一种快速初步筛查污染奶样中支原体的系统及其方法与流程

1.本发明涉及一种牛奶支原体检测方法，属生物培养基制备及生物检测技术领域。


背景技术：

2.传染性乳房炎：是由传染性致病菌感染引起奶牛临床或者隐性乳房炎，特点是传染性乳房炎感染动物后，临床感染率逐步上升；病原可以通过器械、人员传染，甚至饲料、水源。牛支原体感染头胎奶牛后，会导致感染动物的后期经产胎次泌乳量的下降，由高产牛变为低产牛。目前金黄色葡萄球菌、无乳链球菌均为传染性乳房炎的致病病原。此外牛支原体（m. bovis） 也为牛传染性乳房炎的常见致病原，牛支原体可导致牛的局部炎症,如肺,乳房,生殖道,关节发炎甚至引起不孕等疾病。主要引起乳腺炎，导致泌乳锐减。
3.目前牛传染性乳房炎常见牛支原体筛查诊断方法主要为菌落观察法、核酸检测法、探针法、荧光显色法及显色法，虽然可以满足检测作业的需要，但检测效率低、检测作业精度差且检测作业时的成本及劳动强度也相对较高。
4.因此针对这一问题，迫切需要开发一种快速初步筛查污染奶样中支原体的系统及其方法，以满足实际使用的需要。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术上的不足，本发明提供一种快速初步筛查污染奶样中支原体的系统及其方法。
6.一种快速初步筛查污染奶样中支原体的系统，包括离心机、过滤器、培养皿、色度检测仪，其中所述离心机通过导流管与至少一个过滤器连接，所述过滤器另与若干培养皿连接，且各培养皿相互并联，所述色度检测仪位于培养皿上方，其光轴与培养皿上端面呈30
°
—90
°
夹角。
7.优选的，所述培养皿包括承载架、承载托盘、培养盘、透明密封盖、温度传感器、单向阀、超声波振荡机构、硅胶加热条及控制电路，所述承载架为轴线与水平面垂直分布的柱状框架结构，所述承载托盘为横断面呈“凵”字形的闭合环状结构，嵌于承载架上端面并与承载架同轴分布，所述培养盘嵌于承载托盘上端面内，与承载托盘槽底相抵并同轴分布，所述培养盘、透明密封盖均为横断面呈“凵”字形槽状结构，且透明密封盖包覆在培养盘上端面并与培养盘构成闭合腔体结构，且所述透明密封盖侧表面通过转台机构与承载架上端面铰接，所述透明密封盖上设一个加液口和一个排气口，且加液口和排气口对称分布在培养盘轴线两侧，并与培养盘轴线呈0
°
—60
°
夹角，且加液口和排气口均与一个单向阀连接，所述温度传感器嵌于承载托盘内，与承载托盘同轴分布并通过弹性连接机构与承载托盘内侧面连接，所述硅胶加热条至少一条，嵌于承载托盘槽底上表面并为与承载托盘同轴分布的闭合环状结构，所述超声波振荡机构嵌于承载托盘侧壁外表面，并环绕承载托盘轴线均布，所述控制电路嵌于承载机架外表面，并分别与温度传感器、单向阀、超声波振荡机构、硅胶加热条及转台机构电气连接。
8.一种快速初步筛查污染奶样中支原体的筛查方法，包括如下步骤;s1，奶液预处理，以1—5ml作为一份奶样，然后对至少一份奶样通过离心机进行离心作业，并对离心后的奶样通过过滤器以0.40
‑
0.45
µ
m进行过滤处理并对滤液进行收集备用；s2，培养检测，将s1步骤收集的滤液与液体培养基一同添加到培养皿中进行培养作业，并在培养20—60分钟后通过色度检测仪进行显色法检测，即可得到支原体检测结果。
9.进一步的，所述的液体培养基由以下重量份数组组分构成：pplo肉汤10%—15%、复合马血清5%—11%、25%酵母浸出液13%—21%、氨苄青霉素2.3%—4.5%、万古霉素2.1%—3.5%、葡萄糖3%—6%、丙酮酸钠0.5%—1.8%、牛肺消化液1.5%—3.1%和1%酚红0.3%—2.3%，复合厄氏培养基0—11%，余量为超纯水。
10.进一步的，所述的氨苄青霉素为5
‑
8万单位。
11.进一步的，所述的25%酵母浸出液的制备方法为：将鲜酵母溶于质量为鲜酵母质量1.5—5倍的超纯水中并搅拌均匀，并在鲜酵母充分溶解后煮沸并持续15min，然后以10—20℃/min的速度快速冷却至常温，并对冷却液以3500—5000r/min离心分离15min，提取上清液，然后对上清液再次煮沸并持续15min，并以10—20℃/min的速度快速冷却至常温，最后用k型澄清滤极过滤后，再用0. 22um无菌滤膜过滤除菌，取滤液并对滤液以4℃恒温保存即可。
12.进一步的，所述的牛肺消化液制备方法为：第一步，牛肺煮制，将健康的牛肺搅碎，并使牛肺颗粒粒径不大于1毫米，并将牛肺颗粒与质量为牛肺颗粒质量2.5—6倍的超纯水混合，然后将混合液在电炉上加热至60℃—80℃并持续搅拌；第二步，混合物调制，对第一步中制得的混合液加热保温1—10分钟后向混合液中加入占混合液总量0.3%—1.1%的碳酸钠，并持续保温搅拌至少1分钟，然后冷却至45℃并再次向混合液中加入占混合液总量0.8%—2.1%的胰酶溶液，最后对混合液以45 ℃恒温条件下水浴3h，并在水浴过程中去除液面油脂，同时向混合液中加入占混合液总量0.9%—1.8%的浓盐酸并搅拌均匀；第三步，过滤收集，将第二步制备得到的混合液煮沸并持续15 min后冷却至常温，然后经双层纱布过滤，并对滤液以2500—4000 r/min离心分离15 min，收集滤液，并对滤液采用滤纸过滤，然后将滤纸过滤后的滤液煮沸并持续15 min，然后冷却至室温，并以 naoh溶液将混合液ph值调至7.8，最后以121 ℃灭菌15 min，并4℃恒温保存即可。
13.进一步的，所述的液体培养基制备方法为：第一步，调制处理，将pplo肉汤，丙酮酸钠，mem，牛肺消化液，1%酚红与超纯水充分混合，并调ph值至7.8，然后由121℃灭菌15min，冷却至50
‑
55℃；第二步，二次处理，将复合马血清，酵母浸出液，氨苄青霉素,万古霉素添加到第一步制备的混合液中并混合均匀，然后对混合液ph值至7.8，即可得到成品。
14.本发明利用液体培养基对预处理后的牛乳样本进行培养通过显色反应指示实验结果，较传统的检测方法极大的提高了检测效率，降低了检测成本，达到快速筛查致病病原及对牛传染性乳房炎进行初步诊断的目的，有效减少牧场或者乳企中乳汁的初步筛查的工作成本及劳动强度，并可及时发现可疑的奶样，从而提高了鲜奶质量检测的精度和效率。
附图说明
15.下面结合附图和具体实施方式来详细说明本发明；图1为本发明系统结构示意图；图2为培养皿结构示意图；图3为筛查方法方法流程图；图4为牛肺消化液制备方法流程图；图5为液体培养基制备方法流程示意图。
16.图中各标号：离心机1、过滤器2、培养皿3、色度检测仪4、转台机构5、加液口6、排气口7、弹性连接机构8、滑槽9、承载架31、承载托盘32、培养盘33、透明密封盖34、温度传感器35、单向阀36、超声波振荡机构37、硅胶加热条38、控制电路39、承载弹簧321、弹性垫块322、定位槽323。
具体实施方式
17.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于施工，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
18.如图1所示，一种快速初步筛查污染奶样中支原体的系统，包括离心机1、过滤器2、培养皿3、色度检测仪4，其中所述离心机1通过导流管与至少一个过滤器2连接，所述过滤器2另与若干培养皿3连接，且各培养皿3相互并联，所述色度检测仪4位于培养皿3上方，其光轴与培养皿3上端面呈30
°
—90
°
夹角。
19.参见图2，所述培养皿3包括承载架31、承载托盘32、培养盘33、透明密封盖34、温度传感器35、单向阀36、超声波振荡机构37、硅胶加热条38及控制电路39，所述承载架31为轴线与水平面垂直分布的柱状框架结构，所述承载托盘32为横断面呈“凵”字形的闭合环状结构，嵌于承载架31上端面并与承载架31同轴分布，所述培养盘33嵌于承载托盘32上端面内，与承载托盘32槽底相抵并同轴分布，所述培养盘33、透明密封盖34均为横断面呈“凵”字形槽状结构，且透明密封盖34包覆在培养盘33上端面并与培养盘33构成闭合腔体结构，且所述透明密封盖34侧表面通过转台机构5与承载架31上端面铰接，所述透明密封盖34上设一个加液口6和一个排气口7，且加液口6和排气口7对称分布在培养盘33轴线两侧，并与培养盘33轴线呈0
°
—60
°
夹角，且加液口6和排气口7均与一个单向阀36连接，所述温度传感器35嵌于承载托盘32内，与承载托盘32同轴分布并通过弹性连接机构8与承载托盘32内侧面连接，所述硅胶加热条38至少一条，嵌于承载托盘32槽底上表面并为与承载托盘32同轴分布的闭合环状结构，所述超声波振荡机构37嵌于承载托盘32侧壁外表面，并环绕承载托盘32轴线均布，所述控制电路39嵌于承载机架31外表面，并分别与温度传感器35、单向阀36、超声波振荡机构37、硅胶加热条38及转台机构5电气连接。
20.与此同时，所述承载托盘32嵌于承载架31上端面内，其外侧面通过滑槽9与承载架31内侧面滑动连接。
21.此外，所述承载托盘32槽底上端面均布若干环绕承载托盘32轴线均布承载弹簧321及与承载弹簧321上端面连接的弹性垫块322，所述承载弹簧321轴线与承载托盘32轴线平行分布，其下端面与承载托盘32槽底连接，且承载弹簧321对应的承载托盘32下端面设与承载弹簧321同轴分布的定位槽323，且承载弹簧321下半部嵌于定位槽323且位于定位槽
323内的承载弹簧321的长度不小于承载弹簧321长度的10%。
22.实施例1参见图3一种快速初步筛查污染奶样中支原体的筛查方法，包括如下步骤;s1，奶液预处理，以1作为一份奶样，然后对至少一份奶样通过离心机1进行离心作业，并对离心后的奶样通过过滤器2以0.40
‑µ
m进行过滤处理并对滤液进行收集备用；s2，培养检测，将s1步骤收集的滤液与液体培养基一同添加到培养皿3中进行培养作业，并在培养20分钟后通过色度检测仪4进行显色法检测，即可得到支原体检测结果。
23.本实施例中，所述的液体培养基由以下重量份数组组分构成：pplo肉汤10%、复合马血清5%、25%酵母浸出液13%、氨苄青霉素2.3%、万古霉素2.1%、葡萄糖3%、丙酮酸钠0.5%、牛肺消化液1.5%和1%酚红0.3%，余量为超纯水。
24.其中，所述的氨苄青霉素为5万单位。
25.值得注意的，所述的25%酵母浸出液的制备方法为：将鲜酵母溶于质量为鲜酵母质量1.5—5倍的超纯水中并搅拌均匀，并在鲜酵母充分溶解后煮沸并持续15min，然后以10℃/min的速度快速冷却至常温，并对冷却液以3500r/min离心分离15min，提取上清液，然后对上清液再次煮沸并持续15min，并以10℃/min的速度快速冷却至常温，最后用k型澄清滤极过滤后，再用0.22um无菌滤膜过滤除菌，取滤液并对滤液以4℃恒温保存即可。
26.参见图4，所述的牛肺消化液制备方法为：第一步，牛肺煮制，将健康的牛肺搅碎，并使牛肺颗粒粒径不大于1毫米，并将牛肺颗粒与质量为牛肺颗粒质量2.5倍的超纯水混合，然后将混合液在电炉上加热至60℃并持续搅拌；第二步，混合物调制，对第一步中制得的混合液加热保温1—10分钟后向混合液中加入占混合液总量0.3%的碳酸钠，并持续保温搅拌至少1分钟，然后冷却至45℃并再次向混合液中加入占混合液总量0.8%的胰酶溶液，最后对混合液以45 ℃恒温条件下水浴3h，并在水浴过程中去除液面油脂，同时向混合液中加入占混合液总量0.9%的浓盐酸并搅拌均匀；第三步，过滤收集，将第二步制备得到的混合液煮沸并持续15 min后冷却至常温，然后经双层纱布过滤，并对滤液以2500 r/min离心分离15 min，收集滤液，并对滤液采用滤纸过滤，然后将滤纸过滤后的滤液煮沸并持续15 min，然后冷却至室温，并以 naoh溶液将混合液ph值调至7.8，最后以121 ℃灭菌15 min，并4℃恒温保存即可。
27.参见图5，所述的液体培养基制备方法为：第一步，调制处理，将pplo肉汤，丙酮酸钠，mem，牛肺消化液，1%酚红与超纯水充分混合，并调ph值至7.8，然后由121℃灭菌15min，冷却至50
‑
55℃；第二步，二次处理，将复合马血清，酵母浸出液，氨苄青霉素,万古霉素添加到第一步制备的混合液中并混合均匀，然后对混合液ph值至7.8，即可得到成品。
28.实施例2参见图3，一种快速初步筛查污染奶样中支原体的筛查方法，包括如下步骤;s1，奶液预处理，以5ml作为一份奶样，然后对至少一份奶样通过离心机1进行离心作业，并对离心后的奶样通过过滤器2以0.45
µ
m进行过滤处理并对滤液进行收集备用；s2，培养检测，将s1步骤收集的滤液与液体培养基一同添加到培养皿3中进行培养
作业，并在培养60分钟后通过色度检测仪4进行显色法检测，即可得到支原体检测结果。
29.其中，所述的液体培养基由以下重量份数组组分构成：pplo肉汤15%、复合马血清11%、25%酵母浸出液21%、氨苄青霉素4.5%、万古霉素3.5%、葡萄糖6%、丙酮酸钠1.8%、牛肺消化液3.1%和1%酚红2.3%，复合厄氏培养基11%，余量为超纯水，所述的氨苄青霉素为8万单位。
30.本实施例中，所述的25%酵母浸出液的制备方法为：将鲜酵母溶于质量为鲜酵母质量5倍的超纯水中并搅拌均匀，并在鲜酵母充分溶解后煮沸并持续15min，然后以20℃/min的速度快速冷却至常温，并对冷却液以5000r/min离心分离15min，提取上清液，然后对上清液再次煮沸并持续15min，并以20℃/min的速度快速冷却至常温，最后用k型澄清滤极过滤后，再用0.22um无菌滤膜过滤除菌，取滤液并对滤液以4℃恒温保存即可。
31.参见图4，，所述的牛肺消化液制备方法为：第一步，牛肺煮制，将健康的牛肺搅碎，并使牛肺颗粒粒径不大于1毫米，并将牛肺颗粒与质量为牛肺颗粒质量6倍的超纯水混合，然后将混合液在电炉上加热至80℃并持续搅拌；第二步，混合物调制，对第一步中制得的混合液加热保温1—10分钟后向混合液中加入占混合液总量1.1%的碳酸钠，并持续保温搅拌至少1分钟，然后冷却至45℃并再次向混合液中加入占混合液总量2.1%的胰酶溶液，最后对混合液以45 ℃恒温条件下水浴3h，并在水浴过程中去除液面油脂，同时向混合液中加入占混合液总量1.8%的浓盐酸并搅拌均匀；第三步，过滤收集，将第二步制备得到的混合液煮沸并持续15 min后冷却至常温，然后经双层纱布过滤，并对滤液以4000 r/min离心分离15 min，收集滤液，并对滤液采用滤纸过滤，然后将滤纸过滤后的滤液煮沸并持续15 min，然后冷却至室温，并以 naoh溶液将混合液ph值调至7.8，最后以121 ℃灭菌15 min，并4℃恒温保存即可。
32.参见图5，本实施例中，所述的液体培养基制备方法为：第一步，调制处理，将pplo肉汤，丙酮酸钠，mem，牛肺消化液，1%酚红与超纯水充分混合，并调ph值至7.8，然后由121℃灭菌15min，冷却至50
‑
55℃；第二步，二次处理，将复合马血清，酵母浸出液，氨苄青霉素,万古霉素添加到第一步制备的混合液中并混合均匀，然后对混合液ph值至7.8，即可得到成品。
33.实施例3参见图3，一种快速初步筛查污染奶样中支原体的筛查方法，包括如下步骤;s1，奶液预处理，以2ml作为一份奶样，然后对至少一份奶样通过离心机1进行离心作业，并对离心后的奶样通过过滤器2以0.43
µ
m进行过滤处理并对滤液进行收集备用；s2，培养检测，将s1步骤收集的滤液与液体培养基一同添加到培养皿3中进行培养作业，并在培养30分钟后通过色度检测仪4进行显色法检测，即可得到支原体检测结果。
34.其中，所述的液体培养基由以下重量份数组组分构成：pplo肉汤12%、复合马血清8%、25%酵母浸出液15%、氨苄青霉素3.5%、万古霉素2.5%、葡萄糖4.1%、丙酮酸钠0.8%、牛肺消化液2.1%和1%酚红1.3%，余量为超纯水。
35.进一步优化，所述的氨苄青霉素为6万单位。
36.重点说明的，所述的25%酵母浸出液的制备方法为：
将鲜酵母溶于质量为鲜酵母质量2.5倍的超纯水中并搅拌均匀，并在鲜酵母充分溶解后煮沸并持续15min，然后以15℃/min的速度快速冷却至常温，并对冷却液以4000r/min离心分离15min，提取上清液，然后对上清液再次煮沸并持续15min，并以15℃/min的速度快速冷却至常温，最后用k型澄清滤极过滤后，再用0. 22um无菌滤膜过滤除菌，取滤液并对滤液以4℃恒温保存即可。
37.参见图4，，所述的牛肺消化液制备方法为：第一步，牛肺煮制，将健康的牛肺搅碎，并使牛肺颗粒粒径不大于1毫米，并将牛肺颗粒与质量为牛肺颗粒质量3倍的超纯水混合，然后将混合液在电炉上加热至70℃并持续搅拌；第二步，混合物调制，对第一步中制得的混合液加热保温5分钟后向混合液中加入占混合液总量0.8%的碳酸钠，并持续保温搅拌至少1分钟，然后冷却至45℃并再次向混合液中加入占混合液总量1.5%的胰酶溶液，最后对混合液以45 ℃恒温条件下水浴3h，并在水浴过程中去除液面油脂，同时向混合液中加入占混合液总量1.3%的浓盐酸并搅拌均匀；第三步，过滤收集，将第二步制备得到的混合液煮沸并持续15 min后冷却至常温，然后经双层纱布过滤，并对滤液以3000 r/min离心分离15 min，收集滤液，并对滤液采用滤纸过滤，然后将滤纸过滤后的滤液煮沸并持续15 min，然后冷却至室温，并以 naoh溶液将混合液ph值调至7.8，最后以121 ℃灭菌15 min，并4℃恒温保存即可。
38.参见图5，本实施例中，所述的液体培养基制备方法为：第一步，调制处理，将pplo肉汤，丙酮酸钠，mem，牛肺消化液，1%酚红与超纯水充分混合，并调ph值至7.8，然后由121℃灭菌15min，冷却至50
‑
55℃；第二步，二次处理，将复合马血清，酵母浸出液，氨苄青霉素,万古霉素添加到第一步制备的混合液中并混合均匀，然后对混合液ph值至7.8，即可得到成品。
39.实施例4参见图3，一种快速初步筛查污染奶样中支原体的筛查方法，包括如下步骤;s1，奶液预处理，以3ml作为一份奶样，然后对至少一份奶样通过离心机1进行离心作业，并对离心后的奶样通过过滤器2以0.43
µ
m进行过滤处理并对滤液进行收集备用；s2，培养检测，将s1步骤收集的滤液与液体培养基一同添加到培养皿3中进行培养作业，并在培养40分钟后通过色度检测仪4进行显色法检测，即可得到支原体检测结果。
40.重点说明的，所述的液体培养基由以下重量份数组组分构成：pplo肉汤12%、复合马血清8%、25%酵母浸出液14%、氨苄青霉素3.1%、万古霉素2.5%、葡萄糖4.1、丙酮酸钠1.4、牛肺消化液2.1%和1%酚红2.1%，余量为超纯水。
41.本实施例中，所述的氨苄青霉素为6万单位。
42.重点说明的，所述的25%酵母浸出液的制备方法为：将鲜酵母溶于质量为鲜酵母质量3倍的超纯水中并搅拌均匀，并在鲜酵母充分溶解后煮沸并持续15min，然后以20℃/min的速度快速冷却至常温，并对冷却液以4000r/min离心分离15min，提取上清液，然后对上清液再次煮沸并持续15min，并以15℃/min的速度快速冷却至常温，最后用k型澄清滤极过滤后，再用0. 22um无菌滤膜过滤除菌，取滤液并对滤液以4℃恒温保存即可。
43.采用上述方法制备得到的酵母浸出液具备以下优点: 搅拌均匀增加了鲜酵母的
溶解性，使用k型澄清滤极过滤的浸出液颜色为淡黄色，尽量避免对培养基浑浊度的干扰, 使用0.22um无菌滤膜过滤除菌避免了高温高压灭菌法对浸出液成份的破坏。
44.参见图4，，所述的牛肺消化液制备方法为：第一步，牛肺煮制，将健康的牛肺搅碎，并使牛肺颗粒粒径不大于1毫米，并将牛肺颗粒与质量为牛肺颗粒质量4.5倍的超纯水混合，然后将混合液在电炉上加热至70℃并持续搅拌；第二步，混合物调制，对第一步中制得的混合液加热保温5分钟后向混合液中加入占混合液总量0.8%的碳酸钠，并持续保温搅拌至少1分钟，然后冷却至45℃并再次向混合液中加入占混合液总量1.1%的胰酶溶液，最后对混合液以45 ℃恒温条件下水浴3h，并在水浴过程中去除液面油脂，同时向混合液中加入占混合液总量0.3%的浓盐酸并搅拌均匀；第三步，过滤收集，将第二步制备得到的混合液煮沸并持续15 min后冷却至常温，然后经双层纱布过滤，并对滤液以3000 r/min离心分离15 min，收集滤液，并对滤液采用滤纸过滤，然后将滤纸过滤后的滤液煮沸并持续15 min，然后冷却至室温，并以 naoh溶液将混合液ph值调至7.8，最后以121 ℃灭菌15 min，并4℃恒温保存即可。
45.参见图5，本实施例中，所述的液体培养基制备方法为：第一步，调制处理，将pplo肉汤，丙酮酸钠，mem，牛肺消化液，1%酚红与超纯水充分混合，并调ph值至7.8，然后由121℃灭菌15min，冷却至53℃；第二步，二次处理，将复合马血清，酵母浸出液，氨苄青霉素,万古霉素添加到第一步制备的混合液中并混合均匀，然后对混合液ph值至7.8，即可得到成品。
46.本发明 利用液体培养基对预处理后的牛乳样本进行培养通过显色反应指示实验结果，较传统的检测方法极大的提高了检测效率，降低了检测成本，达到快速筛查致病病原及对牛传染性乳房炎进行初步诊断的目的，有效减少牧场或者乳企中乳汁的初步筛查的工作成本及劳动强度，并可及时发现可疑的奶样，从而提高了鲜奶质量检测的精度和效率。
47.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。