应液稀释20倍，再加入13.13μl的250μm的鲁米诺溶液，混合均匀后放入发光杯中，随后注入108.27μl的1.5mm的过氧化氢溶液，立即通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号，不同细胞内化学发光强度如图9所示。通过实施例5中的线性曲线(图8)换算得到hepg2和hl
‑
7702细胞中的mirna
‑
21的浓度分别为92.3pm和19.8pm，hepg2细胞中的mirna
‑
21比hl
‑
7702细胞中的高，因此，该试剂盒能够通过检测化学发光强度来计算细胞中mirna
‑
21的浓度，通过细胞中mirna
‑
21含量的不同为区分癌细胞和正常细胞提供一定的数据支撑。
50.sequence listing