一种高活性重组蛋白的制备方法与流程

1.本发明涉及重组蛋白纯化技术领域，特别涉及一种高活性重组蛋白的制备方法。


背景技术：

2.湿性老年性黄斑变性(amd)和糖尿病视网膜病变(dr)缺乏理想的治疗措施。临床上主要采用对症治疗或辅助性治疗方法来控制或延缓疾病的发展，常用的治疗方法如下：降糖药物、抗炎药物、局部使用tnf
‑
α拮抗剂、菲诺贝特、血管内皮生长因子(vegf)拮抗剂、ras系统抑制剂、非酶糖基化抑制剂、综合疗法和激光治疗。抗
‑
vegf治疗近期效果较好，但涉及到定期眼内注射抗
‑
vegf单抗(如lucentis)，不仅具有一定的伤害性，而且价格昂贵且只针对确诊病例，此外，尽管发生率很低，但每次注射均会带来眼内感染、视网膜出血和剥离的严重风险，而且这种治疗方法反复用药后会产生耐药性。
3.2013年全球糖尿病视网膜病变(dr)患者9300万，其中增殖性dr(pdr)患者1700万，糖尿病性黄斑水肿患者2100万，威胁视力的dr患者2800万。糖尿病发病5年后糖尿病视网膜病变发生率为25％，10年后增至60％，15年后可高达75％
‑
80％。如此可见，加快研制新型治疗眼底血管病变制剂，不仅具有社会效益，而且将会产生巨大的经济效益。
4.2006年重组人il
‑
18(商品名：iboktadekin)作为抗肿瘤制剂进入临床试验阶段，由glaxosmithkline公司研发。已有多篇文章报道了il
‑
18人体试验是安全的，而且未见有关眼部副作用的报道。此外，已经报道给啮齿类全身注射il
‑
18，在视网膜可检出较高含量的il
‑
18，这一结果提示il
‑
18在视网膜中的生物可用性。病人使用il
‑
18可能引起1
‑
2级的短暂发热，但能快速缓解。用高达2000μg/kg剂量，病人的眼部也没出现明显副作用。综上所述重组il
‑
18在眼科学中的研究结果表明il
‑
18对眼部病理性新生血管性疾病可能具有应用价值。既然目前已证明il
‑
18临床试验试是安全的，那么il
‑
18就可用于cnv和湿性amd的辅助治疗研究，它能否成为有效的药物，值得进一步深入研究。
5.新近研究发现眼内注射il
‑
18可以有效治疗人工诱导小鼠视网膜新生血管病变(cnv)发生和发展；而且il
‑
18基因敲除小鼠会出现严重的视网膜新生血管病变；此外研究证明鼠源性和人源性的重组il
‑
18对视网膜色素上皮细胞(rpe)都是非常安全的。有报道房水中il
‑
18含量高的患者在接受lucentis单抗治疗黄斑水肿及视网膜静脉栓塞时将显著改善视觉效果，同时证明vegf以相互抑制的方式调控il
‑
18含量，并用多个视网膜/cnv模型证明重组il
‑
18能够调节病理模型的眼底渗出，因此il
‑
18可能成为调控视网膜病理性新生血管生成的新方法。1995年il
‑
18作为ifnγ诱导因子被报道，随后证明给小鼠全身注射il
‑
18(50μg/kg)6天，对fgf诱导的角膜毛细血管生成具有抑制作用。也有报道表明il
‑
18对氧诱导的小鼠视网膜病变模型的视网膜病理性新生血管的生成具有调控作用。因此il
‑
18在理论有可能成为治疗视网膜新生血管病变的候选药物。
6.近年来重组蛋白类药物方兴未艾，为人类健康做出了相当的贡献。重组蛋白表达系统分为真核表达系统，如cho细胞，和原核表达系统，如大肠杆菌。真核表达系统的优点是蛋白表达过程类似人体内蛋白翻译过程，所表达的蛋白分子可同时完成表达后修饰和空间
构型，形成有活性的蛋白质；其缺点是表达量较低，条件要求高，消耗成本高。原核表达系统的优点是蛋白表达量高，设备要求低，消耗成本低，其缺点是所表达的蛋白不能完成翻译后修饰和空间构象，加上菌体成分特别是内毒素的残留，都为后续蛋白纯化带来一定的困难。根据目的蛋白分子的性质，可以选择不同的表达系统。因有些蛋白分子不能在真核细胞中分泌表达，只能采用原核表达系统，如il
‑
18、il
‑
2、vegfb等。所以这些重组蛋白的后续纯化都涉及到蛋白复性、内毒素去除等棘手问题。
7.在il
‑
18大量制备过程中存在很多技术难题。1996年(j immunol.156,4274
‑
4279)报道了“在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达人il
‑
18及变异体”，il
‑
18以包涵体的形式表达，其纯化方法一次采用疏水层析(pheny
‑
sepharose)，阴离子交换层析(deae
‑
sepharose)，凝胶层析(superdex75)，反向疏水层析(c4)等方法，经纯化后的il
‑
18sds
‑
page检测纯度达到90％。2006年(中国免疫学杂志,22,141
‑
144)报道“重组人il
‑
18在大肠杆菌中的表达及抗肿瘤作用”，人il
‑
18以il
‑
18以包涵体的形式表达，表达产物经冰浴后离心，包涵体沉淀经充分洗涤后用8mol/l尿素溶解，经复性，透析和g50凝胶层析，纯化后的il
‑
18sds
‑
page检测纯度达到90％左右。2010年中国专利(10169340a)公开了“人白细胞介素18的制备方法；采用重组毕赤酵母发酵培养上清液分级超滤浓缩，50％以上饱和度的(nh4)2so4沉淀后一次采用疏水层析(pheny
‑
sepharose)，阴离子交换层析(q
‑
sepharose hp)纯化，经纯化后的il
‑
18sds
‑
page检测纯度达到97％。上述方法在制备il
‑
18时，在一定程度上存在工艺复杂、纯度低、复性率低和产量低等一些问题。
8.用大肠杆菌表达系统制备重组蛋白，因其成本低、产量高而受到关注，如重组人il
‑
2、重组人干扰素等，但从大肠杆菌中纯化重组蛋白的技术难点之一就是内毒素的残留，高效液相(hplc)反向层析技术是去除内毒素的有效方法，但通过hplc纯化的重组蛋白受到流动相中有机剂的影响而变性，丧失生物活性，严重影响了纯化重组蛋白的应用，这个问题一直没有得到解决。
9.申请人前期建立了il
‑
18大肠杆菌高效表达菌株，并建立了rhil
‑
18复性、纯化及内毒素去除的技术路线(专利号：zl 201510455749.x、zl201611146887.0；专利申请号：202010771259.1)，但经hplc去除内毒素后rhil
‑
18样品处于一种酸化和变性状态，丧失了生物活性，而且乙腈的残留也影响rhil
‑
18样品的应用。


技术实现要素：

10.有鉴于此，本发明提供了一种高活性重组蛋白的制备方法。该方法可制备纯度高、活性好的重组蛋白，操作简单，无内毒素和有机溶剂残留。
11.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
12.本发明提供了一种高活性重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
13.将重组蛋白的hplc纯化样品与蛋白溶解液混合，进行溶解处理；
14.将溶解处理后的样品与复性液混合，进行复性处理；
15.采用阴离子交换层析柱对复性处理后样品进行纯化，得到高活性重组蛋白；
16.蛋白溶解液包括如下组分：
17.溶解剂
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
4～10m
18.dtt
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5～20mm
19.pb缓冲液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
补足至1l；
20.复性液包括如下组分：
21.pb缓冲液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1l
22.还原剂
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5～40mm。
23.本发明在前期工作基础上对经hplc去除内毒素后样品进行再溶解、复性、阴离子柱纯化等步骤，使乙腈处理后失去活性il
‑
18重新复性，获得具高生物活性的rhil
‑
18，同时进一步去除样品中残留的乙腈等杂质，所获样品能完全满足临床上治疗视网膜新生血管病变眼内用药的质量要求。
24.在本发明提供的具体实施例中，重组蛋白为重组人白细胞介素18，但不限于重组人白细胞介素18。
25.在本发明中，hplc纯化样品为大肠杆菌表达的重组蛋白经hplc反相层析纯化去除内毒素的样品。
26.作为优选，hplc反相层析可采用c4、c8、c18反向层析柱。
27.作为优选，溶解剂为尿素和/或盐酸胍；
28.作为优选，溶解剂为尿素，溶解剂在蛋白溶解液中的浓度为6～10m；
29.作为优选，溶解剂为盐酸胍，溶解剂在蛋白溶解液中的浓度为4～8m。
30.作为优选，还原剂为dtt和或2
‑
巯基乙醇。
31.作为优选，蛋白溶解液包括如下组分：
32.溶解剂
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
6～8m
33.dtt
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10mm
34.pb缓冲液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
补足至1l；
35.复性液包括如下组分：
36.pb缓冲液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1l
37.还原剂
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20mm。
38.在本发明提供的具体实施例中，溶解剂为尿素，溶解剂在蛋白溶解液中的浓度为8m；
39.在本发明提供的具体实施例中，溶解剂为盐酸胍，溶解剂在蛋白溶解液中的浓度为6m。
40.作为优选，pb缓冲液为10～30mm、ph 7.0～8.0的pb缓冲液。
41.作为优选，蛋白溶解液中，pb缓冲液为15～25mm、ph 7.0～7.5的pb缓冲液；
42.作为优选，复性液中，pb缓冲液为15～25mm、ph 7.6～8.0的pb缓冲液。
43.在本发明提供的具体实施例中，蛋白溶解液中，pb缓冲液为20mm、ph7.2的pb缓冲液；
44.在本发明提供的具体实施例中，复性液中，pb缓冲液为20mm、ph 8.0的pb缓冲液。
45.作为优选，hplc纯化样品与蛋白溶解液的体积比为1：(5～15)；溶解处理的条件为：15～30℃溶解处理1.5～2.5h。
46.在本发明提供的具体实施例中，hplc纯化样品与蛋白溶解液的体积比为1：9；溶解处理的条件为：室温溶解处理2h。
47.作为优选，hplc纯化样品与复性液的体积比为1：(5～10)；复性处理的条件为：15
～30℃搅拌3～5h，然后0～6℃复性处理20h以上。
48.在本发明提供的具体实施例中，hplc纯化样品与复性液的体积比为1：8；复性处理的条件为：室温搅拌4h，然后4℃复性处理20h以上。
49.作为优选，阴离子交换层析柱为capto q层析柱。
50.作为优选，阴离子交换层析柱纯化所用洗脱液包括如下组分：
51.pb缓冲液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1l
52.nacl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.1～0.3m。
53.在本发明提供的具体实施例中，洗脱液包括如下组分：
54.pb缓冲液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1l
55.nacl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.2m。
56.作为优选，洗脱液中，pb缓冲液为15～25mm、ph 7.0～7.5的pb缓冲液。
57.在本发明提供的具体实施例中，洗脱液中，pb缓冲液为20mm、ph 7.2的pb缓冲液。
58.作为优选，采用阴离子交换层析柱对复性处理后样品进行纯化时，样品的流速为3～7ml/min。
59.在本发明提供的具体实施例中，采用阴离子交换层析柱对复性处理后样品进行纯化时，样品的流速为5ml/min。
60.本发明提供了一种高活性重组蛋白的制备方法。该制备方法包括如下步骤：将重组蛋白的hplc纯化样品与蛋白溶解液混合，进行溶解处理；将溶解处理后的样品与复性液混合，进行复性处理；采用阴离子交换层析柱对复性处理后样品进行纯化，得到高活性重组蛋白。本发明的有益效果如下：
61.本发明通过对蛋白溶解液和复性液的配方进行了改进，进一步解决了通过hplc纯化的重组蛋白丧失生物活性的问题，制备出高活性、高纯度的rhil
‑
18样品及其它重组蛋白样品，同时操作简单，无内毒素和有机溶剂残留，适合视网膜新生血管治疗使用。
附图说明
62.图1考马斯亮蓝法蛋白测定曲线；
63.图2capto q纯化后结果；其中，m：分子量标准，从大到小依次为97.2、66.7、44.3、29.8kd；1：纯化前样品；2，纯化样品；
64.图3rhil
‑
18诱导kg1细胞产生γ
‑
inf标准曲线；
65.图4a为未加rhil
‑
18时人内皮细胞微管形成，b为本发明rhil
‑
18对人内皮细胞微管形成的抑制。
具体实施方式
66.本发明公开了一种高活性重组蛋白的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
67.本发明以重组人白细胞介素18(human recombinant interleukin
‑
18,rhil
‑
18)
为例，建立一种从大肠杆菌中纯化重组蛋白的方法，提供一种在hplc去除重组蛋白中内毒素的基础上，制备高活性重组蛋白的制备方法，此方法操作方法简单，可制备纯度高、活性好的重组蛋白。本发明制备了高活性rhil
‑
18，但不限于rhil
‑
18的制备方法。其特点是在前期完成hplc纯化重组蛋白rhil
‑
18的基础上，对hplc制备的rhil
‑
18样品进行再复性、纯化，在获得具高生物活性的rhil
‑
18同时，进一步去除样品中残留的乙腈等杂质，所制备的rhil
‑
18样品活性好、纯度高，能完全满足临床上治疗视网膜新生血管病变眼内用药的质量要求。
68.本发明的技术方案是：通过对hplc纯化rhil
‑
18样品重新溶解、复性、capto q离子柱纯化，解决了hplc纯化rhil
‑
18样品无活性及乙腈残留等问题，获取高活性、高纯度的rhil
‑
18样品。
69.技术方案的具体步骤是：
70.(1)获取hplc纯化rhil
‑
18样品：参照专利申请号202010771259.1方法进行；
71.(2)rhil
‑
18样品溶解：按1:9的比例将rhil
‑
18样品加到蛋白溶解液中，室温溶解2小时以上；
72.(3)rhil
‑
18样品复性：按1:8比例向上述rhil
‑
18样品溶解液中缓慢加入复性液，4℃复性12小时以上；
73.(4)rhil
‑
18蛋白的纯化：将rhil
‑
18样品复性液以5ml/min的速度通过capto q离子柱，充分淋洗后，用0.2mol/l nacl洗脱，收集目的蛋白峰；将该纯化蛋白分装成水针制剂或冻干制剂。
74.(5)纯化rhil
‑
18蛋白分析：考马斯亮蓝法含量测定，sds
‑
page法纯度测定、鲎试剂法内毒素测定。
75.本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。
76.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
77.实施例1 rhil
‑
18纯化
78.本实施例rhil
‑
18纯化具体为：
79.1、蛋白溶解与蛋白复性：
80.hplc纯化样品按1:9比例加入蛋白溶解液，室温溶解2小时；按照1:8的比例缓慢加入复性液，使蛋白浓度降到0.2mg/ml，室温磁力搅拌溶解4h；4℃复性20h以上；立即纯化。
81.2、rhil
‑
18的纯化：
82.用平衡液平衡capto q层析柱，将上述复性液上样，流速为5ml/min；用平衡液充分流洗杂蛋白到基线后，用含0.2m nacl的平衡液洗脱，收集洗脱峰，
‑
20℃保存待鉴定。
83.上述各液体配方范围及准备如下：
84.20mmol pb缓冲液(ph7.2)以1000ml为单位按下列比例配制：
85.磷酸二氢钠.2h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3.12g
86.磷酸氢二钠.12h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
7.16g
87.edta
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.37g
88.蛋白溶解液以1000ml为单位按下列比例配制：
89.8mol尿素
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
480g
90.10mmol dtt
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1.65g
91.20mmol pb缓冲液(ph7.2) 定容到1000ml
92.复性液以1000ml为单位按下列比例配制：
93.20mmol pb缓冲液(ph8.0) 1000ml
94.dtt(20mmol)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3.1g
95.洗脱液按下列比例配制：
96.20mmol pb缓冲液(ph7.2) 1000ml
97.0.2mol nacl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
11.6g
98.试验例1纯化效果验证
99.1、rhil
‑
18样品回收率：
100.具体是:考马斯亮蓝法测定，考马斯亮蓝法测蛋白
‑
酶标仪
101.①
标准曲线配制，分别取7只ep管，按表1体积加入牛血清白蛋白母液及水，混合均匀备用。
②
在96孔板中分别加入5μl标准曲线蛋白溶液，再加入250μl考马斯亮蓝g250染色液，测定od595，绘制标准曲线。
③
将样品稀释至适当浓度，每孔加5μl，加入250μl考马斯亮蓝g250染色液，测定od595，带入标准曲线算出样品浓度。牛血清白蛋白母液：1mg/ml。结果见表2，标准曲线见图1。
102.表1 标准曲线蛋白溶液配制方案
103.序号母液体积(ml)水(ml)浓度(mg/ml)100.1020.010.090.130.020.080.240.040.060.450.060.040.660.080.020.870.101.0
104.表2 rhil
‑
18纯化回收率
[0105] 纯化前纯化后浓度9.9mg/ml1.37mg/ml体积7ml30ml蛋白量69.3mg41.4mg回收率/60％
[0106]
2、rhil
‑
18样品纯度测定：
[0107]
采用sds蛋白电泳法，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％，恒定电流25ma电泳90分钟，结果显示纯度在99％以上，见图2。
[0108]
3、rhil
‑
18样品内毒素测定：
[0109]
具体是：鲎试剂法，按照《中华人民共和国药典》2010年版三部附录，xii e“细菌内毒素检查法(凝胶限度试验)”进行，结果见表3。
[0110]
表3 rhil
‑
18纯化样品内毒素测定
[0111][0112][0113]
结果表明，经过本发明纯化方法纯化后的rhil
‑
18内毒素符合相关标准。
[0114]
4、rhil
‑
18生物活性测定：
[0115]
(1)、人白血病细胞kg1细胞传代培养：用含10％fcs的rpmi 1640培养基，5％co2，37℃培养kg1细胞；当细胞密度达到2
×
106个细胞/ml时传代；传代细胞密度为4
×
105细胞/ml。
[0116]
(2)、将rhil
‑
18用不含血清的rpmi1640培养基配制成50nmol备用；取96孔细胞培养板，于前5列每孔加100ul 20％fcs 1640培养基配制的细胞密度为2
×
106细胞/ml，a、b、c、d排加cona，终浓度为0.5mg/l。于第1
‑
5列每孔内分别加入100ul 10倍稀释的rhil
‑
18，混匀，第一列终浓度为25nmol；(每个稀释度4孔)。混均后，将细胞培养板置37℃，5％co2孵箱培养24h。
[0117]
(3)、用elisa法测ifn
‑
γ效价收集培养上清，标准曲线如图3，结果如表4。
[0118]
表4 ifn
‑
γ表达量
[0119]
rhil
‑
18终浓度(nmol)ifn
‑
γ表达量(pg/ml)257821.0912.55422.166.251729.613.125903.779
[0120]
结果表明，rhil
‑
18可刺激kg1产生ifn
‑
γ，具有生物活性。
[0121]
5、rhil
‑
18对人内皮细胞微管形成的抑制试验：
[0122]
预先用不同浓度(0.1ng/ml，1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml)的il
‑
18处理ea.hy926细胞48h。将matrigel人工基质胶与4℃预冷的无血清1640培养基按1：1比例混合，平铺于24孔板的孔底，每孔300μl，放于5％co2、37℃恒温培养箱内30min使胶固化。取il
‑
18处理过的ea.hy926细胞，用无血清1640培养基调整浓度至1.2
×
105/ml后接种于上述铺好胶的24孔板，每孔1ml，常规培养16h，每隔4h观察微管样结构形成情况，光学显微镜下(100
×
)随机取5个视野拍照。采用microvision saisam软件分析图像，对每孔5个视野的微管样结构进行计数。
[0123]
表5 微管样结构数量
[0124]
rhil
‑
18浓度(ng/ml)微管样结构数量(个)0830.1781591017
1005
[0125]
结果表明，本发明提供的rhil
‑
18对抑制微管样结构产生具有作用。
[0126]
对比例1
[0127]
获取hplc纯化rhil
‑
18样品参照专利申请号202010771259.1方法进行，具体如该专利实施例1：
[0128]
1、制备液相法纯化重组il
‑
18
[0129]
利用制备液相对重组il
‑
18进行纯化去除内毒素，样品为专利号：201510455749.x所制备的重组il
‑
18的凝胶层析柱收集的液体样品。
[0130]
选用色谱柱介质为c18，规格为21.2mm
×
250mm，粒径7μm。
[0131]
流动相a：无热源水和0.1％三氟乙酸的混合溶液，例如：1l无热源水加入1ml三氟乙酸。
[0132]
流动相b：乙腈和0.1％三氟乙酸的混合溶液，例如1l乙腈中加入1ml三氟乙酸。
[0133]
以流动相a和流动相b为洗脱液，流速为10ml/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温25℃，检测波长280nm。
[0134]
梯度洗脱程序：
[0135]
时间(min)流速(ml/min)a％b％010100055103070
[0136]
收集保留时间为15.308min样品峰。
[0137]
2、液相收集后除乙腈及复性
[0138]
1)旋转蒸发法除乙腈：采用旋转蒸发仪，温度为32℃，压力为
‑
100kpa，转速为35
‑
45rpm，时间20
‑
30分钟。蒸发后体积约为液相收集的一半。
[0139]
2)复性：采用复性液缓慢加入蒸发后样品液体中，直至样品溶液的ph7.0～7.2。复性液为20mmol pb缓冲液(ph8.0)，20mmol dtt。
[0140]
3)透析：采用100倍体积的20mmol pb缓冲液(ph7.0
‑
7.2)对样品进行透析，每透析12小时更换一次液体，共透析24小时，以去除残留乙腈。
[0141]
3、rhil
‑
18生物活性测定结果：
[0142]
表6 ifn
‑
γ表达量
[0143]
rhil
‑
18终浓度(nmol)ifn
‑
γ表达量(pg/ml)25565.6912.5324.646.25127.173.12535.56
[0144]
4、rhil
‑
18对人内皮细胞微管形成的抑制试验结果：
[0145]
表7 微管样结构数量
[0146]
rhil
‑
18浓度(ng/ml)微管样结构数量(个)0850.182
174106610053
[0147]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。