基因疗法DNA载体及其应用的制作方法

技术特征：
1.基于基因疗法dna载体vtvaf17的基因疗法dna载体，用于治疗与皮肤、毛发和指甲结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林
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德戈斯二氏病、oberst
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lehn
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hauss色素性皮肤病、naegeli
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franceschetti
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jadassohn综合征和棕色釉质，其中所述基因疗法dna载体具有克隆至基因疗法dna载体vtvaf17的krt5治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列seq id no.1的4929bp基因疗法dna载体vtvaf17
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krt5。2.基于基因疗法dna载体vtvaf17的基因疗法dna载体，用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林
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德戈斯二氏病、oberst
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lehn
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hauss色素性皮肤病、naegeli
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franceschetti
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jadassohn综合征和棕色釉质，其中所述基因疗法dna载体具有克隆至基因疗法dna载体vtvaf17的krt14治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列seq id no.2的4575bp基因疗法dna载体vtvaf17
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krt14。3.基于基因疗法dna载体vtvaf17的基因疗法dna载体，用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林
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德戈斯二氏病、oberst
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lehn
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hauss色素性皮肤病、naegeli
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franceschetti
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jadassohn综合征和棕色釉质，其中所述基因疗法dna载体具有克隆至基因疗法dna载体vtvaf17的lamb3治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列seq id no.3的6674bp的基因疗法dna载体vtvaf17
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lamb3。4.基于基因疗法dna载体vtvaf17的基因疗法dna载体，用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林
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德戈斯二氏病、oberst
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lehn
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hauss色素性皮肤病、naegeli
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franceschetti
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jadassohn综合征和棕色釉质，其中所述基因疗法dna载体具有克隆至基因疗法dna载体vtvaf17的col7a1治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列seq id no.4的11990bp的基因疗法dna载体vtvaf17
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col7a1。5.根据权利要求1、2、3或4所述的基于基因疗法dna载体vtvaf17的基因疗法dna载体，其携带krt5、krt14、lamb3或col7a1治疗性基因，所述基因疗法dna载体由于如下的实情是独特的，即每种构建的基因疗法dna载体：根据权利要求1、2、3或4所述的vtvaf17
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krt5、或vtvaf17
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krt14、或vtvaf17
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lamb3、或vtvaf17
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col7a1由于vtvaf17载体部分不超过3200bp的有限大小而具有有效渗入人和动物细胞并表达克隆至其中的krt5、或krt14、或lamb3、或col7a1治疗性基因的能力。6.根据权利要求1、2、3或4所述的基于基因疗法dna载体vtvaf17的基因疗法dna载体，其携带krt5、krt14、lamb3或col7a1治疗性基因，所述基因疗法dna载体由于如下的实情是独特的，即每种构建的基因疗法dna载体：根据权利要求1、2、3或4所述的vtvaf17
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krt5、或vtvaf17
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krt14、或vtvaf17
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lamb3、或vtvaf17
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col7a1使用核苷酸序列作为结构元件，所述核苷酸序列不是抗生素抗性基因、病毒基因或病毒基因组调控元件，从而确保其安全用于人和动物的基因疗法。7.根据权利要求1、2、3或4所述的携带krt5、krt14、lamb3和col7a1治疗性基因的基于基因疗法dna载体vtvaf17的基因疗法dna载体的产生方法，所述方法涉及如下获得基因疗法dna载体中的每一种：vtvaf17
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krt5、或vtvaf17
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krt14、或vtvaf17
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lamb3、或vtvaf17
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col7a1：将根据权利要求1、2、3或4中所述的krt5、或krt14、或lamb3、或col7a1治疗性基因的编码区克隆至基因疗法dna载体vtvaf17中，并且分别获得基因疗法dna载体vtvaf17
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krt5，seq id no.1、或vtvaf17
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krt14，seq id no.2、或vtvaf17
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lamb3，seq id no.3、或vtvaf17
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col7a1，seq id no.4，其中所述krt5、或krt14、或lamb3或col7a1治疗性基因的编码区如下获得：通过从人生物组织样本中分离总rna，然后使用获得的寡核苷酸进行反转录反应和pcr扩增，并通过相应的限制性内切酶切割扩增产物，其中通过bamhii和hindiii、或sali和ecori限制位点进行对所述基因疗法dna载体vtvaf17的克隆，其中在无抗生素的情况下进行选择，其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法dna载体vtvaf17
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krt5，seq id no.1生产过程中用于所述反转录反应和pcr扩增：krt5_ftttggatccaccatgtctcgccagtcaagtgtgtccttc，krt5_raataagcttctagctcttgaagctcttccgggagg，并且通过bamhii和hindiii限制性内切酶进行扩增产物的切割和将krt5基因的编码区克隆至基因疗法dna载体vtvaf17中，其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法dna载体vtvaf17
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krt14，seq id no.2生产过程中用于所述反转录反应和pcr扩增：krt14_ftttggatccaccatgaccacctgcagccgccag，krt14_raataagctttcagttcttggtgcgaaggacctgc，并且通过bamhii和hindiii限制性内切酶进行扩增产物的切割和将krt14基因的编码区克隆至基因疗法dna载体vtvaf17中，其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法dna载体vtvaf17
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lamb3，seq id no.3生产过程中用于所述反转录反应和pcr扩增：lamb3_fttagtcgaccaccatgagaccattcttcctcttg，lamb3_ratagaattcacttgcaggtggcatagtagag，并且通过sali和ecori限制性内切酶进行扩增产物的切割和将lamb3基因的编码区克隆至基因疗法dna载体vtvaf17中，其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法dna载体vtvaf17
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col7a1，seq id no.4生产过程中用于所述反转录反应和pcr扩增：col7a1_fatcgtcgaccaccatgacgctgcggcttctggt，col7a1_r atagaattcagtcctgggcagtacctgtc，并且通过sali和ecori限制性内切酶进行扩增产物的切割和将col7a1基因的编码区克隆至基因疗法dna载体vtvaf17中。8.使用根据权利要求1、2、3或4所述的携带krt5、krt14、lamb3和col7a1治疗性基因的基于基因疗法dna载体vtvaf17的基因疗法dna载体用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林
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德戈斯二氏病、oberst
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hauss色素性皮肤病、naegeli
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franceschetti
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jadassohn综合征和棕色釉质的方法，所述方法涉及用从基于基因疗法dna载体vtvaf17的携带治疗性基因的所构建的基因疗法dna载体的组选择的基于基因疗法dna载体vtvaf17的携带治疗性基因的基因疗法dna载体，或选择的若干种基于基因
疗法dna载体vtvaf17的携带治疗性基因的基因疗法dna载体转染患者或动物器官和组织的细胞；和/或将通过从基于基因疗法dna载体vtvaf17的携带治疗性基因的所构建的基因疗法dna载体选择的基于基因疗法dna载体vtvaf17的携带治疗性基因的基因疗法dna载体或选择的若干种基于基因疗法dna载体vtvaf17的携带治疗性基因的基因疗法dna载体转染的所述患者或动物的自体细胞注射入相同患者或动物的器官和组织；和/或将从基于基因疗法dna载体vtvaf17的携带治疗性基因的所构建的基因疗法dna载体的组选择的基于基因疗法dna载体vtvaf17的携带治疗性基因的基因疗法dna载体或选择的若干种基于基因疗法dna载体vtvaf17的携带治疗性基因的基因疗法dna载体注射入相同患者或动物的器官和组织，或所指示的方法的组合。9.用于构建根据权利要求1、2、3或4所述的基因疗法dna载体的菌株的生产方法，所述基因疗法dna载体用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林
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德戈斯二氏病、oberst
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jadassohn综合征和棕色釉质，所述方法涉及制备大肠杆菌菌株scs110
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af的电感受态细胞，并用基因疗法dna载体vtvaf17
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krt5、或基因疗法dna载体vtvaf17
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krt14、或基因疗法dna载体vtvaf17
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lamb3、或基因疗法dna载体vtvaf17
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col7a1对这些细胞进行电穿孔，之后，将细胞倒入含有选择性培养基的琼脂板(培养皿)，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖和10μg/ml氯霉素，并且作为结果，获得大肠杆菌菌株scs110
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af/vtvaf17
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krt5、或大肠杆菌菌株scs110
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af/vtvaf17
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krt14、或大肠杆菌菌株scs110
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af/vtvaf17
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lamb3、或大肠杆菌菌株scs110
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af/vtvaf17
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col7a1。10.根据权利要求9获得的大肠杆菌菌株scs110
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af/vtvaf17
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krt5，其携带基因疗法dna载体vtvaf17
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krt5以供其生产，在基因疗法dna载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法dna载体用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林
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德戈斯二氏病、oberst
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lehn
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hauss色素性皮肤病、naegeli
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franceschetti
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jadassohn综合征和棕色釉质。11.根据权利要求9获得的大肠杆菌菌株scs110
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af/vtvaf17
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krt14，其携带基因疗法dna载体vtvaf17
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krt14以供其生产，在基因疗法dna载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法dna载体用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林
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德戈斯二氏病、oberst
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hauss色素性皮肤病、naegeli
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jadassohn综合征和棕色釉质。12.根据权利要求9获得的大肠杆菌菌株scs110
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af/vtvaf17
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lamb3，其携带基因疗法dna载体vtvaf17
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lamb3以供其生产，在基因疗法dna载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法dna载体用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林
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德戈斯二氏病、oberst
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hauss色素性皮肤病、naegeli
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jadassohn综合征和棕色釉质。13.根据权利要求9获得的大肠杆菌菌株scs110
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af/vtvaf17
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col7a1，其携带基因疗法
dna载体vtvaf17
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col7a1以供其生产，在基因疗法dna载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法dna载体用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林
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jadassohn综合征和棕色釉质。14.根据权利要求1、2、3或4所述的携带krt5、或krt14、或lamb3、或col7a1治疗性基因的基于基因疗法dna载体vtvaf17的基因疗法dna载体在工业规模上的生产方法，所述基因疗法dna载体用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林
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德戈斯二氏病、oberst
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hauss色素性皮肤病、naegeli
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jadassohn综合征和棕色釉质，所述方法涉及如下产生基因疗法dna载体vtvaf17
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krt5、或基因疗法dna载体vtvaf17
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krt14、或基因疗法dna载体vtvaf17
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lamb3、或基因疗法dna载体vtvaf17
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col7a1：通过用选自大肠杆菌菌株scs110
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af/vtvaf17
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krt5、或大肠杆菌菌株scs110
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af/vtvaf17
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krt14、或大肠杆菌菌株scs110
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af/vtvaf17
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lamb3、或大肠杆菌菌株scs110
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af/vtvaf17
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col7a1的种子培养物对含有所制备的培养基的培养烧瓶接种，然后将细胞培养物在培养箱摇床孵育，并转移至工业发酵罐，然后培养至稳定期，然后提取含有靶dna产物的级份，多级过滤，并通过色谱方法进行纯化。

技术总结
本发明涉及基因工程，并且可以在生物技术、医学和农业中用于制造基因疗法产品。构建携带治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，以提高人和动物中该治疗性基因的表达水平，所述治疗性基因选自KRT5、KRT14、LAMB3、和COL7A1基因的组，其中基因疗法DNA载体VTvaf17


技术研发人员：N.萨韦利瓦
受保护的技术使用者：普罗里夫涅创新技术有限责任公司
技术研发日：2019.12.20
技术公布日：2021/10/15