一种抗IGF-1R抗体及其应用的制作方法

一种抗igf-1r抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗igf-1r抗体及其应用。


背景技术：

2.甲状腺相关性眼病(thyroid associated ophthalmopathy，tao)又名内分泌突眼、浸润性突眼、甲状腺眼病，多并发于graves病(弥漫性甲状腺肿伴甲状腺功能亢进症)，又称之为graves眼病(graves'ophthalmopathy，go)，约占眼眶疾病的20％。甲状腺相关性眼病可引起眼球突出、眼睑挛缩、眼外肌功能障碍、球结膜充血、眶周水肿等，严重时会导致暴露性角膜炎、复视和压迫性视神经病变，后者可导致失明，严重影响患者的生活质量。甲状腺相关性眼病是由甲状腺上皮细胞、眼眶前脂肪细胞及成纤维细胞一起表达的共同抗原引发的以细胞免疫为主的位点特异性自身免疫疾病。炎症反应、眼眶成纤维细胞增多和眼眶脂肪细胞的增多导致眼球突出，引发甲状腺相关性眼病的症状。胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1receptor，igf-1r)和促甲状腺激素受体(thyroid-stimulating hormone receptor，tshr)在甲状腺相关性眼病患者眼眶成纤维细胞中的水平异常偏高，且二者间存在着复杂的信号通路网络联系，与疾病的发生密切相关。
3.igf-1r属于酪氨酸蛋白激酶受体家族，是一种细胞表面的跨膜蛋白，可被igf-1及igf-2(均为胰岛素增长因子)激活，其过度表达可能与多发性硬化、克罗恩病、肺纤维化等恶性肿瘤及自身免疫性疾病发病相关。大部分的graves病患者体内可以检测到抗igf-1r的抗体，而正常人体内少有发现。graves病患者血清分离的igg(graves相关的免疫球蛋白g)可以替换igf-1r与眼眶成纤维细胞表面上的位点结合，igf-1r或graves病相关的igg可激活甲状腺相关性眼病患者来源的igf-1r阳性的眼眶成纤维细胞，从而激活akt/frap/mtor/p70s6k通道诱导眼眶成纤维细胞上白细胞介素-16和调节活化正常t细胞表达和分泌的因子(regulated upon activation normal t cell expressed and secreted factor，rantes)的表达，促进t细胞趋化因子的合成，引起t淋巴细胞的炎性浸润和透明质酸的产生，这些都表明igf-1r可能作为第二抗原参与了graves病的发展。另外，有报道显示，igf-1r与tshr的下游信号有大量重叠，且抗igf-1r的单克隆抗体可以阻断igf-1r的信号传导，及减弱tshr通路的下游信号，减轻促甲状腺激素引起的炎症反应，提示igf-1r参与了tshr信号传导，并且igf-1r与tshr可能形成了一个复杂的功能复合体，在graves病相关的异常信号传导方面起着协同作用。
4.抗igf-1r抗体(参见专利wo2004087756、us20100158919、us20140193404)在治疗甲状腺眼病的临床实验中达到了主要和所有次要终点，可以显著改善眼球突出的症状。除了上述所列举的抗体外，目前国内外没有其他针对igf-1r抗体用于治疗甲状腺眼病的应用，比如专利cn200880011970.4、cn200880114015.3、cn200780011979.0、cn200980137723.3、us20190040141、us20090175868、us20060018910中的抗igf-1r抗体均是用于恶性肿瘤的治疗。在甲状腺相关眼病领域，开发新型的用于治疗该疾病的igf-1r治疗性抗体十分的必要。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供了一种结合igf-1r的抗体及其在药品中的应用，该抗体及相关药品可用于甲状腺相关眼病的预防或者治疗。
6.一方面，本发明提供了一种结合igf-1r的抗体。
7.所述的抗体由轻链和重链组成。
8.所述的抗体的轻链可变区选自seq id no：2、4、6、8、10、12或14所示的氨基酸序列中的一种。
9.所述的抗体的轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no：16所示。
10.所述的抗体的轻链由轻链可变区与seq id no：16所示的轻链恒定区拼接形成。
11.所述的抗体的重链可变区选自seq id no：3、5、7、9、11、13、15所示的氨基酸序列中的一种。
12.所述的抗体的重链恒定区的氨基酸序列如seq id no：17所示。
13.所述的抗体的重链由重链可变区与seq id no：17所示的重链恒定区拼接形成。
14.具体地，所述的抗体的轻链和重链可变区为seq id no：2和seq id no：3所示的氨基酸序列；
15.或，seq id no：4和seq id no：5所示的氨基酸序列；
16.或，seq id no：6和seq id no：7所示的氨基酸序列；
17.或，seq id no：8和seq id no：9所示的氨基酸序列；
18.或，seq id no：10和seq id no：11所示的氨基酸序列；
19.或，seq id no：12和seq id no：13所示的氨基酸序列；
20.或，seq id no：14和seq id no：15所示的氨基酸序列。
21.具体地，所述的轻链和重链通过链间二硫键形成完整的抗igf-1r抗体。
22.另一方面，本发明提供了编码上述任一技术方案得到的抗体的核苷酸序列。
23.再一方面，本发明提供了一种表达载体，所述的表达载体包含编码前述任一技术方案得到的抗体的核酸分子。
24.又一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含前述表达载体。
25.又一方面，本发明提供了上述结合igf-1r的抗体在制备甲状腺相关眼病的药物中的应用。
26.所述的应用包括但不限于利用上述结合igf-1r的抗体、编码该抗体的核苷酸序列及其突变型、含有上述核苷酸序列的表达载体、含有上述载体的宿主细胞在制备甲状腺相关眼病药物中的应用。
27.具体地，所述的抗体经过分离纯化。
28.所述的核苷酸序列、表达载体和宿主细胞通过表达抗体实现所述应用。
29.所述的抗体、核苷酸序列、表达载体通过直接添加至药物中实现所述应用。
30.所述的药物可应用的甲状腺相关眼病包括但不限于：眼球突出、眼睑退缩、上睑迟落、眼外肌肥大、结膜充血、眶周组织水肿、眼睑闭合不全、畏光、流泪、异物感、视力下降或复视。
31.又一方面，本发明提供了上述结合igf-1r的抗体的制备方法。
32.具体地，所述的制备方法为利用编码上述任一技术方案提供的抗体的核苷酸序列
构建表达载体转染宿主细胞，通过宿主细胞的表达获得结合igf-1r的抗体。
33.又一方面，本发明提供了一种药物组合物。
34.所述的药物组合物包含上述结合igf-1r的抗体、编码该抗体的核苷酸序列及其突变体、含有上述核苷酸序列或其突变体的表达载体中的一种或多种。
35.所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
36.进一步地，所述的药学上可接受的载体和/或辅料包括但不限于：增溶剂、稳定剂和赋形剂。
37.所述的药物组合物的给药方式包括但不限于：皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、眼睑注射。
38.所述的药物组合物可应用于甲状腺相关眼病的预防和/或治疗，所述的甲状腺相关眼病包括但不限于眼球突出、眼睑退缩、上睑迟落、眼外肌肥大、结膜充血、眶周组织水肿、眼睑闭合不全、畏光、流泪、异物感、视力下降或复视。
附图说明
39.图1为php1003针对人igf-1r的亲和力检测结果。
40.图2为php1003针对猴子igf-1r的亲和力检测结果。
41.图3为php1003针对大鼠igf-1r的亲和力检测结果。
42.图4为php1003蛋白的sec-hplc检测结果。
43.图5为对照抗体的sec-hplc检测结果。
44.图6为测试品php1003及对照品给药大鼠甲状腺功能亢进及甲状腺相关眼病模型4周后，眼外肌组织染色光镜下观察结果。
具体实施方式
45.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
46.实施例1抗igf-1r抗体的序列合成与载体构建
47.轻链设计：将轻链可变区和轻链恒定区直接拼接形成轻链；
48.重链设计：将重链可变区和重链恒定区直接拼接形成重链；
49.针对轻链和重链的氨基酸序列，按照人宿主细胞进行密码子优化并常规合成基因，合成同时添加5'(ecori酶切位点)和5'utr([seq id no：20])以及3'utr([tgatga])和3'(hindiii酶切位点)。
[0050]
上述基因委托苏州金唯智生物科技有限公司合成。
[0051]
将基因通过5'ecori和3'hindiii克隆至载体ptt5(氨苄抗性)。挑选克隆进行测序，选择测序正确的菌体进行保种并进行菌体的扩大培养，扩大的菌体用于质粒的提取。构建完成的轻链重组载体和重链重组载体组合命名为php1003。按照上述同样的基因合成与载体构建方法，获得可表达对照抗体的质粒，其中对照抗体的轻链序列如seq id no：18和重链序列如seq id no：19。
[0052]
本实施例中轻、重链序列设计的序列组成如下：
[0053] 序列组成php1003轻链轻链可变区seq id no：2、轻链恒定区seq id no：16php1003重链重链可变区seq id no：3、重链恒定区seq id no：17对照抗体轻链序列seq id no：18、重链序列seq id no：19
[0054]
实施例2抗igf-1r抗体的瞬转表达及结合igf-1r蛋白的检测
[0055]
按照如下的方式对提取后的质粒进行细胞转染和蛋白的分离纯化：
[0056]
1、测定细胞密度，活力应当大于95％，用(预热的)hek293培养基将hek293细胞密度调节成3
×
106细胞/ml，轻轻摇匀并分装细胞(转染量为转染体系的90％)，注意摇瓶中细胞体积不超过摇瓶规格的1/3，放入摇床待用。
[0057]
2、根据转染细胞体积计算转染缓冲液opti-mem的体积，该体积为转染体系的1/10；计算转染试剂pei的量，其比例为3μl/ml转染细胞；计算转染dna的总量，其比例为1μg/ml转染细胞。
[0058]
具体转染的操作过程如下：
[0059]
取1支50ml离心管，加入转染体系10％的mem，加入质粒，混匀后过滤，静置5min，向dna混悬液中加入pei，轻柔混匀(轻轻颠倒混匀2-3次)后静置15-20min。随后将复合物轻柔加入分装好的细胞中，边加入边轻轻晃动摇瓶；转染完成的细胞放入37℃摇床进行培养。
[0060]
培养3天后离心收集培养上清，测定表达上清(表达的轻、重链融合蛋白命名为php1003，具有抗igf-1r抗性)与igf-1r蛋白的亲和力。采用octet red96蛋白质相互作用工作站对上述表达的融合蛋白php1003进行与人igf-1r(human igf-1r，acro，货号igr-h5229)、猴子igf-1r(cyno igf-1r，acro，货号igr-c5225)和大鼠igf-1r(rat igf-1r，acro，货号igr-r5224)蛋白的亲和力检测，选用生物传感器ahc(货号18-5060)对样品进行捕获，之后将捕获的样品与人igf-1r、猴子igf-1r和大鼠igf-1r蛋白进行结合、解离的动力学检测。动力学使用1：1结合模型进行拟合分析。其中简要的作用步骤为：蛋白加载200s，结合180s，解离300s，再生30s。
[0061]
使用fortebio仪器测定亲和力。结果如下表和图1-3所示。
[0062][0063]
实施例3抗igf-1r抗体的分离纯化
[0064]
用常规的亲和纯化方法分离纯化hek293细胞瞬转表达的上清中的抗igf-1r抗体，简要的步骤为用5-10倍体积的结合缓冲液平衡填料柱、上清样品上样、结合缓冲液洗脱杂蛋白、蛋白洗脱。将分离纯化后的蛋白进行sec-hplc纯度检测，检测结果如图4、5所示。其中php1003蛋白纯度为96.44％，对照抗体的纯度为99.76％。
[0065]
实施例4抗igf-1r抗体php1003和对照抗体在甲亢动物模型中的药效
[0066]
本实施例通过腹腔注射牛甲状腺球蛋白诱导大鼠甲状腺功能亢进及甲状腺相关眼病模型，观察php1003对大鼠甲状腺相关眼病的影响，包括以下步骤：
[0067]
(1)模型组大鼠每2周按150μg/只的剂量腹腔注射牛甲状腺球蛋白(sigma-aldrich，货号609310)进行造模，持续4周完成造模。
[0068]
(2)分别用测试品及对照品给药，试验动物分组情况如下表所示：
[0069][0070]
组别设计：正常对照组(sham group)、阴性对照组(vehicle group)、供试品治疗组(l group；h group)、对照抗体组(p.group)，共5组。
[0071]
具体给药方案按照下表操作：
[0072][0073][0074]
(3)给药4周后安乐死动物进行取材。将大鼠安乐死后眼外肌取材，进行组织染色，光镜下采图观察。
[0075]
(4)结果如图6所示：
[0076]
sham组可见肌纤维均质红染，排列整齐，肌间毛细血管丰富，肌间距正常。vehicle组可见各类眼外肌病变，主要包括肌纤维严重肿胀、变性、坏死、溶解，肌间距缩窄或增宽，肌间纤维结缔组织和血管增生。提示sd大鼠甲状腺眼病模型成功建立。
[0077]
php1003-l组可见病变基本涵盖vehicle组各类病变，肌纤维坏死溶解程度较vehiclel组略轻微。php1003-h组病变轻微，肌纤维排列基本整齐，可见部分肌纤维轻微肿胀或变性，说明php1003-h组药物治疗sd大鼠甲状腺眼病有一定效果。p组眼外肌染色结果显示眼外肌肿胀肥大、肌纤维变性、坏死程度较vehicle组减轻，结果说明php1003-h组和p组可减轻大鼠甲状腺眼病眼外肌病变程度。php1003-h组和p组相比，sd大鼠眼外肌病变程度更轻微，p组眼外肌肿胀程度更大，肌间距更窄，说明在同等剂量下php1003-h组对sd大鼠甲状腺眼病的治疗效果更优异。