生产氨基酸的谷氨酸棒杆菌以及利用该谷氨酸棒杆菌生产氨基酸的方法与流程

1.本发明涉及生物技术和基因工程领域。具体地说，本发明涉及生产氨基酸的谷氨酸棒杆菌以及利用该谷氨酸棒杆菌生产氨基酸的方法，更具体涉及l
‑
赖氨酸高产谷氨酸棒杆菌菌株、所述高产菌株的构建方法和应用。


背景技术：

2.l
‑
赖氨酸，简称赖氨酸，是人类和动物营养中最重要的必需氨基酸，被广泛应用于医药、食品、动物饲料和化妆品等行业中。目前，赖氨酸的主要生产为微生物发酵法，谷氨酸棒杆菌是目前工业中最重要的生产菌株。
3.随着生物技术的不断发展，近年来，对谷氨酸棒杆菌进行遗传改造以提高其赖氨酸产量的方法也不断出现，包括赖氨酸合成途径的改造，加强四碳回补途径，加强赖氨酸外排等等，如cn1206342c报道通过增强dapa基因、lysc基因、dapb基因、pyc基因和lyse基因的表达，从而使菌株中的赖氨酸产量增加。当前赖氨酸工业生产菌株的产酸能力已达到较高的水平，但菌株的产量尚未达到理论最大转化率。
4.如何进一步提高菌株的产酸水平，提高转化率，降低赖氨酸的生产成本，是本领域人员需要解决的问题。


技术实现要素：

5.针对上述问题，发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现一种编码假定蛋白的基因cgl2639基因，使得该基因失活能够显著提高赖氨酸的产量，从而获得赖氨酸的高产菌株。在此基础上完成了本发明。所述基因编码具有seq id no:1所示多肽所示的序列。其来源于谷氨酸棒杆菌，注释为假定蛋白，其核苷酸序列如seq id no:2所示。通过blast分析发现，该蛋白多肽在不同谷氨酸棒杆菌中保守性极高，氨基酸序列的一致性达到90%以上。因此，虽然谷氨酸棒杆菌中该蛋白多肽的功能未知，但可以预测其在不同谷氨酸棒杆菌中具有相同的功能。在本发明人通过全基因组敲除库的构建发现seq id no:1所示多肽的失活可以提高谷氨酸棒杆菌l
‑
赖氨酸产量后，本领域技术可以从中得到启示，即失活其他谷氨酸棒杆菌内源性的与seq id no:1所示多肽同源性90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%以上的多肽，也可以提高l
‑
赖氨酸产量，因此，采用同样手段失活与seq id no:1所示多肽同源性90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%以上的多肽生产赖氨酸的方法，也应该包括在本发明的保护范围内。
6.由此，本发明提供一种生产l
‑
赖氨酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述菌株能产赖氨酸，且具有如下（i）
‑
（ii）至少一项所示的特性：（i）内源的如seq id no: 1所示的多肽或其同源多肽的活性降低或消失；（ii）内源的如seq id no: 2所示的多核苷酸或者同源多核苷酸的表达水平降低或消失。
7.其中，只要谷氨酸棒杆菌出发菌具有产l
‑
赖氨酸的能力，通过遗传改造而具备上述特性，则能提高菌株产l
‑
赖氨酸的能力。如果出发菌本身不能产生l
‑
赖氨酸，则可以改造获得产l
‑
赖氨酸的能力，进而结合上述遗传改造，同样也能提高菌株产l
‑
赖氨酸的能力。
8.在具体的实施方式中，所述多肽活性降低或消失是指，与野生型内源性多肽相比，所述多肽的编码基因的转录、表达降低至少30%，或所述多肽的编码基因被消除；或者所述多肽的活性降低至少30%。
9.在具体实施方式中，所述内源性多肽的失活可以通过以下方法之一或组合实现：部分敲除或完全敲除编码基因；对其编码的基因进行突变；改变编码基因的启动子、翻译调控区或编码区密码子令其转录或翻译弱化；改变编码基因序列使其mrna稳定性减弱或编码的蛋白的结构不稳定；或通过修饰细胞中基因编码区使其转录或表达弱化或其编码蛋白活性降低或丧失；或者通过修饰细胞中所述基因编码区的上下游区域使其转录或表达弱化或丧失，或者通过物理或化学方法诱变后筛选得到。
10.更优选地，所述菌株进一步还包括选自以下的一个或几个基因过表达或表达产物活性增强：a1. 编码解除赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶lysc基因；b1. 编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成酶的dapa基因；c1. 编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapb基因；d1. 编码二氨基庚二酸脱水酶的ddh基因；e1. 编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的dapd和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的dape；f1. 编码天冬氨酸
‑
半醛脱水酶的asd基因；g1. 编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；h1. 编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的pntab基因；i1. 编码赖氨酸的运输蛋白lyse基因。
11.还优选地，进一步还包括选自以下的一个或几个基因表达降低或表达产物活化降低：a2. 编码乙醇脱水酶的adhe基因；b2. 编码乙酸激酶的acka基因；c2. 编码磷酸乙酰转移酶的pta基因；d2. 编码乳酸脱水酶的ldha基因；e2. 编码甲酸转运蛋白的foca基因；f2. 编码丙酮酸甲酸裂解酶的pflb基因；g2. 编码丙酮酸氧化酶的poxb基因；h2. 编码天冬氨酸激酶i/高丝氨酸脱水酶i双功能酶的thra基因；i2. 编码高丝氨酸激酶的thrb基因；j2. 编码赖氨酸脱羧酶的ldcc基因；k2. 编码赖氨酸脱羧酶的cada基因。
12.在进一步优选的实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌的出发菌株是谷氨酸棒杆菌atcc13032、谷氨酸棒杆菌atcc 13869、谷氨酸棒杆菌b253、谷氨酸棒杆菌atcc 14067及其衍生
菌株。
13.在一个具体的实施方式中，本发明通过对谷氨酸棒杆菌ahp（该菌株是在谷氨酸棒杆菌atcc 13032的基础上，将天冬氨酸激酶lysc的311位苏氨酸被异亮氨酸取代，同时，将丙酮酸激酶pyc的458位脯氨酸由丝氨酸取代）中的cgl2639基因进行敲除，获得了工程菌株ahp（δcgl2639），该菌株的赖氨酸产量较出发菌株有所提高。
14.在进一步的实施方式中，cgl2639基因的敲除是通过将同源臂扩增后连接到pk18mobsacb上，获得pk18
‑
δcgl2639质粒，将该质粒转化谷氨酸棒杆菌ahp，经过二次重组后，获得工程菌株ahp（δcgl2639）。
15.其次，本发明提供了一种生产l
‑
赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，所述菌株经修饰以使所述菌株中具有如下（i）
‑
（ii）至少一项所示的特性：（i）降低或消除如seq id no：1所示内源性多肽或其同源多肽的多肽活性；（ii）降低或消除如seq id no：2所示的多核苷酸或其同源多核苷酸的表达水平。
16.其中，所述多肽降低或消失是指，与野生型内源性多肽相比，所述多肽的编码基因的转录、表达降低至少30%，或所述多肽的编码基因被消除；或者所述多肽的活性降低至少30%。
17.在一个具体的实施方式中，cgl2639基因的敲除是通过将同源臂扩增后连接到pk18mobsacb上，获得pk18
‑
δcgl2639质粒，将该质粒转化谷氨酸棒杆菌ahp（该菌株是在谷氨酸棒杆菌atcc 13032的基础上，将天冬氨酸激酶lysc的311位苏氨酸被异亮氨酸取代，同时，将丙酮酸激酶pyc的458位脯氨酸由丝氨酸取代），经过二次重组后，获得工程菌株ahp（δcgl2639）。
18.本发明还提供了所述的生产l
‑
赖氨酸的谷氨酸棒杆菌株、所述的菌株构建方法在生产l
‑
赖氨酸中的应用。
19.本发明进一步提供了一种制备l
‑
赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：培养上述的l
‑
赖氨酸生产菌株或上述菌株构建方法构建的生产l
‑
赖氨酸谷氨酸棒杆菌株，使之产生l
‑
赖氨酸；和任选地从培养所得到的培养液中分离l
‑
赖氨酸。
20.本发明基于新的研究发现而提供了一种构建生产赖氨酸谷氨酸棒杆菌株的新方法，从而为l
‑
赖氨酸高产菌株的构建开辟了新的途径，本发明构建的赖氨酸生产菌株的赖氨酸产量得以大幅提高，因而通过本发明方法生产赖氨酸的成本将会大大降低。
21.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
22.术语定义多核苷酸，一般是指多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的rna或dna，或修饰的rna或dna。本发明的核苷酸序列可以是seq id no：2所述的核苷酸序列，也可以是在严格条件下与seq id no：2所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，也可以是与由seq id no：2制备的探针杂交的核苷酸序列。这里所说的“严格条件”是指特异性杂交可发生而非特异性杂交不发生的条件。如，在一定浓度的盐溶液中洗涤，洗涤1次，优选洗涤2次或3
次，相应地浓度为0.1*ssc、0.1% sds，优选60℃下0.1*ssc、0.1% sds，更优选68℃下0.1*ssc、0.1% sds，探针长度可根据杂交条件选择，通常为100bp到1kb。
23.术语“多肽”、“肽
”ꢀ
和“蛋白质
”ꢀ
在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰（例如，二硫键形成、糖基化、 脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合） 的氨基酸聚合物。
24.术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。
25.术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同（即同一）的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸碱基的取代或突变，或缺失或插入核苷酸的一个或两个多核苷酸中的核苷酸碱基而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸（即取代或突变）或缺失氨基酸（即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失）而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
26.本文所用的术语“野生型/内源性”指的是在微生物中多肽或多核苷酸处于未修饰状态，即自然状态。例如，一种可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽、多核苷酸序列或微生物是天然存在的。如本发明所用的，“天然存在”和“野生型”是同义词。
27.在一些实施方式中，本发明的野生型菌株是指包含内源性多肽的菌株，内源性多肽为氨基酸序列如seq id no：1所示序列的多肽，或者与seq id no：1所示序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的序列编码的多肽。
28.在具体的实施方式中，野生型菌株为包含内源性多肽的谷氨酸棒杆菌。
29.在一些实施方式中，本发明对野生型菌株进行基因改造，得到重组菌株，重组菌株与野生型菌株相比，具有如下（i）
‑
（ii）至少一项所示的特性：（i）降低或消失的内源性多肽或同源多肽的活性；（ii）降低或消失的内源性多肽的编码基因或同源基因的表达水平；所述内源性多肽为如seq id no：1所示氨基酸序列的多肽，或与seq id no：1所示氨基酸序列具有至少90%，可选至少95%，优选至少97%，更优选至少98%，最优选至少99%的序列同一性的序列编码的多肽；所述多核苷酸为如seq id no：2所示核苷酸序列的多核苷酸，或与seq id no：2所示核苷酸序列具有至少90%，可选至少95%，优选至少97%，更优选至少98%，最优选至少99%的序列同一性的序列编码的多核苷酸。
30.基于本发明的教导，本领域技术人员应该理解，本发明通过将谷氨酸棒杆菌的seq id no：1所示多肽失活来提高菌株的赖氨酸产量。因此，本文所述的“seq id no：1所示多肽
活性降低或消失”表示，与野生型菌株相比，seq id no：1所示多肽的表达被降低、减弱甚至完全消失，或指产生不表达的基因，或尽管表达但表达产物不具有活性或者具有降低的活性。即，与野生型菌株相比，seq id no：1所示多肽在细胞中不能正常发挥功能。
31.在具体实施方式中，相比于野生型或内源性多肽，失活后基因的转录、表达或编码的蛋白的活性降低至少30%，优选至少40%，更优选至少50%，例如至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%，或者该野生型或内源性多肽的编码基因被去除。
32.本发明所述“修饰”是指任何对野生型菌株或亲本菌株进行的遗传操作，包括但不限于各种分子生物学手段。本发明中的术语“修饰”、“基因编辑”、“基因改造”可相互替换。
33.本发明中术语“降低或消失”可以通过修饰来实现，包括但不限于通过删除部分或全部编码基因、基因阅读框移码突变、弱化转录或翻译强度、或使用编码具有较低活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因，或使对应基因或酶失去活性，及任选地组合使用这些方法。采用合适的培养方法或基因表达的信号结构的遗传修饰(突变)可以实现基因表达的降低，例如基因表达的信号结构是阻遏基因，活性基因，操纵基因，启动子，弱化子，核糖体结合位点，起始密码子和终止子。
34.基于本发明的教导，本领域技术人员知晓，可以通过降低或消除seq id no：1所示多肽的编码基因，或者使得seq id no：1所示多肽在细胞中不能正常发挥功能来提高赖氨酸的产量。本领域技术人员可以通过本领域已知的技术手段实现上述目的。例如，可以通过使染色体上的酶编码基因缺陷，或者通过修饰一个表达控制序列如启动子或sd序列来实现；也可以通过向编码区域引入氨基酸取代(错义突变)、终止密码子(无义突变)，或向编码区引入一个或两个碱基的插入或缺失(移码突变)或缺失部分基因来实现(journal of biological chemistry 1997，272: 8611
‑
8617)，包括但不限于上述方法，例如也可通过物理或化学方式诱变结合筛选而实现。
35.本文所说的“l
‑
赖氨酸生产菌株”是指，当细菌在培养基中培养时可以生产l
‑
赖氨酸并且能够积累l
‑
赖氨酸，或者能够将l
‑
赖氨酸分泌到培养基中，也就是能够得到胞外的游离赖氨酸的菌株。例如，可以是天然存在的l
‑
赖氨酸生产菌株，也可以是经过遗传改造获得的l
‑
赖氨酸生产工程菌株。
36.作为优选地，l
‑
赖氨酸生产菌株是来源于棒状杆菌属的谷氨酸棒杆菌。其中，谷氨酸棒杆菌可以是谷氨酸棒杆菌atcc 13032、谷氨酸棒杆菌atcc 13869或谷氨酸棒杆菌atcc14067等，以及由上述菌株制备的产生l
‑
赖氨酸的突变体菌株或谷氨酸棒杆菌的衍生菌株。
37.示例地，l
‑
赖氨酸生产菌株可以是在谷氨酸棒杆菌atcc 13032基础上表达解除反馈抑制的天冬氨酸激酶的菌株。此外，l
‑
赖氨酸生产菌株也可以是具有l
‑
赖氨酸生产能力的经改造的菌株。
38.这些改造包括但不限于所述菌株中的选自以下的一个或几个基因被增强或多表达：a1. 编码解除赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶lysc基因；b1. 编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成酶的dapa基因；c1. 编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapb基因；d1. 编码二氨基庚二酸脱水酶的ddh基因；
e1. 编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的dapd和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的dape；f1. 编码天冬氨酸
‑
半醛脱水酶的asd基因；g1. 编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；h1. 编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的pntab基因；i1. 编码赖氨酸的运输蛋白lyse基因。
39.此外，包含但不限于所述菌株中选自以下的一个或几个基因被弱化或表达降低：a2. 编码乙醇脱水酶的adhe基因；b2. 编码乙酸激酶的acka基因；c2. 编码磷酸乙酰转移酶的pta基因；d2. 编码乳酸脱水酶的ldha基因；e2. 编码甲酸转运蛋白的foca基因；f2. 编码丙酮酸甲酸裂解酶的pflb基因；g2. 编码丙酮酸氧化酶的poxb基因；h2. 编码天冬氨酸激酶i/高丝氨酸脱水酶i双功能酶的thra基因；i2. 编码高丝氨酸激酶的thrb基因；j2. 编码赖氨酸脱羧酶的ldcc基因；k2. 编码赖氨酸脱羧酶的cada基因。
40.在一些实施方式中，经过遗传改造获得的l
‑
赖氨酸生产工程菌株内降低或消失的蛋白活性、降低或消失的蛋白编码基因的表达水平、降低或消失的酶活性、降低或消失的酶编码基因的表达水平，包括以下述基因工程的方法改造得到的重组菌株：向菌株中引入弱启动子、弱核糖体结合位点，对蛋白、酶的编码基因进行基因敲除或敲减，向蛋白、酶的编码基因中插入随机片段使蛋白、酶的活性丧失。
41.在一些实施方式中，经过遗传改造获得的l
‑
赖氨酸生产工程菌株内增强的蛋白活性、增强的蛋白编码基因的表达水平、增强的酶活性、增强的酶编码基因的表达水平，包括以下述基因工程的方法进行改造：向菌株中引入强启动子、强核糖体结合位点，引入非整合型的蛋白、酶的重组表达载体，引入染色体整合型的蛋白、酶的重组表达载体。
42.术语“载体”指的是dna构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的dna序列，从而在合适的宿主中表达目的基因。“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的dna结构。重组表达载体可包括，例如包含 i）对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii）转录成mrna并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii）适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本发明的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成dna序列，例如细菌质粒、噬菌体dna、酵母质粒以及从质粒和噬菌体dna的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、sv40和伪狂犬病等病毒的dna。在一些实施方式中，本发明的“重组表达载体”是指突变载体。
43.本发明中的术语“转化、转染、 转导”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的dna导入宿主的过程。所述转化、转染、转导的方法包括任何将核酸导入细胞的方
法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(ca3(po4)2)沉淀法、氯化钙(cacl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(peg)法、deae
‑
葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂
‑
dmso法。
44.本发明的菌株的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的ph值等。
45.除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本发明中的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。
46.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york: cold spring harbor laboratory press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
47.本发明所用的tsb液体培养基成份为(g/l)：葡萄糖，5 g/l；酵母粉，5 g/l；大豆蛋白胨，9 g/l；尿素，3 g/l；丁二酸，0.5 g/l；k2hpo4·
3h2o，1 g/l；mgso4·
7h2o，0.1 g/l；生物素，0.01 mg/l；维生素b1，0.1 mg/l ；mops，20 g/l；初始ph7.2。
48.本发明所用的发酵培养基成分为(g/l)：大豆蛋白胨，1 g/l；k2hpo4·
3h2o，1 g/l；nacl，1 g/l；（nh4）2so4，1 g/l；mops，40 g/l；葡萄糖，100 g/l；urea，20 g/l；生物素，0.40 mg/l；vb1，0.10mg/l；mgso
4 ·
7h2o，0.45 g/l；feso4·
7h2o，0.05 g/l；培养基中加入10 ml氨水调节ph。
49.本发明所用的赖氨酸检测方法：取100 μl培养物与900 μl的ddh2o混合均匀（稀释10倍），4℃，7500 rpm离心5 min，取上清。通过sba检测赖氨酸量。
50.实施例1. 谷氨酸棒杆菌seq id no：1所示多肽编码基因cgl2639敲除载体构建根据已报道的谷氨酸棒杆菌atcc 13032基因组序列（gene id: 2830649），分别设计引物seq id no：3：attcgagctcggtacccgccttctcagttgatgcttcctc和seq id no：4：atgaggctgcaagctcagagaatacggcggttgcggctcc；seq id no：5：tgagcttgcagcctcatgcgctc和seq id no：6：gactctagaggatccccagtgctggaatgtctgcatgcac，以atcc 13032基因组为模板，通过pcr扩增获得seq id no：1所示多肽基因的上下游同源臂。上述pcr片段回收后，与smai酶切处理的pk18mobsacb载体进行重组连接，获得seq id no：1所示多肽编码基因的敲除质粒pk18
‑
cgl2639。
51.实施例2. 谷氨酸棒杆菌seq id no：1所示多肽cgl2639缺失菌株构建由于野生型谷氨酸棒杆菌atcc 13032不能生产赖氨酸，因此，本发明首先构建一个产赖氨酸的菌株，即在谷氨酸棒杆菌atcc 13032菌株天冬氨酸激酶lysc引入了t311i点突变，在丙酮酸羧化激酶pyc引入p458s点突变，获得赖氨酸生产菌株ahp。制备ahp菌株的感受态细胞，将上述构建的pk18
‑ꢀ
cgl2639质粒转化该菌株，涂布在含有25 mg/l卡那霉素的tsb平板上，放30℃培养获得第一次重组的转化子。将正确转化子在tsb培养基中培养3 h后，涂布含有10%蔗糖的tsb平板，放30℃培养，待长出转化子后，分别转移至tsb无抗平板和带有卡那霉素抗性的tsb平板培养，并分别以seq id no：7：gcatgcatcaagcaccacagaaac和seq id no：6：gactctagaggatcccccgaagcgttcagcgattcaac为引物进行菌落pcr，对能在无抗tsb平板生长且不能在卡那霉素平板生长的突变体进行测序，获得cgl2639缺失的菌株
ahp（δcgl2639）。
52.实施例3. cgl2639缺失对谷氨酸棒杆菌赖氨酸合成的影响首先，将ahp和ahp（δcgl2639）菌株分别接种至装有25 ml tsb培养基的100 ml摇瓶中，在30℃和220 rpm条件下培养7 h得到种子液；随后分别将ahp和ahp（δcgl2639）的种子液接种至装有30 ml发酵培养基的摇瓶中，使其初始od
600
达到0.5，30℃和220 rpm条件下培养44 h取样，检测其赖氨酸产量和od
600
，结果如下表1。可知，在第44 h时，ahp（δcgl2639）产酸为5.6 g/l，ahp为4.1 g/l，产酸水平提高了36.6%。以上结果表明，cgl2639缺失可提高菌株赖氨酸的产量，有利于工业生产。
53.表1