工程化乙型肝炎核心多肽的制作方法

工程化乙型肝炎核心多肽


背景技术：

1.病毒样颗粒(vlp)不具传染性，其具有可以高表面密度展示分子的重复表面，其细胞摄取和细胞内转运能力与天然病毒相当。所有这些功能特性都让人有兴趣将这种颗粒作为组装核心以用于疫苗、诊断和治疗中。这种颗粒或可用作展示核酸、蛋白和其他化学部分的多价支架。vlp作为疫苗特别有吸引力，因为它们具有体内稳定性，能够向淋巴结转移，并且能够通过展示的表位刺激b和t细胞应答。它们也可以填充货物作为运载工具。
2.无细胞蛋白合成(cfps)可以是一种有效的vlp生产方法，例如包含乙型肝炎核心蛋白(hbc)、ms2噬菌体外壳蛋白和qβ噬菌体外壳蛋白等的vlp。cfps还提供了一种将非天然氨基酸(nnaa)引入蛋白的简便方法，这可以通过利用cu(i)催化的[3 2]环加成点击化学反应使抗原直接蛋白
‑
蛋白偶联至vlp上。
[0003]
在不同类型的vlp中，hbc vlp是一种灵活且有前景的模型，可用于基于知识的外源肽序列展示。hbc颗粒作有前景的vlp载体于1986年被首次报道。作为第一种候选vlp和第一种二十面体vlp载体，hbc vlp已经过良好表征且广泛用作100多种不同外源序列的载体。hbc衣壳蛋白的长度为183至185个氨基酸。hbc蛋白的富含精氨酸的c端对于vlp组装而言可有可无，因此在氨基酸149处截短的hbc蛋白得到广泛应用。截短的hbc(1
‑
149)蛋白可自组装成平均直径为30至35nm且占主导地位的二十面体对称性t＝4的颗粒。
[0004]
核心蛋白工程化以及用以改进货物负载的组装方法均具有重要意义，本文对此进行了探讨。


技术实现要素：

[0005]
本发明提供了经基因修饰的乙型肝炎核心(hbc)蛋白，所述蛋白包含增强蛋白稳定性和/或效用的序列修饰，所述修饰包括在所述hbc蛋白的所述羧基末端添加货物负载域。本文所述的修饰允许将治疗性货物(包括但不限于rna、dna、蛋白、小分子(例如化疗药物)等)负载至vlp中。所述负载可以利用疏水引力或离子配对引力。任选地，所述货物通过二硫键与vlp内部结合。
[0006]
本发明还提供了用以生产货物负载vlp的方法。将所述货物添加到含有所述hbc蛋白(例如，本文所揭示的经修饰的hbc蛋白)的溶液中，以便同时进行由所述溶液的离子强度增加而触发的药物负载和vlp组装。货物负载vlp经纯化和稳定处理后，通过同时将赋予不同功能的分子附着于表面来作进一步修饰，包括用以增强血清半衰期的部分，例如，peg等；特异性细胞靶向部分，例如，蛋白，包括但不限于单链抗体片段、适配子、适用于细胞表面受体的配体等。在一些实施例中，所述靶向部分将所述vlp靶向癌细胞。在一些实施例中，所述靶向部分将所述vlp靶向受感染细胞，例如，受病原体感染的细胞。
[0007]
包含本文所述的经修饰的hbc蛋白的vlp可在0.5m nacl溶液中自组装。在一些实施例中，为了在负载期间维持货物溶解度，所述vlp组装在有机溶剂存在的情况下进行，例如，在约0.5％至约20％(例如，至少约5％、至少约10％且不超过约20％、不超过约15％)的有机溶剂(例如dmso、dmf等)存在的情况下。还可以包括浓度为约0.01％至约1％(例如，约
0.1％)的非离子表面活性剂，例如tween
‑
20等。组装后，用温和的氧化剂(例如联氨)处理所述vlp。氧化后，二硫键在生理盐水和类似赋形剂中保持稳定状态。所述二硫键还原后，例如被细胞摄取后，所述vlp在低离子强度溶液中解组装。这种有条件稳定化允许在细胞质中存在的还原条件下释放治疗性货物。
[0008]
在一些实施例中，在序列号：1、序列号：2或类似hbc多肽中列出的序列通过在残基a131处碱性氨基酸的氨基酸取代进行修饰，例如h、k、r，在一些实施例中，所述取代是a131k。这种修饰通常与氨基酸取代组结合进行，这种取代可以相对于序列号：1或序列号：2减少所述蛋白“尖峰尖端”(即，残基73
‑
81区域)上的负电荷。在一些实施例中，相对于序列号：1或序列号：2，所述氨基酸组变化是i57v、l60s、g63r、d64e、l65v、m66t、t67d、l68f、a69g、t70d、t74n、l76m、e77q、p79q、s81a、s87n、t91a、v93i和f97i。在一些实施例中，所述氨基酸组变化是t74n、l76m、e77q、p79q和s81a。在一些实施例中，负电荷减少的所述hbc蛋白的所述氨基酸序列是序列号：3。现已发现，所述尖端取代组使得组装所需的离子强度增加，例如，增至约1.5m nacl。引入所述a131取代可使组装所需的离子强度减小，例如使其小于1m、小于0.75m、小于0.5m，并且可以使其小于0.25m。
[0009]
对于负载货物，所述hbc蛋白可以通过在所述末端(通常是c端)添加货物负载域来作进一步修饰。货物负载域的选择可基于所述预期货物的性质进行。示例性货物负载域的长度为至少1个且通常不超过15个氨基酸，例如长度至少为2个、至少为3个且至多为12个、至多为10个、至多为8个氨基酸。在一些实施例中，货物负载域包含一个半胱氨酸残基。在一些实施例中，在所述货物的所述分子大小小于2nm的情况下，在所述货物负载域中提供半胱氨酸；并且所述货物被选定为具有游离巯基，或经修饰以引入游离巯基。
[0010]
示例性货物负载域包括但不限于(序列号：4)egfgegfgegf；(序列号：5)egfgegfgegfc；(序列号：6)igigc；(序列号：7)igigic；rrr；r；ⅲc；c；crc；eee；等等。采用本文提供的方法，可以根据经验选择货物负载域的序列，以便：进行高效的vlp亚单位生产(蓄积、折叠和纯化)以及将亚单位高效地组装成vlp，同时也最大限度地增加每个vlp负载的分子数量，避免因蛋白水解而造成的损失。
[0011]
所述hbc蛋白还可在预定位点包含一个或更多个非天然氨基酸。目的非天然氨基酸包括但不限于叠氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、p
‑
乙酰基
‑
苯基丙氨酸、p
‑
乙炔基
‑
苯基丙氨酸、p
‑
炔丙氧基苯基丙氨酸、p
‑
叠氮基
‑
苯基丙氨酸等。所述非天然氨基酸可以位于所述hbc蛋白的尖峰处。目的位点包括，例如，n75、t74、l76、q77、d78、q79和a80。在一些实施例中，所述非天然氨基酸置换a80。在一些实施例中，所述非天然氨基酸是叠氮基高丙氨酸。
[0012]
hbc多肽或由此产生的vlp可以包含不同于hbc多肽的缀合部分，其中此类部分在所述引入的非天然氨基酸处与hbc缀合，例如，通过点击化学反应实现。合适的部分包括多肽、核酸、多糖、治疗性药物、成像部分等。在相关实施例中，提供了一种方法，其中hbc中的所述非天然氨基酸用于点击化学反应中，使附加部分与本发明的hbc或包含本发明的hbc的vlp连接。
[0013]
本发明的hbc多肽可通过以下方式制备：用编码所述多肽的核酸转化宿主细胞，然后培养所述宿主细胞并从所述培养物中回收多肽；或者生成编码所述hbc多肽的核酸构建体，然后通过无细胞合成来产生多肽，所述合成可以包括偶联的转录和翻译反应。还提供了编码所述hbc多肽的载体和多核苷酸。在一些实施例中，提供了包含本发明的多肽的vlp。
[0014]
在本发明的一实施例中，提供了用于本发明的蛋白的无细胞蛋白合成(cfps)的方法。在一些实施例中，合成了所述cfps产物；并且可以在还原环境中将其进一步组装成vlp。所述cfps产品可以与含约1m至约2m盐的溶液接触，例如约1.5m盐，例如nacl等。所述组装的vlp可以在还原环境中分离。在合成并组装成vlp后，可以将所述vlp转移到氧化环境中，以生成稳定的二硫键。
附图说明
[0015]
结合附图阅读以下详细说明，可获得对本发明最全面的理解。需要强调的是，根据惯例，附图的各个特征未按比例绘制。相反，为了清楚起见，可任意扩大或缩小各个特征的尺寸。附图中包括以下图示：
[0016]
图1.成功的组装变体：a131k突变与尖峰移植修饰相结合，以便在500至1000mm nacl之间进行大量的组装。误差条表示与重复实验得到的平均值(n＝3)的标准差。
[0017]
图2.a131k hepbc变体的组装动力学特征。
[0018]
图3.a131k hepbc变体(左图)和野生型hepbc(右图)的tem图像显示出的vlp形态相似。
[0019]
图4.多柔比星和罗丹明123的尺寸估计表明，它们小到足以通过最大尺寸约为的最大vlp孔。
[0020]
图5.初始负载实验的结果。hepbc c端负载域示于左上角，具有疏水性和带负电荷的残基，以吸引疏水性和带正电荷的抗癌药物模拟物罗丹明123。sec色谱图显示了良好的vlp组装效率以及建议的负载量(即，每个vlp负载约1000个货物分子)。
[0021]
图6.罗丹明123负载vlp的连续sec柱洗涤结果表明货物从vlp外壳的孔中漏出。
[0022]
图7.hepbc二聚体亚单位的示意图，其c端货物负载域还含有半胱氨酸残基，用以实现展示巯基部分的货物分子的二硫键保留。在这种情况下，负载域包含疏水性残基，以吸引疏水性货物分子。还示出了用以纯化亚单位及触发内体逃逸的六组氨酸延伸。
[0023]
图8.用以实现疏水性货物和二硫键保留的hepbc c端负载域示意图。示出了两种示例货物(美登素(dm1)和bdfl)及其尺寸。
[0024]
图9.具有不同c端货物负载序列的hepbc突变体的还原sds
‑
page凝胶放射自显影图。示出了货物负载域序列——序列号：8、序列号：9、序列号：10、序列号：11、序列号：12。
[0025]
图10.通过增加氯化钠浓度以获得更强的疏水相互作用来改善vlp组装(适用于具有hp尖峰的hepbc亚单位)。
[0026]
图11.示出了通过半胱氨酸实现小分子染料(bodipy fl
‑
半胱氨酸，bdfl)负载和缀合的尺寸排阻色谱图。在进行此分析之前，对bdfl负载(和缀合)vlp进行大量的洗涤，证明与vlp相关联的bdfl处于缀合状态。
[0027]
图12.示出了在含有dmf(二甲基甲酰胺)的溶液中实现极好vlp组装的sec色谱图。
[0028]
图13.示出了在含有15％dmso(二甲亚砜)的溶液(无论有无25倍摩尔过量的抗癌药物美登素)中实现极好vlp组装的sec色谱图。
[0029]
图14.大分子治疗性货物汇总以及针对每种货物设计的负载/保留机制。
[0030]
图15a
‑
15b.22nt单链dna(ssdna)构建体。(图15a)用巯基和荧光标签(6
‑
fam)实现官能化；(图15b)用巯基、荧光标签和疏水性负载标签(胆固醇)实现官能化。
[0031]
图16.在hepbc(cys)上使用中性负载域负载单链dna(ssdna)。尺寸排阻色谱图示出了vlp和ssdna浓度。上面的图表是完整的ssdna图谱，下面的图表使[dna]纵坐标缩小以显示与vlp相关的ssdna。实验使用具有负载域
–
c的hepbc hp a131k 6h。
[0032]
图17.在hepbc(cys
‑
arg
‑
cys)上使用离子配对负载域负载单链dna(ssdna)。尺寸排阻色谱图示出了vlp和ssdna浓度。上面的图表是完整的ssdna图谱，下面的图表使[dna]纵坐标缩小以显示与vlp相关的ssdna。实验使用具有负载域
–
crc的hepbc hp a131k 6h。
[0033]
图18.使用hepbc(ile
‑
gly
‑
ile
‑
gly
‑
ile
‑
cys)上的疏水性负载域负载单链dna(ssdna)。尺寸排阻色谱图示出了vlp和ssdna浓度。上面的图表是完整的ssdna图谱，下面的图表使[dna]纵坐标缩小以显示与vlp相关的ssdna。实验使用具有负载域
–
igigic的hepbc hp 2asvins ss1 ss8 80m 6h。
[0034]
图19.负载到hepbc vlp中的ssdna的琼脂糖凝胶电泳分析。dna通过附着的荧光团的荧光实现可视化。dna负载vlp应用于第一通道，而第二通道示出了vlp还原以释放货物后的结果。第三通道示出了负载前的货物情况以供比较。
[0035]
图20.每个vlp(用以得到多种hepbc vlp变体)负载的ssdna汇总。误差条表示与重复实验得到的平均值(n＝3)的标准差。
[0036]
图21.每个vlp(用以得到多种hepbc vlp变体)负载的蛋白汇总。误差条表示与重复实验得到的平均值(n＝3)的标准差。
[0037]
图22.使用hepbc hp ss1 78aha 6h改变附接于每个hepbc vlp的抗psma dna适配子的数量。
[0038]
图23.vlp与lncap细胞之间的关联的流式细胞术分析。尽管在缺乏适配子的vlp和pc
‑
3细胞中观察到了一些非特异性的结合，但展示适配子的vlp在更大程度上与psma lncap细胞相关联。计数是指针对每种样本分析的细胞数。
具体实施方式
[0039]
本发明提供了经基因修饰的乙型肝炎核心(hbc)蛋白，所述蛋白包含增强蛋白稳定性和/或效用的序列修饰，所述修饰包括在所述hbc蛋白的所述羧基末端添加货物负载域。本文所述的修饰允许将治疗性货物(包括但不限于rna、dna、蛋白、小分子(例如化疗药物)等)负载至vlp中。所述负载可以利用疏水引力或离子配对引力。任选地，所述货物通过二硫键与vlp内部结合。
[0040]
本发明的hbc多肽尤其适合用作vlp的组分，尤其是设计用于封装货物的vlp。另外，vlp还可以通过诸如点击化学反应与一个或更多个附加部分缀合。在一些实施例中，使用非天然氨基酸使所述hbc蛋白与所述附加部分连接。
[0041]
在一些实施例中，本发明提供了本文所示的缀合物、化合物或组合物在药物制造中的用途。在一实施例中，本发明提供了本文所示的缀合物、化合物或组合物在用以预防或治疗感染的药物(例如，疫苗)制备中的用途。在一些实施例中，本发明提供了本文所示的缀合物、化合物或组合物在预防或治疗感染方面的用途。
[0042]
定义
[0043]
应当理解，本发明不限于所述的特定方法、方案、细胞系、动物物种或属以及试剂，因为在实际实施中可能会存在差异。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施
例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。
[0044]
本文中使用的单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。因此，举例而言，“一个细胞”的指代对象包括多个此类细胞，而“所述培养物”的指代对象包括一种或更多种培养物及所属领域技术人员已知的等效物，等等。除非另有明确定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
[0045]
术语“hbc”是指乙型肝炎核心蛋白的氨基酸肽序列，或指序列号：1或序列号：2中所示的截短形式，或指类似蛋白，例如，用一个或更多个二硫键修饰的蛋白；经修饰以提供用于引入非天然氨基酸的位点的蛋白，包含尖端修饰等，如第9,896,483号美国专利所述，此专利明确以引用方式并入本文中。
[0046]
可在合成时或表达时向肽中引入各种基团，使其可以与其他分子或表面连接。所述引入的基团无需包括在hbc结构域本身中，但可以作为标签或融合c端或n
‑
端引入所述hbc结构域中。因此，可使用半胱氨酸制备硫醚，通过多聚组氨酸连接金属离子络合物，通过羧基形成酰胺或酯，通过氨基形成酰胺等。可以包括在起始甲酰
‑
甲硫氨酸之后插入3个氨基酸(asv)，以通过甲硫氨酰氨肽酶去除翻译起始非天然甲硫氨酸类似物，避免在不合乎需求的位置发生表面缀合。
[0047]
在一些实施例中，在蛋白中的一个或更多个限定位点处包括非天然氨基酸，包括但不限于在残基80处。本发明的hbc多肽可以包括用于控制与缀合配偶体的直接连接的非天然氨基酸。缀合配偶体可以具有用于与所述hbc多肽上的所述非天然氨基酸缀合的活性基团。在一些实施例中，所述缀合配偶体经修饰以包含非天然氨基酸，并与hbc多肽反应，通常是也包含非天然氨基酸并组装在二硫键稳定的vlp中的hbc多肽。所述缀合配偶体上的非天然氨基酸不同于所述hbc多肽上存在的非天然氨基酸，并且两者发生反应。
[0048]
本领域技术人员应当理解，可以在所述序列中进行微小的氨基酸改变而不改变所述蛋白的功能，例如，改变1、2、3、4、5、6、7、8、9或至少约10个氨基酸，并且全长蛋白可以取代本文例举的截短形式。hbc在功能上能够自组装以形成二十面体病毒样颗粒。本发明的hbc多肽包含如上所述的氨基酸取代，其包括但不限于在残基a131处的修饰或货物负载域的添加。
[0049]
本文中使用的术语“纯化的”和“分离的”在多肽背景下使用时，是指基本上不含来自获取它的物质(例如，细胞物质)的污染物质，例如但不限于细胞碎片、细胞壁物质、膜、细胞器、大部分核酸、碳水化合物、蛋白质和/或细胞中存在的脂质。因此，分离的多肽包括细胞物质和/或污染物质少于约30％、20％、10％、5％、2％或1％(按干重计)的多肽的制剂。本文中使用的术语“纯化的”和“分离的”在化学合成的多肽背景下使用时，是指基本上不含参与多肽合成的化学品前体或其他化学品的多肽。
[0050]
术语“多肽”、“肽”、“寡肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指任何长度的聚合形式的氨基酸，其可以包括编码和非编码的氨基酸、经化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸以及具有经修饰的肽骨架的多肽。
[0051]
还可根据重组合成的常规方法或无细胞蛋白合成方法对所述多肽进行分离和纯化。本发明提供了示例性编码序列，但本领域技术人员可基于所提供的氨基酸序列轻易地设计合适的编码序列。本领域技术人员所熟知的方法可用于构建含有编码序列和适当的转
录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组dna技术、合成技术和体内重组/基因重组。或者，可以化学合成能够编码目的多肽的rna。本领域技术人员可以轻易地利用所熟知的密码子使用表和合成方法来为本发明的多肽中的任一种提供合适的编码序列。所述核酸可以基本纯度分离和获取。通常，获取的所述核酸，无论是dna还是rna形式，基本上不含其他天然存在的核酸序列，其纯度一般至少约为50％，通常至少约为90％，并且通常是“重组的”，例如，侧面具有一个或更多个核苷酸，在自然存在的染色体上通常不具关联性。本发明的核酸可作为线性分子或在环状分子内提供，并且可在自主复制分子(载体)内或在无复制序列的分子内提供。所述核酸的表达可通过它们自己或本领域已知的其他调节序列来调节。可采用本领域可用的多种技术将本发明的核酸引入合适的宿主细胞中。
[0052]
本文中使用的术语“病毒样颗粒”是指一种或更多种病毒蛋白(通常是病毒外壳蛋白)的稳定大分子组装。vlp中的独立蛋白链数量通常为至少约60个蛋白、约80个蛋白、至少约120个蛋白或更多，这取决于特定病毒几何结构。在本发明的方法中，所述hbc维持在允许自组装成所述衣壳结构的条件下，尤其是还原条件下。本发明的方法可在不存在病毒多核苷酸基因组的情况下合成外壳蛋白，因此所述衣壳可以是空的，或含有非病毒组分，例如，mrna片段等。
[0053]
在生理条件下，稳定vlp衣壳结构中的蛋白长时间保持结合状态，例如持续至少约24小时、至少约1周、至少约1个月或更长时间。组装后，所述vlp可具有与天然病毒颗粒相当的稳定性，例如，在暴露于ph值变化、高温、冷冻、离子变化等条件下时。本领域已知的vlp的其他组分可包括在所述vlp内或布置在所述vlp上。vlp不含有完整的病毒核酸，并且它们不具传染性。在一些实施例中，所述vlp表面上有足够的病毒表面包膜糖蛋白和/或佐剂分子，这使得vlp制剂被配制成免疫原性组合物并施用于动物或人时，产生免疫应答(细胞介导或由体液引起)。
[0054]
物质的“有效量”或“足够量”是指足以引起所需生物学效应的量，例如有益结果，包括临床结果，因此，“有效量”取决于应用其的背景。在本发明的背景下，有效量的疫苗的示例是足以在个体中诱导免疫应答(例如，抗体产生)的量。有效量可以在一次或更多次施用中施与。
[0055]
本文中使用的折叠是指形成多肽和蛋白的三维结构的过程，其中氨基酸残基之间的相互作用起到稳定结构的作用。非共价相互作用对于确定结构至关重要，膜与蛋白接触的效应对于形成正确结构有重要作用。对于天然存在的蛋白和多肽或其衍生物和变体而言，正确折叠的结果通常是产生最佳生物学活性的排列，可以方便地通过活性测定(例如，配体结合、酶活性、组装成vlp的能力等)进行监测。
[0056]
在一些情况下，例如，在所需产物是合成来源的情况下，基于生物学活性的测定意义不大。此类分子的正确折叠可基于物理特性、能量考量、建模研究等来测定。
[0057]
目的分离程序包括亲和色谱分析。亲和色谱分析利用通常存在于生物大分子中的高度特异性结合位点，分离分子结合特定配体的能力。共价键以明显地将配体呈递给蛋白样本的方式将配体连接到不溶性多孔载体介质上，从而使用一种分子物质的天然生物特异性结合从混合物中分离和纯化第二种物质。抗体通常用于亲和色谱分析。优选地，将微球或基质用作亲和色谱分析的支持物。此类支持物是本领域已知的且可购得的，包括可与连接子分子结合的活化支持物。例如，基于琼脂糖或聚丙烯酰胺的affi
‑
gel支持物是适合于用
蠕动泵或重力流动洗脱进行的多数实验室规模纯化的低压凝胶。基于压力稳定型大孔径聚合物的affi
‑
prep支持物适合制备和工艺规模的应用。
[0058]
还可以使用本领域已知的方法通过离子交换色谱分析和/或浓缩、过滤、透析等来分离蛋白。本发明的方法提供了含有非天然氨基酸的蛋白，其生物学活性与天然蛋白相当。人们可通过以下方式确定组合物中的蛋白比活：在功能测定中，确定活性水平；在非功能测定(例如，免疫染色、elisa、在考马斯亮蓝或银染凝胶上进行定量分析等)中量化存在的蛋白的量，同时确定生物学活性蛋白占总蛋白的比例。通常情况下，由此定义的比活是天然蛋白的至少约5％，通常是天然蛋白的至少约10％，并且可以是约25％、约50％、约90％或更高。
[0059]
本发明的经修饰的hbc蛋白可以在预定位点包含至少一个非天然氨基酸，并且可以包含或含有1、2、3、4、5或更多个非天然氨基酸。如果存在于多肽的两个或更多个位点，则所述非天然氨基酸可以是相同的，也可以是不同的。在所述非天然氨基酸不同的情况下，每种非天然氨基酸都存在正交trna和同源trna合成酶。在一些实施例中，单一非天然氨基酸存在于残基80处。
[0060]
可用于本发明的方法中的非天然氨基酸的示例包括：酪氨酸(氨基酸)的非天然类似物；谷氨酰胺(氨基酸)的非天然类似物；苯基丙氨酸(氨基酸)的非天然类似物；甲硫氨酸(氨基酸)的非天然类似物；苏氨酸(氨基酸)的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸盐、硼酸酯、磷酸基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮或氨基取代的氨基酸或其任何组合；具有可光活化交联剂的氨基酸；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；具有新颖官能团的氨基酸；与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸；金属结合氨基酸；含有金属的氨基酸；放射性氨基酸；光笼蔽和/或可光异构化氨基酸；含有生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化或碳水化合物修饰的氨基酸；含有酮基的氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学裂解或可光裂解的氨基酸；具有延长侧链的氨基酸；含有毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸，例如，糖取代的丝氨酸等；碳键联的含有糖的氨基酸；氧化还原活性氨基酸；含有
‑
羟基的酸；含有氨基硫代酸的氨基酸；α,α二取代的氨基酸；β
‑
氨基酸；以及除脯氨酸以外的环状氨基酸等。
[0061]
目的非天然氨基酸包括但不限于为点击化学反应提供反应物基团的氨基酸(参见点击化学：来自几个良好反应的不同化学功能，hartmuth c.kolb，m.g.finn，k.barry sharpless，应用化学国际版，第40卷，2001，第2004页，其明确以引用方式并入本文中)。例如，受人关注的是氨基酸叠氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、p
‑
乙酰基
‑
l
‑
苯基丙氨酸和p
‑
叠氮基
‑
l
‑
苯基丙氨酸。
[0062]
在一些实施例中，所述非天然氨基酸通过蛋白上甲硫氨酸的整体置换引入，例如，甲硫氨酸可从无细胞反应混合物中除去，并被0.25
–
2.5mm叠氮基高丙氨酸(aha)取代。在此类实施例中，优选取代具有不同氨基酸的天然甲硫氨酸，例如，m66，而atg密码子在适合非天然氨基酸引入的合乎需求的位点(例如残基80)被引入编码序列中。
[0063]
或者，所述非天然氨基酸通过正交组分引入。正交组分包括用非天然氨基酸氨酰化的trna，其中所述正交trna碱基对具有通常与氨基酸无关的密码子，例如，终止密码子；4bp密码子等。反应混合物可以进一步包含能够氨酰化(用非天然氨基酸实现)同源正交
trna的trna合成酶。此类组分是本领域已知的组分，例如，如于2006年5月16日发布的第7,045,337号美国专利所述。所述正交trna能识别选择密码子，其可以是无义密码子，例如终止密码子，例如，琥珀、赭石和蛋白石密码子；四碱基或更多碱基密码子；源自天然或非天然碱基对的密码子等。所述正交trna反密码子环能识别mrna上的选择密码子，并在多肽的该位点上插入非天然氨基酸。
[0064]
正交trna合成酶可进行外源性合成、纯化并加入到本发明的反应混合物中，通常以至少约10μg/ml、至少约20μg/ml、至少约30μg/ml且不超过约200μg/ml的限定量添加。所述蛋白可以在细菌或真核细胞中合成，并通过诸如本领域已知的亲和色谱分析、page、凝胶排阻色谱分析、反相色谱分析等纯化。
[0065]
术语“缀合配偶体”或“选定的附加部分”可互换使用，通常是指与本发明的hbc多肽缀合的任何部分，例如，肽或蛋白、核酸、多糖、标记等。所述缀合配偶体可以包含用于与本发明的hbc多肽进行点击化学缀合的互补活性基团。例如，它可以用一种或更多种非天然氨基酸合成，以便与所述hbc蛋白上存在的非天然氨基酸缀合。本领域技术人员应当理解，用于缀合的化学组成是所熟知的，并且可轻易地应用于多种基团，例如，cpg dna序列、可检测标记、抗原、多肽等。
[0066]
在一些实施例中，所述缀合配偶体是结构蛋白，例如，胶原蛋白、角蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白、弹性蛋白、原纤蛋白、核纤层蛋白等。在一些实施例中，所述缀合配偶体是免疫原，例如，用于免疫的病原体蛋白，包括但不限于流感蛋白，例如血凝素。目的病毒外壳蛋白包括任何已知的病毒类型，例如，dsdna病毒，例如天花(痘症)；牛痘；疱疹病毒，包括水痘
‑
带状疱疹；hsv1、hsv2、ksvh、cmv、ebv；腺病毒；乙型肝炎病毒；sv40；t偶数噬菌体，例如t4噬菌体、t2噬菌体；λ噬菌体；等等。单链dna病毒包括phix
‑
174；腺相关病毒等。负链rna病毒包括麻疹病毒；腮腺炎病毒；呼吸道合胞病毒(rsv)；副流感病毒(piv)；偏肺病毒；狂犬病病毒；埃博拉病毒；流感病毒；等等。正链rna病毒包括脊髓灰质炎病毒；鼻病毒；冠状病毒；风疹病毒；黄热病病毒；西尼罗河病毒；登革热病毒；马脑炎病毒；甲型肝炎和丙型肝炎病毒；烟草花叶病毒(tmv)；等等。双链rna病毒包括呼肠孤病毒；等等。逆转录病毒包括劳氏肉瘤病毒；慢病毒，例如hiv
‑
1和hiv
‑
2；等等。
[0067]
适合作为缀合配偶体的多肽和核酸的示例包括但不限于靶向部分，例如抗体及其片段、适配子等。在其他实施例中，缀合配偶体是抗原蛋白，例如肿瘤抗原、病毒蛋白、细菌蛋白，包括结核抗原、原生动物蛋白，包括疟疾蛋白、肾素；生长激素，包括人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α
‑1‑
抗胰蛋白酶；胰岛素a链；胰岛素；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子，例如因子viiic、因子ix、组织因子和von willebrands因子；抗凝血因子，例如蛋白c；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t
‑
pa)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子
‑
α和
‑
β；脑啡肽酶；rantes和其他趋化因子；人巨噬细胞炎症蛋白(mip
‑
1α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；米勒管抑制物质；松弛素a链；松弛素b链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白，例如
‑
内酰胺酶；dnase；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(vegf)；激素或生长因子受体；整合素；蛋白a或d；类风湿因子；神经营养因子，例如骨源性神经营养因子(bdnf)、神经营养因子
‑
3、
‑
4、
‑
5或
‑
6(nt
‑
3、nt
‑
4、nt
‑
5或nt
‑
6)，或神经生长因子，例如ngf
‑
；血小板衍生生长因子(pdgf)；成纤维细胞
生长因子，例如fgf和fgf；表皮生长因子(egf)；转化生长因子(tgf)，例如tgf
‑
α和tgf
‑
β，包括tgf
‑
β1、tgf
‑
β2、tgf
‑
β3、tgf
‑
β4或tgf
‑
β5；胰岛素样生长因子
‑
i和
‑
ii(igf
‑
i和igf
‑
ii)；des(1
‑
3)
‑
igf
‑
i(脑igf
‑
i)、胰岛素样生长因子结合蛋白；cd蛋白，例如cd
‑
3、cd
‑
4、cd
‑
8和cd
‑
19；红细胞生成素；成骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(bmp)；干扰素
‑
α、
‑
β、
‑
γ等；集落刺激因子(csf)，例如m
‑
csf、gm
‑
csf和g
‑
csf；白介素(il)，例如il
‑
1至il
‑
18；超氧化物歧化酶；t细胞受体；表面膜蛋白；促衰变因子；病毒抗原，例如aids包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；抗体，尤其是单链fv抗体；以及上述任何多肽的片段。
[0068]
货物。所述vlp可以封装货物，例如，在vlp位于细胞内时被释放的分子。封装货物在所述vlp内受到保护，且通常不会在所述vlp表面展示。稳定负载的货物在洗涤后保留在vlp内。
[0069]
许多分子都适合作为货物，包括但不限于rna，例如导向rna、sirna、反义rna等；dna，例如双链或单链dna，包括但不限于质粒、编码序列等；蛋白，例如毒素蛋白，包括，例如，白喉毒素a链、外毒素a链、蓖麻毒蛋白a链、相思豆毒蛋白a链、麻风树毒蛋白、巴豆素、酚霉素、伊诺霉素、澳瑞他汀
‑
e等；基因修饰蛋白，包括但不限于crispr；结合蛋白，例如抗体或其衍生的片段等。细胞毒性药剂多种多样。一类示例性细胞毒性药剂是化疗药剂。示例性化疗药剂包括但不限于阿地白介素、六甲蜜胺、氨磷汀、天冬酰胺酶、博来霉素、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、克拉屈滨、西沙必利、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(dtic)、放线菌素、多西他赛、多柔比星、屈大麻酚、杜卡霉素、阿法依泊汀、依托泊苷、非格司亭、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、格拉司琼、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素、伊立替康、兰索拉唑、左旋咪唑、亚叶酸、甲地孕酮、美司钠、甲氨蝶呤、美登素、胃复安、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奥美拉唑、昂丹司琼、紫杉醇、毛果芸香碱、丙氯拉嗪、利妥昔单抗、皂草素、他莫昔芬、他克唑、盐酸托泊替康、曲妥珠单抗、长春碱、长春新碱、酒石酸长春瑞滨等。
[0070]
在一些实施例中，货物经修饰以增强vlp的包封，例如通过添加游离巯基基团以与hbc蛋白缀合实现。或者，可以选择包含游离巯基基团的货物药剂，例如美登素。极性货物，例如核酸(例如ssdna、rna等)，可以与疏水性基团(例如胆固醇)缀合，以增强负载。或者，可将一种或更多种极性或带电荷的氨基酸与货物缀合。
[0071]
本文中使用的无细胞蛋白合成是指在包含生物学提取物和/或确定试剂的反应混合物中无细胞合成多肽。所述反应混合物包含用于产生大分子的模板，例如，dna、mrna等；用于大分子合成的单体，例如，氨基酸、核苷酸等，以及此类辅因子、酶和其他合成所必需的试剂，例如，核糖体、trna、聚合酶、转录因子等。此类合成反应体系为本领域所熟知且在文献中已有记载。可以分批、连续流或半连续流等本领域所知形式进行无细胞合成。
[0072]
所述cfps和其他后续步骤可以在还原条件下进行，例如，在存在1mm dtt或等效物的情况下。在vlp组装之后，所述条件可能会变为氧化环境，例如，任选地在盐(例如，至多约1m盐、至多约1.5m盐、至多约2m盐，例如，nacl等)存在的情况下，通过透析去除还原剂，然后加入5
‑
10mm h2o2、5
‑
10mm二酰胺或等效物氧化形成二硫键。
[0073]
在本发明的一些实施例中，无细胞合成在氧化磷酸化激活的反应中进行，例如，cytomim
tm
系统。呼吸链和氧化磷酸化激活的证据是在o2存在的情况下，多肽合成增加。在氧化磷酸化激活的反应中，与o2存在时相比，当存在特异性电子传递链抑制剂(例如hqno)或缺少o2时，总多肽合成量至少降低约40％。反应化学详情请见国际专利申请wo 2004/
016778，此申请以引用方式并入本文中。
[0074]
用于合成的cytomim
tm
环境使用在含有葡萄糖和磷酸盐的培养基中生长的细菌细胞的提取物，其中所述葡萄糖的起始浓度至少约为0.25％(重量/体积)，更常用的是至少约为1％；常用的是不超过约4％，更常用的是不超过约2％。此类培养基的示例是2ytpg培养基，但是本领域技术人员应当理解，许多培养基经改造均可用于此目的，其中许多公开培养基适用于细菌(例如大肠杆菌)的生长，其中使用明确的和未明确的营养物来源(参见sambrook,j.，e.f.fritsch和t.maniatis.1989.分子克隆：实验室手册，第2版.冷泉港大学出版社，纽约冷泉港，例如，含有葡萄糖的培养基)。或者，可以根据实验方案使培养物生长，在所述实验方案中，葡萄糖根据需要连续添加于成分明确或复合的生长培养基中，以保持高生长速率。可以在反应混合物中加入小泡作为补充，例如，加入内膜小泡溶液。所提供的此类小泡可占约0至约0.5的体积，通常占约0.1至约0.4的体积。
[0075]
在一些实施例中，存在不超过痕量的peg，例如少于0.1％，并且可以少于0.01％。基本不含peg的反应含有极少量peg，例如，peg不抑制氧化磷酸化。亚精胺和腐胺分子可用于替代peg。精胺或亚精胺的浓度为至少约0.5mm，通常至少约1mm，优选约1.5mm且不超过约2.5mm。腐胺的浓度为至少约0.5mm，优选至少约1mm，优选约1.5mm且不超过约2.5mm。亚精胺和/或腐胺可存在于初始细胞提取物中或另行加入。
[0076]
反应混合物中的镁浓度影响总体合成。细胞提取物中通常存在镁，可再加入镁优化浓度。此类方法中所用镁盐的来源为本领域所熟知。在本发明的一实施例中，镁的来源是谷氨酸镁。优选的镁浓度为至少约5mm，通常至少约10mm，优选至少约12mm；并且浓度不超过约25mm，通常不超过约20mm。其他可提高合成或降低成本的变化包括省略反应混合物中的hepes缓冲液和磷酸烯醇丙酮酸。
[0077]
所述系统可在好氧和厌氧条件下运行。尤其当反应大于15μl时可提供氧气，以增加合成产量。反应室顶部空间可填充氧气；氧气可注入反应混合物中；等等。氧气可持续供给，或在更长反应时间进行蛋白表达的过程中在反应室顶部空间补充氧气。也可在制备细胞提取物中使用其他电子受体，例如硝酸盐、硫酸盐或延胡索酸盐，以使细胞提取物中所需酶具有活性。
[0078]
无需加入外源性辅因子来激活氧化磷酸化。可使用化合物(例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)、nad

或乙酰辅酶a)增加蛋白合成产量，但这并非必须。加入草酸、磷酸烯醇丙酮酸合成酶(pps)代谢抑制剂，可有利于增加蛋白产量，但这并非必须。
[0079]
无细胞蛋白合成的模板可为mrna或dna，优选使用连续用具有可识别启动子的dna模板生成mrna的联合体系。可在反应混合物中直接加入内源性rna聚合酶或外源性噬菌体rna聚合酶，通常为t7或sp6。或者，可通过在qb复制酶(一种rna依赖性rna聚合酶)模板中插入消息以持续扩增mrna。通常在加入反应混合物前利用化学修饰稳定纯化的mrna。可从提取物中去除核酸酶以稳定mrna水平。所述模板可编码任何目的特定基因。
[0080]
可加入其他盐，尤其是生物学相关的盐，例如锰盐。钾的浓度通常为至少约50mm，且不超过约250mm。铵的浓度通常不超过200mm，更通常不超过100mm。通常，所述反应的条件保持在约ph 5
‑
10，温度约20
°‑
50℃的范围内；更通常，保持在约ph 6
‑
9，温度约25
°‑
40℃的范围内。这些范围可根据目的具体条件延伸。
[0081]
可在反应混合物中加入针对不良酶活性的代谢抑制剂。或者，可直接从提取物中
移除引起不良活性的酶或因子，或者可使编码不良酶活性的基因失活或从染色体中删除。
[0082]
多肽
[0083]
本发明的多肽包含hbc序列，例如参考序列号：1或序列号：2，其中进行了多种修饰以提高效用，尤其是针对负载货物。在一些实施例中，在序列号：1、序列号：2或类似hbc多肽中列出的序列通过在残基a131处碱性氨基酸的氨基酸取代进行修饰，例如h、k、r，在一些实施例中，所述取代是a131k。这种修饰通常与氨基酸取代组结合进行，这种取代可以相对于序列号：1或序列号：2减少所述蛋白“尖峰尖端”(即，残基73
‑
81区域)上的负电荷。在一些实施例中，相对于序列号：1或序列号：2，所述氨基酸组变化是i57v、l60s、g63r、d64e、l65v、m66t、t67d、l68f、a69g、t70d、t74n、l76m、e77q、p79q、s81a、s87n、t91a、v93i和f97i。在一些实施例中，所述氨基酸组变化是t74n、l76m、e77q、p79q和s81a。在一些实施例中，负电荷减少的所述hbc蛋白的所述氨基酸序列是序列号：3。现已发现，所述尖端取代组使得组装所需的离子强度增加，例如，增至约1.5m nacl。引入所述a131取代可使组装所需的离子强度减小，例如使其小于1m、小于0.75m、小于0.5m，并且可以使其小于0.25m。
[0084]
对于负载货物，所述hbc蛋白可以通过在所述末端(通常是c端)添加货物负载域来作进一步修饰。货物负载域的选择可基于所述预期货物的性质进行。示例性货物负载域的长度为至少1个且通常不超过15个氨基酸，例如长度至少为2个、至少为3个且至多为12个、至多为10个、至多为8个氨基酸。在一些实施例中，货物负载域包含一个半胱氨酸残基。示例性货物负载域包括但不限于(序列号：4)egfgegfgegf；(序列号：5)egfgegfgegfc；(序列号：6)igigc；(序列号：7)igigic；rrr；r；ⅲc；c；crc；eee；等等。
[0085]
所述hbc可以经修饰以提供一个或一对二硫键，例如，相对于序列号：1，以下各项中的一项或更多项：ss1：d29c、r127c；ss2：t109c、v120c；ss3：y132c、n136c；ss4：y132c、a137c；ss5：r133c、n136c；ss6：r133c、a137c；ss7：p134c、p135c；ss8：p134c、n136c；ss9：p134c、a137c；以及ss10：p135c、n136c。在一些实施例中，所述氨基酸取代是d29c和r127c。在其他实施例中，所述氨基酸取代是p134c和n136c。在一些实施例中，所述氨基酸取代是d29c、r127c、p134c和n136c。
[0086]
所述hbc蛋白还可在预定位点包含一个或更多个非天然氨基酸。目的非天然氨基酸包括但不限于叠氮基高丙氨酸、高炔丙基甘氨酸、p
‑
乙酰基
‑
苯基丙氨酸、p
‑
乙炔基
‑
苯基丙氨酸、p
‑
炔丙氧基苯基丙氨酸、p
‑
叠氮基
‑
苯基丙氨酸等。所述非天然氨基酸可以位于所述hbc蛋白的尖峰处。目的位点包括，例如，n75、t74、l76、q77、d78、q79和a80。在一些实施例中，所述非天然氨基酸置换a80。在一些实施例中，所述非天然氨基酸是叠氮基高丙氨酸。
[0087]
在本发明的一些实施例中，提供了本发明的hbc多肽的单体形式。在其他实施例中，提供了本发明的hbc多肽的二聚体形式。在一些实施例中，所述hbc多肽被组装成vlp，其可在氧化时通过分子间二硫键保持稳定。
[0088]
货物负载方法
[0089]
本文所述的修饰允许将治疗性货物(包括但不限于rna、dna、蛋白、小分子(例如化疗药物)等)负载至vlp中。所述负载可以利用疏水引力或离子配对引力。任选地，所述货物通过二硫键与vlp内部结合。
[0090]
将所述货物添加到含有所述hbc蛋白的溶液中，以便同时进行由所述溶液的离子强度增加而触发的药物负载和vlp组装。货物负载vlp经纯化和稳定处理后，通过同时将赋
予不同功能的分子附着于表面来作进一步修饰，包括用以增强血清半衰期的部分，例如，peg等；特异性细胞靶向部分，例如，蛋白，包括但不限于单链抗体片段、适配子、适用于细胞表面受体的配体等。在一些实施例中，所述靶向部分将所述vlp靶向癌细胞。在一些实施例中，所述靶向部分将所述vlp靶向受感染细胞，例如，受病原体感染的细胞。包含本文所述的经修饰的hbc蛋白的vlp可在0.5m nacl溶液中自组装。在一些实施例中，为了在负载期间维持货物溶解度，所述vlp组装在有机溶剂存在的情况下进行，例如，在约0.5％至约20％(例如，至少约5％、至少约10％且不超过约20％、不超过约15％)的有机溶剂(例如dmso、dmf等)存在的情况下。还可以包括浓度为约0.01％至约1％(例如，约0.1％)的非离子表面活性剂，例如tween
‑
20等。组装后，用温和的氧化剂(例如联氨)处理所述vlp。氧化后，二硫键在生理盐水和类似赋形剂中保持稳定状态。所述二硫键还原后，例如被细胞摄取后，所述vlp在低离子强度溶液中解组装。这种有条件稳定化允许在细胞质中存在的还原条件下释放治疗性货物。
[0091]
缀合方法
[0092]
如本领域所熟知，在用于缀合的活性基团是反应性叠氮化物和炔基基团的情况下，hbc与配偶体之间的反应可以用浓度足以催化的铜(i)催化剂催化，例如，浓度为至少约1μm、至少约0.1mm、至少约1mm等。所述反应可以使用商购的铜(i)(例如溴化亚铜或氯化亚铜)或化合物(例如六氟磷酸四(乙腈)铜(i))进行，只要所述反应在厌氧条件下进行即可。所述反应可在多种溶剂中进行，并且可在由水和多种(部分)混溶的有机溶剂(包括醇、dmso、dmf、tbuoh和丙酮)组成的混合物中顺利进行。所述反应之后将在室温下继续进行，直到达到所需的完成水平为止，例如持续至少约15分钟、至少约1小时、至少约4小时、至少约8小时或更长时间。
[0093]
本发明进一步提供了编码本发明的hbc多肽的核酸。本领域技术人员应当理解，由于遗传密码的简并性，可以制备出数量极多的核酸，所有这些核酸都编码本发明的hbc多肽。因此，在鉴定特定氨基酸序列后，本领域技术人员可以不改变氨基酸序列的方式简单地修饰一个或更多个密码子序列，以制备任意数量的不同核酸。
[0094]
使用本发明的编码hbc多肽的核酸，可以制备出多种表达构建体。所述表达构建体既可以是自我复制的染色体外载体，也可以是整合到宿主基因组中的载体。或者，就无细胞表达而言，所述构建体可以包括所需多肽转录和翻译所必需的元素，但可能不包括诸如复制起点、选择性标记等元素。无细胞构建体可以诸如通过pcr在体外复制，并且可以包含针对扩增反应而优化的末端序列。
[0095]
通常情况下，表达构建体包括与编码融合蛋白的核酸可操作地连接的转录和翻译调节核酸。术语“控制序列”是指在特定表达系统(例如，哺乳动物细胞、细菌细胞、无细胞合成等)中表达可操作地连接的编码序列所必需的dna序列。适用于原核生物系统的控制序列，例如，包括启动子、任选的操纵基因序列和核糖体结合位点。真核细胞系统可以利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
[0096]
当与另一核酸序列处于功能关系时，核酸被“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的dna表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其可操作地与多肽的dna连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其可操作地与编码序列连接；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译的启动，则其可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”是
指被连接的dna序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且处于阅读阶段。连接是通过连接反应或通过扩增反应完成的。合成的寡核苷酸适配子或连接子可用于根据常规实践连接序列。
[0097]
通常，所述转录和翻译调节序列可以包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。在一优选实施例中，所述调节序列包括启动子和转录起始和终止序列。
[0098]
启动子序列编码组成型或诱导型启动子。所述启动子可以是天然存在的启动子或杂合启动子。结合由超过一种启动子组成的元素的杂合启动子也为本领域所熟知，并且可用于本发明中。在一优选实施例中，所述启动子是强启动子，允许在体外表达系统中实现高表达，例如t7启动子。
[0099]
此外，所述表达构建体可以包含附加元素。例如，所述表达载体可以具有一个或两个复制系统，从而使其在生物体中得以维持，例如在哺乳动物或昆虫细胞中表达以及在原核宿主中克隆和扩增。此外，所述表达构建体可以含有选择性标记基因，以便选择转化的宿主细胞。选择基因为本领域所熟知，并随所用的宿主细胞的不同而变化。
[0100]
制剂和用途
[0101]
hbc多肽(包括由hbc组成的vlp；包含货物并且任选地包含一个或更多个缀合部分的vlp)可以在药学上可接受的赋形剂中提供，并且可以多种剂型提供。如本领域所熟知，药学上可接受的赋形剂是相对惰性的物质，其有助于药理学有效物质的施用。例如，赋形剂可促使具有一定形状或稠度，或充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于得到不同渗透压的盐、包封剂、缓冲液和皮肤渗透增强剂。适用于胃肠外和非胃肠外给药的赋形剂和制剂请见《雷氏药学大全》第19版，mack publishing(1995年)。
[0102]
通常情况下，这些组合物被配制用于注射或吸入给药，例如，腹膜内、静脉内、皮下、肌肉内给药等。因此，这些组合物优选地与药学上可接受的溶媒(例如盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液等)组合。特定给药方案(即剂量、给药时间和重复数)取决于特定个体以及该个体的病史。
[0103]
应当理解，本发明不限于所述的特定方法、方案、细胞系、动物物种或属、构建体以及试剂，因为在实际实施中可能会存在差异。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。
[0104]
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法、设备和材料可用于本发明的实施或测试中，但下文描述了首选的方法、设备和材料。
[0105]
为了描述和公开诸如在出版物中描述的并且可能与本发明结合使用的试剂、细胞、构建体和方法等，本文提及的所有出版物均以引用方式并入本文。上文以及整个文本中所讨论的出版物仅供在本专利的申请日之前披露。本文中无任何内容可以解释为承认由于之前的发明使得本发明无权早于此类公开。
[0106]
提出以下示例是为了向本领域普通技术人员完整地公开并叙述构建及使用本发明的方法，并且无意限制本发明的范围。已经努力确保所使用数字(例如数量、温度、浓度等)的准确性，但是应该允许存在一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份数，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，压力指大气压或接近大气压。
[0107]
实验
[0108]
示例1
[0109]
工程化乙型肝炎核心病毒样颗粒组装
[0110]
纯化乙型肝炎核心亚单位。从历史上讲，hepbc vlp是作为vlp而非作为未组装的单体或二聚体生产和纯化的。初始应用无需获取hepbc单体，而sec是在无细胞反应中自大多数其他蛋白中纯化出vlp的最简方法。在使用大肠杆菌或在我们实验室中使用无细胞蛋白合成(cfps)法表达hepbc后，将粗制混合物置于离子强度增加的缓冲液中透析，诱导hepbc vlp自组装。然后，采用单一sec步骤，基于vlp的大尺寸对其进行纯化。随后进行稳定化和表面附着，并再次采用sec步骤纯化最终产物。然而，这种方法有两个主要缺点。首先，它不允许纯化hepbc单体。为了负载我们所需的货物，我们需要从高纯度的hepbc亚单位开始操作。其他研究人员曾使用未纯化蛋白进行vlp组装，然后使其发生解组装反应来纯化亚单位，但该方法涉及到用刺激性化学品(尿素、胍等)处理vlp，并且可能会降低货物负载和重新组装后的产量和产品质量。第二个缺点是该方法还共同纯化了较大的大肠杆菌蛋白复合物。
[0111]
为了解决这些问题，我们在hepbc单体的c端引入了六组氨酸标签，以便采用ni
‑
nta固定金属亲和色谱分析(imac)法纯化未组装的hepbc单体。使用六组氨酸标签时，我们可以采用相对苛刻的咪唑洗涤方式去除cfps反应产物混合物中的大部分杂质，其中包括来自粗制大肠杆菌裂解液的其他蛋白。此外，一旦vlp与靶细胞结合并被内吞，则它必须逃离内体以传递其生物分子货物。若未能逃离并到达溶酶体，许多货物则会遭到破坏。先前已证实，多聚组氨酸序列可通过质子海绵效应允许进行内体逃逸。在cfps之后，新的生产工艺通过以下方式来取代透析和第一次sec步骤：执行缓冲液交换步骤以提高与ni
‑
nta树脂的结合；使用ni
‑
nta进行单体纯化；执行缓冲液交换步骤以去除用于从ni
‑
nta树脂中洗脱出蛋白的咪唑；以及执行浓缩步骤以达到vlp组装所需的临界浓度(约5μm)。
[0112]
尽管vlp sec纯化产生了预期的sec图谱，但我们还采用动态光散射(dls)和透射电子显微镜分析(tem)进行了验证，结果表明我们的新vlp是相同的。dls数据表明平均直径为36.91nm，多分散指数(pdi)低，这意味着颗粒尺寸均匀。晶体结构分析表明尺寸约为35nm，这与dls分析结果一致。tem图像还示出了预期大小的大部分均匀衣壳。
[0113]
我们接下来试图重新设计hepbc二聚体之间的结合界面，以减少vlp组装过程中的电场屏蔽。为了通过静电相互作用负载核酸等治疗性货物，我们希望将组装所需的离子强度从hp尖峰移植所需的1.5m nacl降低至0.5m nacl的野生型水平。这旨在确定补偿突变，以便在不改变尖峰区域的情况下以降低的离子强度进行组装。
[0114]
为了确定补偿突变，我们采用了基于合理设计的诱变策略。我们首先检索了文献，并使用robetta ala scan网络服务器来确定对于在vlp组装过程中两个二聚体聚集在一起时形成的“组装”界面上的结合而言至关重要的残基。而后，我们设计了三类突变：(1)用静电相互作用增强现有的疏水性相互作用，(2)用静电相互作用替代现有的疏水性相互作用，或(3)在原来无相互作用的地方施加新的静电相互作用。这些突变体是在低离子强度下产生并测试组装的。第132位的酪氨酸是对vlp组装而言最为重要的残基。y132a突变体无法组装。为了确定促进vlp组装的其他界面残基，我们使用了robetta ala scan网络服务器。该服务器首先根据接近度确定结合界面处的残基。接下来，它在计算机中将每个残基单独突
变为丙氨酸。通过计算δδg(复合物)，即复合物形成时吉布斯自由能(δδg)的变化量，我们可以确定原始残基重要与否。如果δδg(复合物)为正值，则意味着无此残基的新复合物不太适合组装(δg负值越大越适合)。因此，δδg(复合物)值越高，残基对结合的重要性就越大。毫无疑问，y132被确定为目前为止最为重要的残基。另外还确定了许多其他残基，主要是疏水性残基。
[0115]
使用不改变y132的单突变和双重突变生成基本原理设计突变文库。这些残基变化被引入到c端六组氨酸延伸的hepbc hp变体中。基于上述标准以及计算机pymol生成结构(基于dunbrack骨架依赖性aa rotamer文库)选择突变。候选项如表1所示。
[0116]
表1：残基变化评估
[0117][0118]
大多数变体并未通过我们的cfps系统蓄积可溶性蛋白，其余的大部分未组装。这些突变体很可能折叠成无法组装成vlp的替代结构。只有1种突变(a131k)取得成功，并且允许在盐浓度低至0.5m nacl的情况下进行组装(图1)。这种突变符合我们所有的标准。
[0119]
我们进一步研究了a131k突变，该突变在离子强度降低的情况下可以改善hepbc vlp组装。事实上，只有1种变体可以组装，更不用说成功地改变组装机制了，这一事实令人感到惊讶。我们使用rosetta remodel生成了计算机模拟模型。该模型表明，a131k可能同与y132相同的配偶体参与了两种不同的相互作用：(1)与d22产生盐桥，以及(2)与f23产生阳离子
‑
π相互作用。先前的研究表明，阳离子
‑
π相互作用可能比盐桥更强，特别是在暴露于溶剂而非埋在蛋白疏水核心中时。当y132的疏水性作用不足以启动自组装时，这些相互作用可能会在较低的离子强度下发生。一旦a131k被d22或f23吸引，y132也可与它们相互作用，增强这种相互作用并防止分离。
[0120]
a131k变体的组装动力学研究是在0.5m和1.5m nacl下进行的。相关结果表明，尽管a131k允许在较低离子强度下进行组装，但它无法达到在较高离子强度下组装时相同的组装程度(或速率)(图2)。
[0121]
最后，使用tem分析了a131k变体，结果表明突变的vlp在形态上与野生型vlp相似。如图所示，它们看起来相同(图3)。
[0122]
先前的研究表明，hepbc vlp序列极易发生突变。然而，目前的研究结果表明这不适用于组装界面。hepbc单体可被视为具有四个不同的结构域：(1)定义折叠的蛋白“核心”，(2)由螺旋在单体:单体界面产生的“尖峰”区域，(3)两个二聚体结合以开始自组装过程的
“
组装界面”，以及(4)野生型病毒中由富含精氨酸的重复结构组成以负载其病毒基因组的c端结构域。“尖峰”区域似乎对病毒家族同族内和同族外的突变具有一定容忍度。然而，经证实，“组装界面”本身对变化容忍度较低，尤其是在疏水性降低时。尽管hepbc似乎对其组装界面处的氨基酸变化高度敏感，但其中一个突变非常有益。第131位丙氨酸到赖氨酸的变化使得在1.5m nacl下的组装程度增加，且允许在低至0.5m nacl的离子强度下进行组装。
[0123]
材料与方法
[0124]
无细胞蛋白质合成反应。hepbc蛋白的表达反应采用如前所述的panox
‑
sp无细胞方案(voloshin&swartz，生物技术与生物工程，91，516
–
521(2005))。利用braun10l biostat c发酵罐中生长的a19met

、δtona、δtnaa、δspea、δenda、δsdaa、δsdab、δgsha大肠杆菌细胞(菌株kc6)制备细胞提取物。除此提取物外，还加入了蛋白合成所需的小分子试剂、纯化的t7rna聚合酶和目的质粒。使用qiagen maxiprep纯化试剂盒制备质粒，并采用异丙醇/乙醇洗涤步骤。除标准氨基酸外，我们还加入了5μm14c
‑
亮氨酸，以便通过测量结合的放射活性来量化合成的蛋白。反应在多个规格下进行：50μl，置于2ml eppendorf管中；600μl，置于有盖的6孔组织培养板中；或者6ml，置于有盖的10cm皮氏培养皿中。将反应物置于20
‑
30℃下孵育不同时间。采用液体闪烁计数法测量结合的放射活性，以确定蛋白浓度。直接测量总蛋白样本，并在以10k xg离心15分钟去除不溶物后测量可溶性蛋白样本。这两种样本都用5％三氯乙酸在whatman滤纸上沉淀，然后用5％三氯乙酸洗涤三次，去除未结合的14c
‑
亮氨酸。
[0125]
原始vlp纯化方法。通过如上所述的标准无细胞蛋白合成反应表达hepbc蛋白。初始纯化策略是在50mm tris(ph 7.4，含0.5
‑
1.5m nacl)中透析反应物4小时，然后再透析16小时，以在无细胞蛋白合成反应中诱导vlp组装。将200μl样本加入2.2ml sepharose 6 fast flow尺寸排阻色谱柱并用组装缓冲液洗脱，然后对组装的vlp进行定量分析和纯化。收集了二十四个150μl组分。采用液体闪烁计数法测量放射活性，以确定每个组分中的hepbc浓度。收集第一峰(通常在组分5和10之间)作为vlp峰。随后使用20
‑
50mm二酰胺氧化这些vlp，以形成稳定的二硫键。然后，在50mm tris(ph 7.4)中透析样本4小时，而后再次透析16小时来去除二酰胺。
[0126]
改进的vlp纯化方法。通过如上所述的标准无细胞蛋白合成反应表达hepbc蛋白。改进的纯化策略首先使用sephadex g25色谱柱将样本交换到含50mm tris、25mm咪唑、0.1％tween
‑
20的ph 7.4缓冲溶液中。以10k x g离心15分钟去除不溶物后，将可溶组分上样至ni
‑
nta色谱柱。上样后，用4倍柱体积(cv)的含50mm tris、25mm咪唑、0.1％tween
‑
20的ph 7.4溶液洗涤ni
‑
nta色谱柱，然后用含50mm tris、250mm咪唑、0.1％tween
‑
20的ph 7.4溶液(共5cv)洗脱。接着，将含hepbc蛋白的组分加入含有sephadex g25树脂(2.5ml样本上样至8.3ml树脂)的sec柱中，去除咪唑，并将它们交换到含50mm tris、0.1％tween
‑
20的ph 7.4溶液中。使用millipore 3kda分子量截留过滤器，采用搅拌式细胞浓缩器或基于超滤的离心浓缩器浓缩样本。加入含50mm tris、5m nacl、0.1％tween
‑
20的ph 7.4储备溶液，在0.5
‑
1.5m nacl下诱导vlp组装。将200μl样本加入2.2mlsepharose 6 fast flow尺寸排阻色谱树脂中，洗脱24个150μl组分，对组装的vlp进行定量分析和纯化。采用液体闪烁计数法测量放射活性，以确定每个组分中的蛋白浓度。收集第一峰(通常在组分5和10之间)作为vlp峰。随后使用20
‑
50mm二酰胺氧化这些vlp。然后，使用sephadex g25树脂将样本交换到
含50mm tris、0.1％tween
‑
20的ph 7.4溶液中，以去除二酰胺。
[0127]
采用动态光散射和透射电子显微镜分析进一步分析vlp。如上所述纯化vlp后，采用动态光散射和透射电子显微镜分析来验证vlp实际上具有适当直径的完整衣壳。使用malvern zetasizer zs仪器测定粒度分布。对于粒度，将50μl样本放入超微量比色皿(窗口高度8.5mm，brandtech)中，并采用动态光散射法分析平均粒径。使用zetasizer软件v6.12分析数据。对于颗粒形态，将5μl样本涂布于300目formvar/碳包被的铜网各(electron microscopy sciences)上并用1％乙酸双氧铀负染色。tem图像使用配备gatanorius ccd摄像头的jeol jem
‑
1400 120kv电子显微镜获取。
[0128]
组装诱变研究。用于改变vlp组装的hepbc突变文库分为两部分。第一部分含有加入了新静电对(精氨酸/赖氨酸加天冬氨酸/谷氨酸)的单突变体和双突变体。这种方法试图降低组装所需的离子强度而避免彻底改变组装机制，预计基于疏水性进行。在加入新静电对之前，第二部分使界面无疏水性。这种方法试图彻底改变组装机制以减少其对疏水性的依赖，从而降低组装所需的离子强度。第二部分中的所有突变体都含有y132a突变。所有变体均通过quikchange诱变以及来自idt的引子产生(liu&naismith，bmc生物技术，8，91(2008))。这些序列由sequetech通过dna测序加以验证。
[0129]
组装动力学研究。为了确定vlp组装的动力学特征，在一系列时间点增加离子强度后立即分析vlp的组装情况。如上所述确定组装情况。简而言之，将200μl样本加入预平衡的2.2ml sepharose 6 fast flow尺寸排阻色谱柱中，在含50mm tris、0.5或1.5m nacl、0.1％tween
‑
20的溶液(ph 7.4)中收集24个150μl组分。采用液体闪烁计数法测量放射活性，以确定每个组分中的hepbc浓度。将第一峰(通常在组分5和10之间)确定为vlp峰。虽然使用色谱法确定动力学特征的方式并非理想方式，因为样本通过树脂需要一些时间，但用于动力学计算的平均时间是与vlp相关的峰组分的洗脱时间，这可以最大限度地减少偏差。
[0130]
示例2
[0131]
负载和保留分子量相对较小的货物
[0132]
100多年前便设想过将对复杂生物体内的预期细胞具有特异性的活性分子进行靶向递送，但尚未取得有效成果。例如，抗癌药物的高效靶向递送或有可能提高肿瘤部位的药物疗效，减少副作用。为此，已深入研究并研发了抗体
‑
药物偶联物(adc)。然而，这些偶联物受到一些限制，包括结构异质性、不稳定性、毒性和有限的溶解度。相比之下，基于纳米颗粒(np)的递送剂(包括脂质体、聚合物基np、金属基np和蛋白基np)或有可能通过将抗癌药物封装于颗粒内来实现更安全、更有效的递送，且货物/载体比率更高。
[0133]
在不同类型的np中，工程化乙型肝炎核心(hepbc)病毒样颗粒(vlp)表现出理想特性。然而，为了用于递送诸如抗癌药物的药剂，vlp必须负载许多(优选数百个)药剂分子。此外，在vlp进入靶细胞之前，分子必须保留在vlp内。本示例描述了满足这些需求的经修饰的vlp和方法。
[0134]
wynne等人(分子细胞，3，771(1999))描述了hepbc衣壳(vlp)的结构，表明hepbc单体的c端区域包含vlp的内表面。其进一步表明，衣壳外壳具有多个不同大小的孔，最大孔尺寸约为
[0135]
在此研究中，在c端引入了一个货物负载域，它定义了组装后的vlp的内表面，以扩展hepbc vlp负载和保留小分子的能力。第一负载域旨在利用疏水性和静电引力负载抗癌
药物，例如多柔比星。图4示出了具有疏水性和带正电荷特性的多柔比星的分子构象。为了促进有效的vlp设计和负载方案的开发，使用了荧光替代物罗丹明123，因为它也可提供疏水性和带正电荷特性，同时能够方便地测量负载效率。图5顶部示出的hepbc c端负载域旨在为此类货物的吸附提供疏水和离子配对引力。苯基丙氨酸残基的加入提供了对药物环状结构的π堆积疏水引力，带负电荷的谷氨酸残基提供了对药物带正电荷的胺基的离子配对引力。甘氨酸残基位于这些氨基酸之间，因此疏水性侧链和带负电荷的侧链面向同一方向，以便与药物产生更好地相互作用。
[0136]
经证实，若在六组氨酸纯化标签后添加这种新的寡肽，便可在cfps期间进行hepbc亚单位折叠，也可进行vlp组装。在此hepbc亚单位衍生物通过ni
‑
nta色谱法纯化后，将亚单位制剂与罗丹明123混合，然后加入浓缩的nacl溶液以增加离子强度，从而刺激组装。图5中的色谱图表明，罗丹明123的存在不会阻碍vlp组装。此外，加入的罗丹明123中有很大一部分与vlp相结合，每个vlp约有1000个分子。然而，图6表明负载的货物在洗涤步骤中丢失，以去除任何可能松散吸附于vlp外表面的罗丹明123。如前所述，vlp外壳具有尺寸至多为的孔，如图4所示，罗丹明123分子的最小尺寸约为该分析表明，负载的荧光团通过孔漏出。
[0137]
为了解决此渗漏问题，重新设计了负载域，补充了疏水引力，通过共价键合进行负载以实现保留。优选二硫键键合，因为它在产物纯化、配制、储存和施用过程中提供优异的稳定性；但它会在靶向细胞内部的还原环境中解离以释放货物。这种新蛋白设计如图7所示。美登素被选定为典型抗癌药物，因为它包括可以形成二硫键的巯基基团。由于具有很强的细胞毒性，美登素是adc最常用的微管蛋白聚合抑制剂之一，也用于临床批准的adc kadcyla。另外，将荧光模拟用于vlp开发中，以便对经修饰的hepbc亚单位以及同步负载和组装方案进行测试。美登素和荧光模拟物(bodipy fl
‑
半胱氨酸(bdfl))的分子结构如图8所示。
[0138]
图9示出了这些新c端负载域的另一必要特性。除了避免干扰亚单位蛋白折叠和vlp组装外，还必须选择c端延伸以确保分子稳定性。在cfps反应中加入14c
‑
亮氨酸，可使得在hepbc亚单位产生过程中蓄积的hepbc蛋白产物可视化。放射自显影图表明，令人惊讶的是，六组氨酸纯化标签n端到负载域的c端延伸不稳定，这可能是由于蛋白水解裂解所致。然而，在相反顺序下，只允许蓄积所需的完整hepbc衍生物。由于吸附性货物负载现在仅由疏水引力介导，因此测试了更高离子强度下(以增加c端负载域与疏水性货物之间的引力)的vlp组装。图10表明使用2.5m nacl而非1.5m nacl可以实现更好的vlp组装。
[0139]
使用图8顶部显示的新设计的负载域时，经过多次洗涤后，每个vlp负载并保留了约450个bdfl分子，具体如图11所示。首先将bdfl和纯化的hepbc亚单位混合在一起，然后加入浓缩的nacl溶液触发组装。接下来，用10mm二酰胺(一种温和的氧化剂)孵育，形成二硫键，以稳定组装的vlp并使货物束缚于负载域。然后，使用sec缓冲液交换步骤去除二酰胺以及未负载和未束缚的货物。
[0140]
初次尝试负载美登素时遇到了严重问题。增加离子强度以触发vlp组装会导致美登素快速沉淀，对在vlp内大量负载美登素造成了阻碍。令人惊讶的是，即使组装溶液中包括10％和15％的溶剂二甲基甲酰胺(dmf)，仍能实现有效vlp组装(图12)。在15％的二甲亚砜(dmso)(一种药学上可接受的溶剂)中也是如此。通过添加2.5m nacl以增加离子强度来
触发vlp组装时，两种溶剂都能避免美登素沉淀。使用sec色谱法洗涤负载的vlp。在还原二硫键、用2％sds解组装vlp并使用hplc测量释放的美登素后，确定负载的美登素的量>300个分子/个vlp。
[0141]
示例3
[0142]
在乙型肝炎核心病毒样颗粒内负载大分子货物
[0143]
本示例中描述的工作涉及：(1)将大分子货物负载并保留在vlp中；以及(2)特异性细胞靶向。对于前者，示例将展示核酸和蛋白的负载。对于后者，表面经修饰的vlp将靶向前列腺癌(pca)细胞表面的前列腺特异性膜抗原(psma)。
[0144]
使用在无细胞蛋白合成(cfps)过程中可以轻松有效地掺入的非天然氨基酸(nnaa)，通过“点击”反应将其他功能添加到hepbc vlp的表面，包括使用单链抗体片段(scfvs)或dna适配子实现的特异性细胞靶向。
[0145]
此外，还解决了小核酸的货物保留问题。组装的vlp结构为多孔结构，含有孔最大尺寸可达21埃的开口。这些孔形成于t＝4二十面体结构中的3折、5折和6折对称点。小核酸(例如sirna)可通过这些孔逃逸。
[0146]
sirna在负载后使用二硫键与vlp缀合，以提供可靠的保留，同时允许在靶向细胞内释放。正如稳定vlp外壳的二硫键一般，保留货物的二硫键将遭到胞质溶胶中的还原条件破坏，使货物仅在靶向细胞中释放。除hepbc c端结构域上的货物负载域(对于sirna，含有带正电荷的氨基酸)外，我们还加入了含有游离巯基的半胱氨酸。二酰胺是一种温和的氧化剂，用于在负载货物后将负载的sirna(经修饰以包括游离巯基)缀合到vlp内表面。
[0147]
如示例2所示，已使用含有游离巯基的小分子染料bodipy fl
‑
半胱氨酸(bdfl)证明了负载和保留机制。尺寸排阻色谱(sec)结果表明，经过多次洗涤步骤(先前提取所有负载的货物)后，vlp保留了荧光bdfl。这种方法现扩展到核酸货物。
[0148]
除了通过离子配对相互作用负载sirna外，我们还通过向sirna(一种胆固醇分子)添加疏水“钩”来证明可通过疏水相互作用负载sirna。为了负载此sirna构建体，我们使用了含有疏水性氨基酸的货物负载域(c端hepbc延伸)。除sirna外，这些负载方法还可以扩展到质粒dna、mrna和蛋白(包括但不限于crispr cas9)。所有这些货物都较大，其不应通过孔逃离vlp。对于质粒dna和mrna，离子配对货物负载域可能更具吸引力，因为它们带大量负电荷。对于蛋白，可以使用离子配对货物负载域或疏水性货物负载域，靶向蛋白的表面特性或经工程化附于蛋白上的c或n端延伸。crispr cas9可能允许采用独特的负载机制，因为它实际上是由蛋白及其导向rna组成的复合物。因此，我们可以使用与crispr cas9复合的靶向导向rna的带电荷的货物负载域。为了方便评估负载，此处使用绿色荧光蛋白(gfp)演示了蛋白负载。
[0149]
结果
[0150]
下面描述了具有改变的c端结构域、用以负载多种大分子货物(例如sirna)的hepbc变体的设计和纯化。为方便起见，我们使用匹配相同序列(用胸苷代替尿嘧啶)并与荧光探针6
‑
羧基荧光素(6fam)缀合以方便检测的单链dna(ssdna)构建体模拟sirna。
[0151]
纯化具有货物负载域的乙型肝炎核心变体。hepbc亚单位纯化方案请参阅示例1。此外，除了不同的c端货物负载域外，我们还使用了hepbc外壳的两种变体。一种利用a131k突变以允许在0.5m nacl或更低强度下进行vlp组装，其可用于在较低离子强度下通过离子
配对引力负载货物。另一种不使用这种突变，其用于在高离子强度(例如2.5m nacl)下通过疏水机制负载货物。
[0152]
不同vlp突变及其影响的总结如下：
[0153]
hp突变是各hepbc单体中的一系列18个氨基酸变化，这些变化被引入单体二聚化时形成的“尖峰”区域；这种修饰极大地改善了带负电荷的配体的“点击”反应。它还降低了hepbc vlp的免疫原性和抗原性。但是，它会产生将组装所需的离子强度从0.5m增加到1.5m nacl的不良影响。
[0154]
a131k是组装界面中的突变，这种突变会使hp变体组装所需的离子强度降低至0.5m nacl的野生型水平(示例1)。
[0155]
ss1和ss8是两种不同的“ss”系列突变，每种突变都在vlp二聚体之间添加了额外的240个二硫键，用以实现vlp外壳的有条件稳定化。这些键将被胞质溶胶的还原条件还原。
[0156]
80m是指突变为甲硫氨酸(atg密码子)的位置，以便通过甲硫氨酸置换引入甲硫氨酸类似物nnaa。
[0157]
2asvins在起始甲酰
‑
甲硫氨酸之后插入3个氨基酸(asv)，以便通过甲硫氨酰氨肽酶(由用于cfps的细胞提取物提供)去除翻译起始非天然甲硫氨酸类似物。这种修饰避免了与hepbc蛋白n端发生表面缀合，否则，除了在表面尖峰尖端的所需残基处发生缀合之外，还会发生这种表面缀合。
[0158]
6h是指用于纯化以及通过质子海绵效应进行内体逃逸的c端六组氨酸标签。
[0159]
表2总结了数种不同的负载大分子货物的设计。延伸是指hepbc蛋白的c端延伸。货物是指负载到vlp中的实体，包括为便于负载和保留而进行的修饰。提供巯基基团的实体以橙色显示，带正电荷的实体以红色显示，疏水性实体以绿色显示。第一列表示用于相应延伸/货物对的hepbc变体。图14采用相同的配色方案，并为多种大分子货物提供负载域特征和负载机制。
[0160]
表2
[0161]
不同的hepbc vlp变体及其各自的货物
[0162][0163][0164]
从cfps产品混合物中纯化出hepbc变体偶尔会受到过早vlp组装的阻碍，这导致无法得到六组氨酸纯化标签。向cfps反应物(4mm还原型谷胱甘肽(gsh))中加入还原剂并降低
离子强度(包括50mm kglutamate而非标准175mm浓度)，改善亚单位纯化和随后的货物负载。在一些情况下，使用无ss1和ss8突变的a131k变体。有关用于组装每个变体的nacl浓度以及vlp组装程度，请见表3。
[0165]
表3
[0166]
代表性hepbc衍生物的组装条件和结果。
[0167][0168]
用于组装具有不同货物负载延伸及其vlp组装程度的hepbc变体的nacl浓度。组装百分比以重复实验的平均值
±
标准差(n＝3)表示。
[0169]
负载核酸。本示例描述了使用两种不同的吸附原理(离子配对和疏水引力)负载核酸的情况。如上所述，ssdna用于模拟sirna，并使用两种不同的ssdna构建体：用于离子配对介导的负载的sh
‑
ssdna
‑
6fam，用于疏水性介导的负载的sh
‑
ssdna
‑
6fam
‑
chol。这些在图15中用图解法表示。sh是指在三碳链或六碳链之后附接于ssdna的游离巯基；6fam是指6
‑
羧基荧光素，一种与ssdna缀合以方便检测的荧光素衍生物和荧光探针；chol是指具有用于提供疏水性负载“钩”的三甘醇(teg)间隔基的胆固醇。22nt ssdna序列的实际序列模拟了针对雄激素受体的已知抗pca sirna。游离巯基修饰允许在负载后有条件地缀合到vlp内表面，以防止通过vlp孔逃逸。荧光修饰仅用于在负载过程中进行跟踪，最终的sirna治疗中不存在相关递送。两种构建体的不同之处在于是否存在胆固醇
‑
teg疏水性负载“钩”。
[0170]
通过以下方式进行货物负载：将所需的货物添加到纯化的hepbc亚单位中，使混合物在平衡状态下缔合，并通过将离子强度增加到0.5m(通过离子配对相互作用进行负载，在这种情况下，负载sh
‑
ssdna
‑
6fam)或增加到2.5m nacl(通过疏水性相互作用进行负载，在这种情况下，负载sh
‑
ssdna
‑
6fam
‑
chol)诱导同步货物负载和vlp组装。体积排阻色谱(sec)法用于将vlp与未组装的亚单位以及未负载的dna分离。分析每个组分的放射活性以确定hepbc蛋白的存在，并分析荧光以确定ssdna货物的存在。在1
‑
2μg/ml dna时，可以观察到与vlp峰相关的荧光显著增加。在0.5m nacl下负载两种不同的a131k hepbc变体(含有cys或cys
‑
arg
‑
cys货物负载/保留域)(图16和17)。sh
‑
ssdna
‑
6fam
‑
chol在2.5m nacl下被负载到含有(ile
‑
gly)2
‑
ile
‑
cys货物负载/保留域但缺乏a131k突变的hepbc变体中。虽然组装这种vlp只需要1.5m nacl，但增加离子强度可增加货物负载的驱动力(图18)。
[0171]
鉴于上述sec结果中未负载的ssdna与负载的ssdna结果相近，我们采用了额外的方法来验证vlp是否负载了ssdna。首先，使用天然琼脂糖凝胶(不含溴化乙锭、尿素、sds或任何负载染料)将vlp中负载的ssdna与未负载的ssdna分开，并使用通用电气(ge)typhoon平板荧光扫描仪(因为ssdna构建体是荧光)使其可视化。如图19所示，与游离ssdna相比，vlp内的ssdna显著增加。此外，还原后，ssdna从组装的vlp中释放出来，并与游离ssdna的电泳迁移率相匹配，这表明货物的基于二硫键的缀合是有必要的。此外，我们“洗涤”了样本以去除未负载的ssdna，并验证了ssdna是否已负载并保留。首先，将样本稀释15倍，然后使用50kda分子量截留(mwco)超离心过滤器(vlp分子量为4.3mda，ssdna分子量为8kda)浓缩(保留vlp，但去除未负载的ssdna)。
[0172]
在“洗涤”步骤之前和之后，针对sec数据的每个部分计算了每个单独vlp负载的ssdna分子(图20)。使用sh
‑
ssdna
‑
6fam时，获得hepbc hp a131k 6h
–
crc vlp的最高负载(每个vlp约10个)，但基于疏水性的负载结果相似(每个vlp约6个)。hp a131k 6h
–
c的无源装载显著降低(每个vlp约2个)，这表明货物负载域设计是有益的。这些值高于目前公布的任何在hepbc vlp中负载sirna的结果(公布的最高值是4sirna/vlp)。
[0173]
负载蛋白。为了证明vlp内的蛋白负载，我们使用超级文件夹gfp(sfgfp)以方便检测负载和添加的c端多肽延伸，展示赖氨酸和苯基丙氨酸，以提供对hepbc蛋白上igigic c端延伸的疏水引力。
[0174]
将sfgfp
‑
kf或sfgfp
‑
kfkf加入纯化的hepbc hp 2asvins ss1 ss8 80m 6h
–
igigic亚单位中，并由2.5m nacl触发组装。sec用于从未组装的hepbc亚单位和未负载的蛋白中分离出vlp。分析每个组分的放射活性以确定hepbc蛋白的浓度，并分析荧光以确定sfgfp
‑
kf或sfgfp
‑
kfkf货物的量。负载结果汇总请见图21。
[0175]
特异性细胞靶向和货物递送。为实现特异性靶向，如前所述，使用“点击”反应在vlp表面展示抗psma dna适配子。抗psma dna适配子如前所述(boyacioglu等人，分子治疗
‑
核酸2，e107(2013))。此处使用的构建体仅含有用炔基延伸以与vlp(展示叠氮基高丙氨酸，aha)缀合的单个适配子结构域。使用先前制定的通过“点击”反应将配子连接到vlp的方法，我们可以针对每个vlp展示最多15个适配子拷贝(图22)。
[0176]
为了证明展示该适配子的vlp能够特异性结合pca(前列腺癌)细胞，我们采用了使用lncap(psma )细胞和pc
‑
3(pmsa
‑
)细胞进行的细胞结合测定法。将细胞从其培养板中分离、洗涤并重悬于含1％牛血清白蛋白(bsa)的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。向细胞中加入不同浓度的展示抗psma dna适配子的放射性vlp，并将其置于4℃下孵育3小时。孵育后，沉淀细胞，并基于放射活性对上清液进行取样，以了解剩余的vlp。计算与细胞相关的vlp的浓度，估计结合亲和力。具体而言，vlp对lncap(psma )细胞展示出较强的亲和力(kd＝4.6nm)，类似于几种抗psma抗体的亲和力(kd＝1.8、11、18nm)，而pc
‑
3(psma
‑
)细胞结合力可忽略不计。此外，通过分析渐近线，lncap细胞的结合能力确定为约400
‑
500万个vlp，与psma/细胞的数量级相同，这表明结合能力处于最高水平。
[0177]
然后，使用cytoflex流式细胞仪分析细胞靶向特异性。首先，在37℃下，将负载有荧光bdfl的vlp(有或无附接的适配子)加入贴壁的lncap或pc
‑
3细胞中。将培养物孵育4或20小时，随后分离并用含10％胎牛血清(fbs)的pbs洗涤。然后，用流式细胞仪分析细胞，针对每个样本确定与每个活细胞相关的荧光。结果如图23所示。尽管在缺乏适配子的vlp和pc
‑
3细胞中观察到了一些非特异性的结合，但展示适配子的vlp与psma lncap细胞的结合率明显更高。
[0178]
此外，还使用nikon ti
‑
e倒置落射荧光显微镜分析了细胞靶向特异性，方法是在37℃下，将负载有荧光bdfl的vlp(有或无适配子)加入贴壁的lncap或pc
‑
3细胞中。在移除培养基并用含0.01％tween
‑
20的pbs洗涤之前，允许将培养物孵育4小时。然后，对活培养物进行成像。相关结果与流式细胞术结果一致，因为在pc
‑
3细胞中观察到了一些非特异性结合，但在lncap细胞中观察到的结合率更高。
[0179]
nikon ti
‑
e倒置落射荧光显微镜。在37℃下，将负载有荧光bdfl的vlp(有或无适配子)加入贴壁的lncap或pc
‑
3细胞中，以进行更为严格的测定。在移除培养基之前，再次将
培养物孵育4小时。但是，这一次用含500mm nacl的0.5％乙酸洗涤细胞。这种方法以前曾用于去除表面结合蛋白，以帮助确定治疗剂是否被内吞。然后使用落射荧光显微镜对活培养物进行成像。相关结果表明，受体介导的内化仅发生在展示适配子和lncap细胞的vlp中。无适配子的pc
‑
3细胞和vlp的内化量可忽略不计。
[0180]
本文所述的工作探究了vlp外壳的外表面和内表面变化的影响。外表面通过在hepbc蛋白第80位掺入aha并使用“点击”化学来修饰，以展示抗psma dna适配子。内表面通过使c端结构域发生突变进行修饰，以便负载不同的货物。结合对所有三层的修饰，将这种新型纳米颗粒用作针对多种疾病的高效、靶向治疗方案。
[0181]
尽管pca被用作典型疾病靶标，但该平台可用于制定多种疾病的治疗方案。通过将溶媒的功能分成三个不同的层，我们可以分别修饰vlp以改变疾病靶标、治疗性货物或组装要求。如此处所示，基于适配子的靶向可能颇为有效，但该系统也可以轻松使用基于蛋白的靶向剂，例如抗体片段或scfv。
[0182]
货物负载工作侧重于负载不同类型的货物(蛋白和核酸)以及使用不同的负载机制(离子配对引力或基于疏水性的方法)。结果表明，负载新治疗药物的可行性基于其表面特征或简单负载标签的影响确定。基于二硫键的保留机制的发展也将扩大可负载的货物的尺寸范围。
[0183]
这项工作可扩展至许多治疗性货物，例如从sirna扩展至沉默基因(例如阻抑素1、雄激素受体、egfr和生存素)以及蛋白(例如诱导细胞凋亡的颗粒酶b)。
[0184]
材料与方法
[0185]
vlp诱变研究。本研究中用于负载的多种hepbc和gfp变体是通过quikchange诱变和来自idt的引子产生的。这些序列由sequetech通过dna测序加以验证。
[0186]
无细胞蛋白合成反应。hepbc蛋白的初始表达反应按照如前所述的panox
‑
sp无细胞方案进行。利用braun 10l biostat c发酵罐中生长的a19met

、δtona、δtnaa、δspea、δenda、δsdaa、δsdab、δgsha大肠杆菌细胞(菌株kc6)制备细胞提取物。除此提取物外，还加入了蛋白合成所需的小分子试剂、纯化的t7rna聚合酶和目的质粒。使用qiagen maxiprep纯化试剂盒制备质粒，并采用异丙醇/乙醇洗涤步骤。除标准氨基酸外，我们还加入了5μm 14c
‑
亮氨酸，以便通过测量结合的放射活性来量化合成的蛋白。panox
‑
sp反应在多个规格下进行：50μl，置于2mleppendorf管中；600μl，置于密封的6孔组织培养板中；或者6ml，置于密封的10cm皮氏培养皿中。将反应物置于20
‑
30℃下孵育不同时间。采用液体闪烁计数法测量结合的放射活性，以确定蛋白浓度。直接测量总产物样本，并在以10k xg离心15分钟去除不溶物后测量可溶性产物样本。这两种样本都用5％三氯乙酸(tca)在whatman滤纸上沉淀，然后用5％tca洗涤三次，去除未结合的14c
‑
亮氨酸。在一些情况下，正常175mm kglutamate浓度降低到50mm，以便在较低离子强度下合成蛋白，避免出现过早的hepbc亚单位结合。
[0187]
vlp纯化方法。通过如上所述的标准无细胞蛋白合成反应表达hepbc蛋白。以10k xg离心15分钟去除不溶物。改进的纯化策略首先使用sephadex g25树脂将样本交换到含50mm tris、25mm咪唑、0.1％tween
‑
20的ph 7.4溶液中，然后将可溶组分上样到ni
‑
nta树脂上。上样到ni
‑
nta色谱柱后，用4倍柱体积(cv)的含50mm tris、25mm咪唑、0.1％tween
‑
20的ph 7.4溶液洗涤样本，然后用含50mm tris、250mm咪唑、0.1％tween
‑
20的ph 7.4溶液(共
5cv)洗脱。接着，将含有hepbc蛋白亚单位的洗脱组分再次加入sephadex g25树脂(2.5ml样本上样至8.3ml树脂)中，去除咪唑，并将它们交换到含50mm tris、0.1％tween
‑
20的ph 7.4溶液中。使用millipore 3kda分子量截留过滤器，采用搅拌式细胞浓缩器或基于超滤的离心浓缩器浓缩样本。直接加入0.5
‑
2.5m nacl(源自含50mm tris、5m nacl、0.1％tween
‑
20的ph 7.4储备溶液)，诱导vlp组装。将200μl样本加入2.2mlsepharose 6 fast flow尺寸排阻色谱柱中，加入组装缓冲液，收集24个150μl组分，对组装的vlp进行定量分析和纯化。采用液体闪烁计数法测量放射活性，以确定每个组分中的蛋白浓度。收集第一峰(通常在组分5和10之间)作为vlp峰。随后使用20
‑
50mm二酰胺氧化这些vlp，以形成稳定的二硫键。然后，使用sephadex g25树脂将样本交换到含50mm tris、0.1％tween
‑
20的ph 7.4溶液中，以去除二酰胺。
[0188]
经修饰的vlp表达方法以减少过早组装。进行了两项主要变更以减少过早的vlp组装。首先，将谷氨酸钾从175mm减少到50mm，将无细胞蛋白合成反应改成含有较低的离子强度(90mm而非215mm)。第二项变更是在无细胞蛋白合成反应中添加4mm还原型谷胱甘肽，防止二硫键形成。
[0189]
过早vlp组装的sds
‑
page和放射自显影分析。通过十二烷基硫酸钠
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)和放射自显影分析蛋白大小。nupagenovex预制凝胶和试剂购自invitrogen(加州卡尔斯巴德)。样本在上样缓冲液(1x lds上样缓冲液和50mm二硫苏糖醇)中于90℃下变性10分钟。将样本上样到10％(w/v)bis
‑
tris预制凝胶(具有用于mark 12分子量蛋白标准的单独泳道)上，并在mes/sds电泳缓冲液中进行电泳。根据制造商的建议，使用simplyblue safestain对凝胶进行染色和固定。在暴露于储存磷光质屏(molecular dynamics)之前，使用583型凝胶干燥器(bio
‑
rad，加州里士满)干燥凝胶，随后使用typhoon扫描仪(ge healthcare)对其进行扫描。
[0190]
在vlp内负载货物。在加入nacl诱导自组装之前，hepbc单体与所需的货物在室温下孵育30分钟。hepbc单体为10
‑
50μm，货物以20
‑
500μm添加。如上所述，加入0.5
‑
2.5m nacl诱导自组装之后，首先，将200μl样本加入2.2mlsepharose 6 fast flow尺寸排阻色谱树脂中，并用组装缓冲液洗脱24个150μl组分，以确定负载量。采用液体闪烁计数法测量放射活性，以确定每个组分中的hepbc浓度。采用96孔荧光计测量荧光，以确定每个组分中的货物浓度。收集第一峰(通常在组分5和10之间)作为vlp峰并量化，以便确定负载量。
[0191]
还使用天然琼脂糖凝胶电泳分析ssdna负载样本。将15μl各样本上样至tbe缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上。对凝胶施加100v，持续45分钟，然后使用typhoon扫描仪(ge healthcare)对凝胶进行荧光成像。另外，将样本稀释15倍，并使用超滤膜浓缩回1倍浓度。使用50kda分子量截留(mwco)超离心过滤器去除未负载的ssdna(vlp分子量为4.3mda，ssdna分子量为8kda)。然后，使用液体闪烁计数分析样本的放射活性，并使用荧光计分析样本荧光，以量化负载。
[0192]
通过“点击”反应实现表面功能化。通过铜(i)催化的环加成反应(也称为“点击”反应)将dna适配子缀合到其表面，从而修饰纯化和氧化的vlp的表面。将40
‑
85nm hepbc vlp与10
‑
100μm配体、0.5mm三(三唑基甲基)胺、0.01％tween
‑
20和2mm四铜(i)在50mm磷酸盐缓冲液(ph 8)中混合，并使其在厌氧环境下反应4
‑
16小时。如上所述，使用sepharose 6 fast flow尺寸排阻色谱树脂去除铜(i)和未缀合的配体，以纯化vlp。缀合程度由十二烷基硫酸
钠
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)和放射自显影法(数据未示出)确定。nupagenovex预制凝胶和试剂购自invitrogen (加州卡尔斯巴德)。样本在上样缓冲液(1x lds上样缓冲液和50mm二硫苏糖醇)中于90℃下变性10分钟。将样本上样到10％(w/v)bis
‑
tris预制凝胶(具有用于mark 12分子量蛋白标准的单独泳道)上，并在mes/sds电泳缓冲液中进行电泳。根据制造商的建议，使用simplyblue safestain对凝胶进行染色和固定。在暴露于储存磷光质屏(molecular dynamics)之前，使用583型凝胶干燥器(bio
‑
rad，加州里士满)干燥凝胶，随后使用typhoon扫描仪(ge healthcare)对其进行扫描。
[0193]
细胞
‑
培养。将前列腺癌细胞系(lncap和pc
‑
3)在含10％fbs(alstem)、1％青霉素(life technologies)和1％链霉素(life technologies)的dmem(life technologies)中培养。将细胞置于37℃和5％co2下使其生长。根据实验的不同，将细胞接种在96孔板或6孔板中，并在使用前生长两天。
[0194]
放射性配体细胞结合测定。在与vlp一同孵育前两天，将细胞接种在6孔板中。将lncap细胞以每孔300,000个细胞的密度接种，将pc
‑
3细胞以每孔125,000个细胞的密度接种。吸取培养基，于37℃下在pbs中与0.5mm edta一起孵育10分钟，以分离细胞。将细胞转移到eppendorf管中，沉淀并用含1％bsa的pbs洗涤两次。然后，将含有100,000个细胞的样本与0至100nm展示抗psmadna适配子(15个适配子/vlp)的vlp一起孵育。允许细胞在4℃下孵育3小时，以减少内化。然后，沉淀细胞，并吸取上清液。采用液体闪烁计数法测量放射活性，以确定上清液中的vlp浓度。
[0195]
流式细胞术。在与vlp一同孵育前两天，将细胞接种在6孔板中。将lncap细胞以每孔300,000个细胞的密度接种，将pc
‑
3细胞以每孔125,000个细胞的密度接种。两天后，将展示抗psma dna适配子(15个适配子/vlp)的vlp以9nm加入每个孔中，并在37℃下孵育4小时。孵育后，吸取培养基，于37℃下在pbs中与0.5mm edta一起孵育10分钟，以分离细胞。将细胞转移到eppendorf管中，沉淀并用含10％fbs的pbs洗涤两次。将细胞重悬于含10％fbs的200μl pbs中，并通过0.35微米过滤器转移到管中。然后，使用中等流速的cytoflex流式细胞仪分析样本，每个样本计数超过4000个活细胞。使用flowjo分析数据。
[0196]
荧光显微镜分析。在与vlp一起孵育前两天，将lncap细胞以每孔10,000个细胞的密度接种，将pc
‑
3细胞以每孔3,000个细胞的密度接种。两天后，将展示抗psma dna适配子(15个适配子/vlp)的vlp以9nm加入每个孔中，并在37℃下孵育4小时。孵育后，吸取培养基，并用含10％fbs的pbs洗涤细胞两次。使用nikon ti
‑
e倒置落射荧光显微镜拍摄96孔板中培养物的图像。
[0197]
示例4
[0198]
改进的病毒样颗粒稳定化
[0199]
本示例描述了使用双二硫键网络的稳定化病毒样颗粒。这可以防止纳米颗粒在低离子强度缓冲液中于弱还原条件下分解形成更小的亚单位。
[0200]
提供了一种病毒样颗粒(vlp)突变体，其在温和还原条件下具有增强的溶液稳定性。这通过组合连接240个vlp亚单位中每一个的两个二硫键实现。这建立在先前引入vlp蛋白中的d29c
‑
r127c二硫键对的基础上，通过添加p134c
‑
n136c对使靠近c端的vlp亚单位保持稳定状态。双二硫键连接的突变体在这些颗粒下游功能化所需的温和还原条件下更加稳定。
[0201]
据悉，由单硫键稳定的vlp在cu(i)催化的“点击”反应的温和还原环境中解组装。该反应是使vlp支架功能化的便捷方法。非常需要保持组装状态的vlp。
[0202]
在暴露于厌氧cu(i)催化偶联反应的温和还原条件后，对单一二硫化物网络稳定的hbc变体进行考马斯亮蓝染色的非还原sds
‑
page。随着观察到vlp的亚单位迁移到凝胶中，vlp变得不稳定。完全稳定的组装vlp过大，无法迁移到凝胶中。双二硫化物网络稳定的hbc变体暴露于与cu(i)催化的缀合反应相同的温和还原条件下。即使使用更灵敏的放射自显影法，也未观察到不稳定的亚单位。
[0203]
方法：
[0204]
如前所述，使用panox
‑
sp无细胞平台表达乙型肝炎核心(hbc)蛋白。hbc是使用kc6菌株(a19met 、δtona、δtnaa、δspea、δenda、δsdaa、δsdab、δgsha)的细胞提取物制备的。使用braun 10l biostat c发酵罐或使用摇瓶培养物制备细胞提取物。除此提取物外，蛋白合成所需的小分子试剂(10mm谷氨酸镁、10mm谷氨酸铵、175mm谷氨酸钾、1.25mm atp、1mm gtp、1mm utp、1mm ctp、34μg/ml亚叶酸、170.6μg/ml trna、20种天然氨基酸(谷氨酸除外)各2mm、30mm磷酸烯醇丙酮酸、0.33mm nad、0.27mm coa、2.7mm草酸、1mm腐胺、1.5mm亚精胺)纯化t7rna聚合酶，并加入目的质粒。质粒是加入反应的最后一个组分。使用qiagen maxiprep纯化试剂盒制备质粒，其包括异丙醇/乙醇洗涤步骤。除标准氨基酸外，还加入了5μm 14c
‑
亮氨酸，以便通过测量结合的放射活性来量化合成的蛋白。
[0205]
反应在多个规格下进行：50μl，置于1.5ml eppendorf管中；500μl至1ml，置于密封的6孔组织培养板中；或者3
‑
6ml，置于密封的10cm皮氏培养皿中。将反应物置于30℃下孵育6小时。采用液体闪烁计数法(beckman ls6000sc)测量结合的放射活性，以确定蛋白浓度。直接测量总蛋白样本，并在以10k rcf离心15分钟去除不溶蛋白后测量可溶性蛋白样本。这两种样本都在whatman滤纸上沉淀，然后用5％三氯乙酸洗涤三次，去除未结合的14c
‑
亮氨酸。
[0206]
纯化策略首先使用sephadex g25树脂(通用电气)将样本交换到含50mmtris、25mm咪唑、0.1％tween
‑
20的ph 7.4溶液中，然后将可溶组分上样到等体积的ni
‑
nta树脂(qiagen)上。以10k rcf离心15分钟去除不溶蛋白。上样到ni
‑
nta色谱柱后，用5倍柱体积(cv)的含50mm tris、25mm咪唑、0.1％tween
‑
20的ph 7.4溶液洗涤样本，然后用0.5cv(共4cv)部分的含50mm tris、250mm咪唑、0.1％tween
‑
20的ph 7.4溶液洗脱。采用液体闪烁计数法测量结合的放射活性，以分析样本的hbc蛋白相关情况。接着，将含hepbc蛋白的样本再次加入sephadex g25树脂中，去除咪唑，并将它们交换到含50mm tris、0.1％tween
‑
20的ph 7.4溶液中。然后使用millipore 3kda分子量截留过滤器，采用搅拌式细胞浓缩器或基于超滤的离心浓缩器浓缩样本。加盐使最终浓度为1.5m nacl(源自含50mm tris、5m nacl、0.1％tween
‑
20的ph 7.4储备溶液)，诱导vlp组装。将200μl样本加入2.2ml sepharose 6 fast flow(通用电气)尺寸排阻色谱树脂中，洗脱18个150μl组分，对组装的vlp进行定量分析和纯化。采用液体闪烁计数法测量放射活性，以确定每个组分中的蛋白浓度。得到两个峰：组分5和10之间的vlp峰和组分11和18之间未组装的hbc蛋白峰。然后使用曲线下面积(aoc)计算组装百分比：
[0207]
[0208]
使用quikchange定点诱变进行突变。在quikchange反应中使用以下引子及其反向互补序列来改变第134和136位的氨基酸残基：
[0209]
ss8前置引子(突变核苷酸以粗体显示)(序列号：14)
[0210]
ggatttgtactccgccggcttaccgttgtccgtgcgcaccgatcctgagcaccctgccg
[0211]
参考序列
[0212]