富含次生代谢物的植物组织中DNA的提取方法与流程

技术特征：
1.一种富含次生代谢物的植物组织中dna的提取方法，其特征在于，包括干扰物处理、组织细胞裂解、盐析、dna沉淀和清洗步骤，其中，所述干扰物处理步骤包括：将所述植物组织同交联聚乙烯吡咯烷酮一起研磨；以及加入漂洗液对研磨后的所述植物组织进行干扰物漂洗处理；其中，所述漂洗液包括：100～500mm tris
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hcl ph＝4.8、0.35～0.5m山梨醇、5～10mm edta ph＝4.8、1～5％pvp和0.5～2％巯基乙醇。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述盐析包括：在所述组织细胞裂解后加入裂解液体积1/5
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1/2的3m醋酸钾溶液ph＝4.8进行盐析处理。3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述提取方法具体包括以下步骤：s1，将所述植物组织在预冷的研磨管中利用研磨器研磨成粉末状，研磨前所述研磨管中加入有交联聚乙烯吡咯烷酮粉末；s2，加入漂洗液对研磨后的所述植物组织进行干扰物漂洗处理，混匀离心弃上清液；s3，向所述研磨管中加入2～5％ctab裂解液，混匀，使所述植物组织悬浮，水浴，取出后，室温静置，离心取上清液；s4，向所述s3中得到的上清液中加入3m醋酸钾溶液ph＝4.8，所述醋酸钾溶液的加入量是所述上清液体积的1/5～1/2，离心取上清；s5，向所述s4中得到的上清中加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提后取上清、然后加入等体积氯仿/异戊醇抽提后取上清；s6，向所述s5中得到的上清中加入异丙醇进行dna沉淀，弃上清；s7，利用75％乙醇清洗所述dna沉淀；s8，所述dna沉淀干燥后加入洗脱缓冲液溶解所述dna沉淀，加入rnase a酶消化rna。4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述s2中的离心力为2500g～3000g，离心时间为10～15min，所述s2重复2次或2次以上。5.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述s3中，所述ctab裂解液为预热至65℃的ctab裂解液，所述水浴的温度为65℃，水浴的时间为30～60min。6.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述s4中，向所述s3中得到的上清中加入所述醋酸钾溶液后，于
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20～
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15℃放置10～20min，离心后取上清。7.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述s5中，所述苯酚/氯仿/异戊醇中苯酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1；所述氯仿/异戊醇中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。8.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述s6中，所述异丙醇为预冷后的异丙醇，加入体积为上清液体积的0.8倍，然后在
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20℃中放置30min，进行dna沉淀。9.根据权利要求4～8中任一项所述的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：s1，将所述植物组织转移到已放入陶瓷研磨珠且预冷后的2ml研磨管中，随后加入所述植物组织重量1/10
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1/2的交联聚乙烯吡咯烷酮粉末，用研磨器将所述植物组织研磨成粉末状；s2，向所述研磨管中加入所述漂洗液，混匀后，2500g～3000g离心10～15min，弃上清液；重复漂洗3～5次；
s3，向所述研磨管中加入65℃预热的2～5％ctab裂解液，混匀，使所述植物组织悬浮，65℃水浴30～60min；取出后，室温静置1min，离心后转移上清到新管；s4，向所述s3中得到的上清中加入上清液体积1/5
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1/2的3m醋酸钾溶液ph＝4.8，混匀，于
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20～
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15℃放置10～20min，离心后取上清；s5，向所述s4中得到的上清中加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提后取上清、然后加入等体积氯仿/异戊醇抽提后取上清；s6，向所述s5中得到的上清中加入上清液0.8倍体积的异丙醇，混匀，
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20℃放置30min进行dna沉淀，离心后弃上清；s7，利用75％乙醇清洗所述dna沉淀两次；s8，所述dna沉淀干燥后加入洗脱缓冲液溶解所述dna沉淀，加入10mg/ml rnasea酶放置在37℃金属浴上消化rna。10.根据权利要求9所述的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：s1，将0.05g所述植物组织加入到已放入陶瓷研磨珠且预冷后的2ml研磨管中，加入0.025g的交联聚乙烯吡咯烷酮粉末，用研磨器将所述植物组织研磨成粉末状；s2，向所述研磨管中加入1ml所述漂洗液，混匀后，4℃下2500g离心10min，弃上清液；重复漂洗3次；s3，向所述研磨管中加入800μl 65℃预热的5％ctab裂解液、20μl 20mg/ml蛋白酶k和20μl巯基乙醇，混匀，使所述植物组织悬浮，65℃水浴60min；取出后，室温静置1min，在4℃下12000rpm离心8min，取600μl上清液至新的2.0ml无菌离心管中；s4，向所述s3中得到的上清中加入300μl 3m醋酸钾溶液ph＝4.8，混匀，
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20℃放置15min，4℃下12000rpm离心8min，取上清至新的2ml无菌离心管中；s5，向所述s4中得到的上清中加入800μl苯酚/氯仿/异戊醇上下颠倒混匀，4℃下12000rpm离心8min，取上清至新的2ml无菌离心管中；然后加入800μl氯仿/异戊醇上下颠倒混匀，4℃下12000rpm离心8min，取上清至新的2ml无菌离心管中；s6，向所述s5中得到的上清中加入上清液0.8倍体积的异丙醇，混匀，
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20℃放置30min进行dna沉淀，4℃下12000rpm离心8min，弃上清，瞬时离心，吸弃残留液体；s7，利用75％乙醇清洗所述dna沉淀两次，4℃下12000rpm离心2min，弃上清；瞬时离心，吸弃残留液体，室温干燥至dna沉淀呈半透明状；s8，所述dna沉淀干燥后加入洗脱缓冲液溶解所述dna沉淀，加入10mg/ml rnase a酶放置在37℃金属浴上消化rna；s9，根据dna沉淀量加入适量洗脱缓冲液溶，然后加入1μl 10mg/ml rnase a酶消化rna，37℃孵育15min。

技术总结
本发明公开了一种富含次生代谢物的植物组织中DNA的提取方法。该提取方法包括干扰物处理、组织细胞裂解、盐析、DNA沉淀和清洗步骤，其中，干扰物处理步骤包括：将植物组织同交联聚乙烯吡咯烷酮一起研磨；以及加入漂洗液对研磨后的植物组织进行干扰物漂洗处理；其中，漂洗液包括：100～500mM Tris


技术研发人员：周勋 和金鹏 苏亚南 陶琳娜 金戈
受保护的技术使用者：天津诺禾致源生物信息科技有限公司
技术研发日：2021.08.16
技术公布日：2021/10/15