脑脊液病原微生物宏基因组核酸扩增方法与流程

1.本发明涉及一种脑脊液病原微生物宏基因组核酸扩增方法，属于生物检测领域。


背景技术：

2.全面检测、无偏好性的宏基因组二代测序(mngs)在传染病诊断方面具有强大的优势，因为不需要特殊探针和靶向引物，从而有助于快速检测病原体。随着成本和时间的持续减少，mngs越来越多地用于临床诊断。高通量测序和基因分析对dna的数量和质量都有很严格的要求。从技术上说，需要富集足够的dna用于测序文库构建。然而，对于一些临床样本(比如血液、脑脊液)，经常遇到样本少或dna含量极其有限的情况，以致无法检测成功或没有足够的样本dna来满足再次检测的需要。因此，在病毒性感染性疾病尤其是罕见或新发感染性疾病的实验室诊断过程中，需要建立一种对有限临床标本的病原体核酸较低的扩增偏向性和较高富集的方法，以满足多病原体筛查所必需的样本量需求。
3.与传统的基于pcr的全基因组扩增(wga)技术相比，多重链置换扩增技术(mda)是目前使用较为广泛的全基因组扩增技术。mda使用具有保真性高、持续合成能力强的phi29 dna聚合酶和6n随机引物，可用于低起始量基因组dna的扩增，具有较高的扩增效率和均一性等优点。与以pcr为基础的方法相比，mda降低扩增偏向性三到四个数量级，并可产生长度平均达12kb的扩增子。同时，mda是一种恒温扩增技术，可以在常温下进行，具有操作简单、方便的特点。此外，链置换扩增产生了高分子量(≥10kb)的超支化产物，这是构建基因组二代测序文库的理想选择。由于这些原因，mda与ngs相结合，已成为基因组研究的黄金标准方法。根据目前的研究结果，mda扩增反应效果仍受多种因素影响，包括：缓冲液中mg
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浓度、反应温度和反应时间等。
4.因此急需提供一种应用于脑脊液样本，高扩增效率和扩增均一性，稳定性好、成本低的病原微生物宏基因组核酸扩增方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种脑脊液病原微生物宏基因组核酸扩增方法，能有效的提升脑脊液标本宏基因组病原检出率。
6.本发明采取的技术方案为：一种脑脊液病原微生物宏基因组核酸扩增方法，其特征在于其步骤包括：
7.(1)采用通用方法去除样本中的宿主核酸后，提取样本中的病原体核酸；
8.(2)采用phi29 dna聚合酶对提取得到的核酸进行全基因多重置换扩增。
9.优选的，步骤(2)中扩增体系包括提取的核酸模板、nuclease
‑
free water、phi29 dna聚合酶、反应缓冲液。
10.优选的，步骤(2)中反应缓冲液包括：6n随机引物、1
×
buffer、dntp mix。
11.优选的，步骤(2)中1
×
buffer包括tris
‑
hci、mgci2、kci、dtt。
12.优选的，步骤(2)中6n随机引物最终浓度为50μm、dntps最终浓度为1mm、tris
‑
hci
最终浓度为35mm、mgci2最终浓度为15mm、kci最终浓度为50mm、dtt最终浓度为3mm。
13.优选的，步骤(2)具体为：在pcr管中，以50μl的体系进行核酸扩增，该系统包括8μl的nuclease
‑
free water、30μl的反应缓冲液、2μl的浓度为10u/μl的phi29 dna聚合酶和10μl的模板，振荡混匀，放入pcr仪42℃条件下孵育2h；65℃孵育5min，使phi29 dna聚合酶失活。
14.本发明采用phi29 dna聚合酶进行多重置换扩增，并优化影响mda扩增反应效果的诸多因素，使其具有更高的扩增效率和扩增均一性。本申请提供的扩增体系，改进了反应缓冲液中1
×
buffer的各项试剂浓度，使得phi29 dna聚合酶在42℃条件下获得更高的酶活性。因此，本发明的扩增方法是一种具有成本效益的技术，能够实现低起始量微生物基因组的富集，可解决现有的核酸建库时起始量低、成本高的问题。
具体实施方式
15.为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
16.实施例
17.(1)核酸提取
18.取脑脊液临床样本，做三个平行实验。采用通用方法去除样本中的宿主核酸后，采用通用型dna提取试剂盒qiaamp dna mini kit进行dna抽提和纯化，并进行核酸质量检测。
19.(2)核酸扩增
20.1)在pcr管中，以50μl的体系进行核酸扩增，该系统包括8μl的nf水、30μl的反应缓冲液、2μl的phi29 dna聚合酶(10u/μl)和10μl的模板。
21.2)振荡混匀，在pcr仪42℃条件下孵育2h。
22.3)65℃孵育5min，使phi29 dna聚合酶失活。
23.对提取到的核酸进行质量检测：
24.采用qubit dsdna hs kit测定提取的dna浓度及纯度。结果如表1和表2所示。
25.对比例
26.采用与实施例1相同的脑脊液样本，同样做三个平行实验，对应的原始样品不做核酸扩增这一步，采用实施例1的方法提取样本核酸后直接进行核酸质量检测。
27.核酸质量检测结果如表1
‑
2所示：
28.表1 dna提取量(ng)对比
[0029] 对比例实施例平行实验11.6403平行实验22.1479平行实验31.9432
[0030]
表2测序数量质量评估
[0031][0032]
从表1的检测结果可以看出，对比例样本去宿主后，抽提浓度大幅度降低，无法满足后续的建库以及上机测序。实施例样本去宿主后，使用mda技术扩增，扩增产物浓度在403
‑
432ng。其扩增效率稳定，能够满足后续分析的样本量要求，并用扩增产物构建高质量的测序文库，用于高通量测序，得到高质量的测序数据(表2)。本实施例证明了mda用于宏基因组二代测序扩增dna的可靠性和有效性。
[0033]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。


技术特征：
1.一种脑脊液病原微生物宏基因组核酸扩增方法，其特征在于其步骤包括：(1)去除样本中的宿主核酸后，提取样本中的病原体核酸；(2)采用phi29 dna聚合酶对提取得到的核酸进行全基因多重置换扩增。2.根据权利要求1所述的脑脊液病原微生物宏基因组核酸扩增方法，其特征在于：步骤(2)中扩增体系包括提取的核酸模板、nuclease
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free water、phi29 dna聚合酶、反应缓冲液。3.根据权利要求2所述的脑脊液病原微生物宏基因组核酸扩增方法，其特征在于：步骤(2)中反应缓冲液包括：6n随机引物、1
×
buffer、dntp mix。4.根据权利要求3所述的脑脊液病原微生物宏基因组核酸扩增方法，其特征在于：步骤(2)中1
×
buffer包括tris
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hci、mgci2、kci、dtt。5.根据权利要求4所述的脑脊液病原微生物宏基因组核酸扩增方法，其特征在于：步骤(2)中6n随机引物最终浓度为50μm、dntps最终浓度为1mm、tris
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hci最终浓度为35mm、mgci2最终浓度为15mm、kci最终浓度为50mm、dtt最终浓度为3mm。6.根据根据权利要求4所述的脑脊液病原微生物宏基因组核酸扩增方法，其特征在于：步骤(2)具体为：在pcr管中，以50μl的体系进行核酸扩增，该系统包括8μl的nuclease
‑
free water、30μl的反应缓冲液、2μl的浓度为10u/μl的phi29 dna聚合酶和10μl的模板，振荡混匀，放入pcr仪42℃条件下孵育2h；65℃孵育5min，使phi29 dna聚合酶失活。

技术总结
本发明公开了一种脑脊液病原微生物宏基因组核酸扩增方法，其特征在于其步骤包括：(1)去除样本中的宿主核酸后，提取样本中的病原体核酸；(2)采用Phi29DNA聚合酶对提取得到的核酸进行全基因多重置换扩增。本发明采用Phi29DNA聚合酶进行多重置换扩增，并优化影响MDA扩增反应效果的诸多因素，使其具有更高的扩增效率和扩增均一性。因此，本发明的扩增方法是一种具有成本效益的技术，能够实现低起始量微生物基因组的富集，可解决现有的核酸建库时起始量低、成本高的问题。成本高的问题。


技术研发人员：易康 王宗秀 樊晓梅
受保护的技术使用者：南京诺因生物科技有限公司
技术研发日：2021.08.11
技术公布日：2021/10/15