一种抗金黄色葡萄球菌遗传修饰山羊生产方法与流程

1.本发明属于基因工程技术领域，涉及一种抗金黄色葡萄球菌遗传修饰山羊生产方法。具体涉及在山羊细胞中表达嵌合tlr2
‑
4基因抗金黄色葡萄球菌的方法。


背景技术：

2.山羊乳腺炎(goat mastitis)是由病原菌引起的山羊最重要疾病之一。细菌学分析显示，山羊乳房分离的细菌以金黄色葡萄球菌(staphyloccocus aureus，s.aureus)最多(40.5％)。该病的临床表现为山羊乳房明显异常，疼痛、脓肿、发热，乳汁产量迅速下降，导致山羊泌乳机能受到严重影响，急性的乳腺炎甚至会造成山羊死亡。该病在全世界大范围流行，患病山羊生产的乳品对公共卫生构成严重风险，因为它可能与人类的乳源性疾病有关。除了造成卫生和健康问题外，产奶量下降、奶质差、过早扑杀动物和治疗成本的增加给畜牧业造成巨大的经济损失。山羊乳腺炎是对山羊养殖业危害最严重的疫病之一，因此，针对山羊乳腺炎急需一种良好的解决办法。
3.抗生素注射是治疗该病的常用手段，常用的乳房炎治疗抗生素有青霉素、四环素和链霉素，但由于s.aureus染色体dna的固有耐药性以及抗生素的大量使用，s.aureus已经成为耐药菌感染的主要病原菌之一，呈现出对多种抗生素耐药的特点。除了对青霉素类、头孢菌素等常用抗生素耐药外，临床上分离到的s.aureus还对万古霉素、替考拉宁、利奈咗烷和大环内酯类抗生素药物具有不同程度的耐药性。而且抗生素药物残留在山羊体内，还存在严重的食品安全隐患，会给人类的健康带来影响。因此，抗生素治疗山羊乳腺炎的应用频率逐年变低，应用效果也越来越差。
4.疫苗接种是目前预防山羊乳腺炎的重要措施，既能增强山羊的抵抗能力和免疫能力，还不会有药物残留，能较大程度的保证乳汁安全和卫生，而且操作简便，成本不高。但由于山羊所处的环境、地域、气候各不相同，所以疫苗的免疫效果往往只是短期见效，不具备长期效应，预防效果欠佳。针对这种情况，国内外的相关兽医学专家也正在积极对奶山羊乳腺炎免疫接种进行持续评估，旨在研制效果更为显著的预防山羊乳腺炎的疫苗，但是目前尚未取得突破。因此，如何更早的发现和清除细菌，控制炎症的发生就显得尤为重要，目前针对金黄色葡萄球菌的先天免疫防御研究正受到广泛的关注。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何从分子水平、早期、有效地防控山羊乳腺炎，增强山羊的免疫力。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
6.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备遗传修饰山羊的方法，所述方法包括如下步骤：将tlr2
‑
4嵌合基因导入作为转基因受体的山羊体细胞中，得到转化的体细胞，由所述转化的体细胞再生出所述遗传修饰山羊(又称为tlr2
‑
4转基因山羊，表达tlr2
‑
4融合蛋白的山羊)，所述tlr2
‑
4嵌合基因编码的嵌合蛋白质包括tlr2的胞外区和
tlr4的跨膜区与胞内区。
7.所述体细胞为离体的细胞。
8.上述方法中，所述嵌合蛋白质还包括信号肽和/或标签蛋白。
9.本领域技术人员应当理解，在研究某一目的蛋白功能时，将一个通过各种方法可以检测到的标签蛋白的基因和目的蛋白的基因进行重组融合，产生的融合蛋白除了目的蛋白本身，同时会带上可检测的标签蛋白，这样目的蛋白也一并检测到，其目的在于能够定位目的蛋白或研究蛋白相互作用，因此，适用于本技术的标签蛋白并不局限于特定种类。
10.所述标签蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his6标签蛋白(his
‑
tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp(增强型绿色荧光蛋白)、ecfp(增强型青色荧光蛋白)、eyfp(增强型黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。
11.进一步地，所述信号肽可为tlr2的信号肽和/或所述标签蛋白可为myc。
12.上述方法中，所述tlr2的胞外区为下述任一种蛋白质：
13.p1)氨基酸序列是seq id no.2的第31
‑
597位的蛋白质；
14.p2)将p1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与p1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
15.所述tlr4的跨膜区与胞内区为下述任一种蛋白质：
16.q1)氨基酸序列是seq id no.2的第598
‑
805位的蛋白质；
17.q2)将q1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与q1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。
18.所述嵌合蛋白质具体可由所述tlr2的胞外区和所述tlr4的跨膜区与胞内区连接而成，也可由所述信号肽、所述tlr2的胞外区和所述tlr4的跨膜区与胞内区连接而成，也可由所述标签蛋白、所述tlr2的胞外区和所述tlr4的跨膜区与胞内区连接而成，也可由所述标签蛋白、所述信号肽、所述tlr2的胞外区和所述tlr4的跨膜区与胞内区连接而成。
19.上述方法中，所述tlr2
‑
4嵌合基因的核苷酸序列可为seq id no.1。
20.seq id no.1所示的tlr2
‑
4嵌合基因编码seq id no.2所示的tlr2
‑
4嵌合蛋白质。
21.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码tlr2
‑
4嵌合蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的tlr2
‑
4嵌合蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码tlr2
‑
4嵌合蛋白质且具有tlr2
‑
4嵌合蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
22.上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
23.本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
24.本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
25.本发明所述tlr2
‑
4嵌合基因能显著提高山羊成纤维细胞对金黄色葡萄球菌的抗性，增加细胞因子和趋化因子的分泌。
26.上述方法中，所述将tlr2
‑
4嵌合基因导入作为转基因受体的山羊体细胞中为将所述tlr2
‑
4嵌合基因导入到山羊setd5基因第一内含子中。
27.所述导入到山羊setd5基因第一内含子中的具体位点为setd5
‑
in；所述setd5
‑
in是大小为2kb的双链dna分子，所述setd5
‑
in的核苷酸序列为seq id no.3。
28.所述导入可为通过显微注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、体细胞核移植法、精子载体介导法、受体介导法等，将所述tlr2
‑
4嵌合基因导入受体动物。
29.在本发明的一个实施方案中，所述导入可为利用crispr/cas9系统进行。
30.上述方法中，所述crispr/cas9系统包括如下a1)或a2)：
31.a1)sgrna，所述sgrna特异性靶向于setd5
‑
in，所述setd5
‑
in是大小为2kb的双链dna分子，所述setd5
‑
in的核苷酸序列为seq id no.3；
32.a2)表达a1)所述sgrna的crispr/cas9载体。
33.上述方法中，所述sgrna识别区的核苷酸序列可为seq id no.4。
34.所述sgrna名称为setd5
‑
in
‑
sgrna2，靶点序列(seq id no.5)为：actacacattatagatgact(seq id no.3的第868
‑
887)，相应sgrna识别区序列如seq id no.4所示，相应sgrna识别区的编码dna序列为：agtcatctataatgtgtagt。
35.上述方法中，所述再生出所述遗传修饰山羊为利用体细胞核移植技术进行。
36.上述方法中，所述方法包括如下步骤：
37.b1)构建crispr/cas9载体，所述crispr/cas9载体包括seq id no.4所示的sgrna；
38.b2)构建供体质粒，所述供体质粒包含seq id no.1所示的tlr2
‑
4嵌合基因；
39.b3)crispr/cas9载体和供体质粒共转染山羊胎儿成纤维细胞；
40.b4)筛选、鉴定阳性克隆细胞作为供体细胞；
41.b5)将所述供体细胞注射到去核的山羊卵母细胞，得到重组胚胎，将所述重组胚胎植入同步发情的受体山羊输卵管中，获得所述遗传修饰山羊。
42.上述方法中，b2)所述供体质粒为双切型供体质粒，即以prosa26
‑
promoter为骨架载体，在上下游分别添加bamhi及xbai酶切位点；双酶切prosa26
‑
promoter载体，将poly(a)克隆到载体上；用xbai和scai
‑
hf双酶切，通过无缝克隆将右同源臂ha
‑
r插入poly(a)后；用acc65i和scali双酶切载体，在prosa26
‑
promoter载体上游引入paci酶切位点并插入左同源臂ha
‑
l，得到重组载体prosa26
‑
ha，在同源臂外侧各添加一个sgrna识别位点；用pmli和ecori
‑
hf双酶切prosa26
‑
ha，在prosa26
‑
promoter与poly(a)之间插入tlr2
‑
4基因，得到重组载体prosa26
‑
tlr2
‑
4；用saci
‑
hf单酶切prosa26
‑
tlr2
‑
4，在ha
‑
r下游插入cmv
‑
tdtomato，获得完整的prosa26
‑
tlr2
‑
4供体质粒，简称为pr
‑
t2/4。
43.上述方法中，所述遗传修饰山羊为抗金黄色葡萄球菌遗传修饰山羊。
44.所述遗传修饰山羊的巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬能力高于作为转基因受体的山羊的巨噬细胞。
45.所述遗传修饰山羊的巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的清除能力高于作为转基因受
体的山羊的巨噬细胞。
46.本发明还提供了所述方法在动物育种和/或培育抗病山羊中的应用。
47.本发明提供了表达tlr2
‑
4融合蛋白的山羊制备方法，利用crispr/cas9系统将tlr2
‑
4嵌合基因定点整合到山羊setd5第一内含子上，筛选中靶细胞，利用体细胞核移植技术制备转基因山羊，从转基因山羊外周血分离tlr2
‑
4巨噬细胞，使宿主机体获得更强的清除s.aureus的能力。
48.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
49.表达tlr2
‑
4嵌合蛋白的山羊制备方法，具体步骤如下：
50.(1)构建基因打靶载体px458
‑
cas9
‑
sgrna
51.a、鉴于基因内含子对突变容忍度较高的特点，选择了其上游基因setd5的第一内含子上的一段序列进行靶点筛选。该区域内不存在可变剪接结合位点，对其进行基因编辑不会对setd5基因及邻近基因的表达产生影响。在该区域的dna双链上寻找pam区，获得了148个靶点序列，靶点的长度为20nt。与ncbi在线数据库进行比对评估脱靶效应，通过在线预测网站对sgrna结构和自由能进行评估，筛选出8个crispr/cas9基因编辑靶点，与表达gfp的cas9载体px458连接，并电转至山羊成纤维细胞中，通过t7e1酶切鉴定结果评估各靶点的基因编辑效率，综合选出最终靶点；
52.b、用rt
‑
pcr方法分别扩增出tlr2胞外区和tlr4的跨膜区和胞内区，同时在tlr2外显子的5’端添加信号肽及myc标签，在tlr2外显子的3’端添加20bp的tlr4胞内同源序列，overlap pcr获得tlr2
‑
4嵌合基因(seq id no.1)；为了提高同源重组的效率，构建了双切型供体质粒作为同源重组模板，即在同源臂外侧各添加一个sgrna识别位点，并且在供体质粒上添加cmv
‑
tdtomato片段，使转染了供体质粒的细胞能够瞬时表达红色荧光；
53.(2)打靶载体和供体质粒转染山羊胎儿成纤维细胞
54.将1
‑
3代的山羊胎儿成纤维细胞培养至细胞达到80％汇合时，将打靶载体px458
‑
cas9
‑
sgrna和供体质粒共同电转入山羊胎儿成纤维细胞，筛选出中靶细胞进行接种、扩大培养；
55.(3)中靶细胞的鉴定
56.打靶载体px458
‑
cas9
‑
sgrna与供体质粒共转染至山羊成纤维细胞培养3天后，流式分选获得同时表达gfp和tdtomato的细胞。每500个细胞铺至100mm细胞培养皿中，培养约14天，用克隆环挑取细胞单克隆至96孔板中，扩大培养单克隆细胞进行pcr鉴定，细胞单克隆的红色、绿色荧光会在挑取单克隆后的大约7
‑
10天消失；
57.(4)转tlr2
‑
4基因克隆山羊的制备
58.将步骤(3)得到的所述中靶细胞核移植到去核后的卵母细胞的透明带下，放入融合液进行融合形成重组胚胎；将重组胚胎植入同步发情的受体羊输卵管中，得到转基因克隆山羊；
59.(5)转基因克隆山羊的检测
60.分离出生小羊外周血巨噬细胞，提取基因组dna和蛋白，进行pcr和wb检测，结果显示tlr2
‑
4基因成功整合并表达；
61.(6)转tlr2
‑
4基因克隆山羊巨噬细胞清除金黄色葡萄球菌能力的检测
62.以moi＝10对转tlr2
‑
4基因山羊巨噬细胞和野生型wt山羊巨噬细胞进行攻菌，结
果显示转tlr2
‑
4基因山羊巨噬细胞清除s.aureus的能力明显增强。
63.本发明提供了一种抗金黄色葡萄球菌的遗传修饰山羊的生产方法，通过构建tlr2
‑
4嵌合表达的基因打靶载体，使用crispa/cas9系统将tlr2
‑
4嵌合基因定点整合到山羊setd5基因座位点(山羊setd5基因第一内含子上)，筛选中靶细胞，利用体细胞核移植技术制备表达tlr2
‑
4嵌合蛋白的转基因山羊，构建的转基因山羊提高了抗金黄色葡萄球菌能力并且增强了免疫力，达到防控金黄色葡萄球菌引起的山羊乳腺炎的目的。经过遗传修饰的tlr2
‑
4转基因山羊巨噬细胞通过tlr2的胞外区域识别金葡菌，再通过tlr4的胞内机制增强对金葡菌的清除能力，达到通过山羊自身的先天免疫有效防控乳腺炎的目的，同时可以避免传统抗生素和疫苗的缺陷。为抗金黄色葡萄球菌山羊新种质的制备奠定基础。
附图说明
64.图1为本发明提供的tlr2胞外区与tlr4跨膜区和胞内区基因拼接的设计。
65.图2为本发明提供的打靶载体和供体质粒的结构示意图。
66.图3为本发明提供的中靶细胞pcr鉴定引物设计方案。
67.图4为本发明提供的tlr2
‑
4转基因山羊。
68.图5为本发明提供的转基因山羊外周血巨噬细胞rt
‑
pcr检测tlr2
‑
4的表达结果。
69.图6为本发明提供的tlr2
‑
4转基因克隆山羊外周血巨噬细胞感染金黄色葡萄球菌后对细菌的吞噬指数。
70.图7为本发明提供的tlr2
‑
4转基因克隆山羊外周血巨噬细胞感染金黄色葡萄球菌后对细菌的吞噬率。
71.图8为本发明提供的tlr2
‑
4转基因克隆山羊外周血巨噬细胞感染金黄色葡萄球菌后对细菌的清除率。
具体实施方式
72.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
73.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
74.下述实施例中的px458载体、prosa26
‑
promoter载体购于addgene公司；pcmv
‑
tdtomato载体购于clontech公司；限制性核酸内切酶、t7e1酶、t4连接酶及buffer购于neb公司；引物合成及序列测定由苏州金唯智公司完成；无缝克隆试剂盒geneart gibson assembly购于thermo fisher公司。金黄色葡萄球菌(s.aureus atcc29213)购自上海北诺生物科技有限公司
75.实施例1tlr2
‑
4转基因山羊的制备
76.1、tlr2
‑
4嵌合基因的制备
77.参照genbank中山羊tlr2和tlr4的外显子序列设计并合成2对引物，引物序列如下：
78.tlr2基因扩增引物：
79.forward：5
’‑
gcctctgatcaggcttcttc
‑3’
80.reverse：5
’‑
cctaggaccttattgcagct
‑3’
81.tlr4基因扩增引物：
82.forward：5
’‑
atcatcagcgtgtcggttgt
‑3’
83.reverse：5
’‑
tcaggtggaggtggtcgctt
‑3’
84.提取山羊血液rna，反转录合成cdna，以此cdna为模板利用上述引物，用rt
‑
pcr方法扩增出山羊tlr2和tlr4基因片段，并利用下面的引物，在tlr2外显子的5’端添加信号肽及myc序列，同时在tlr2胞外区外显子的3’端添加20bp的tlr4胞外区同源序列。
85.forward：atgccacgtgctttgtggacagcgtgggtctgggctgtaatcagcgtgttcacggaaggagagcagaaactcatctctgaagaggatctggcctctggcctctgatcaggcttcttcccggtggcattcagaaaggga
86.reverse：acaaccgacacgctgatgatccggtggcattcagaaaggga
87.将上述获得的tlr2胞外区外显子序列克隆至平末端载体。利用下面的引物进行overlap pcr构建tlr2
‑
4嵌合基因(图1)。
88.forward：atgccacgtgctttgtggac
89.reverse：tcaggtggaggtggtcgctt
90.通过overlap pcr获得的信号肽
‑
myc
‑
tlr2
‑
4嵌合基因(以下简称tlr2
‑
4基因)如图1所示，嵌合基因pcr产物为2418bp(seq id no.1)。
91.tlr2
‑
4嵌合基因的核苷酸序列为seq id no.1，编码的嵌合蛋白tlr2
‑
4的氨基酸序列为seq id no.2。
92.seq id no.1的第91
‑
2418位是tlr2的胞外区及tlr4的跨膜区与胞内区的核苷酸序列；
93.seq id no.2的第31
‑
805位是tlr2的胞外区及tlr4的跨膜区与胞内区的氨基酸序列。
94.seq id no.2的第1
‑
20位是tlr2的信号肽的氨基酸序列；
95.seq id no.2的第21
‑
30位是标签蛋白myc的氨基酸序列；
96.seq id no.2的第31
‑
597位是tlr2的胞外区的氨基酸序列；
97.seq id no.2的第598
‑
805位是tlr4的跨膜区与胞内区的氨基酸序列；
98.seq id no.1的第1
‑
60位是tlr2的信号肽的核苷酸序列；
99.seq id no.1的第61
‑
90位是标签蛋白myc的核苷酸序列；
100.seq id no.1的第91
‑
1791位是tlr2的胞外区的核苷酸序列；
101.seq id no.1的第1792
‑
2418位是tlr4的跨膜区与胞内区的核苷酸序列。
102.2、基因打靶载体和供体质粒的构建
103.px458载体(购于addgene公司)上已有嵌合grna支架结构，只需要将靶点对应的crrna
‑
oligo连接到酶切位点，其在山羊setd5基因第一内含子区产生双链断裂，启动dna双链断裂修复。同时引入连有tlr2
‑
4基因的供体质粒，双链断裂修复过程使tlr2
‑
4基因特异的插入。同时，为了提高转基因细胞的筛选效率，我们在供体质粒上添加cmv
‑
tdtomato片段，使转染了供体质粒的细胞能够瞬时表达tdtomato，构建的基因打靶载体和供体质粒结
构如图2所示。
104.所述sgrna名称为setd5
‑
in
‑
sgrna2，靶点序列(seq id no.5)为：actacacattatagatgact(seq id no.3的第868
‑
887)，相应sgrna识别区序列如seq id no.4所示，相应sgrna识别区的编码dna序列为：agtcatctataatgtgtagt。
105.crrna
‑
oligo序列(靶点序列)如下：
106.actacacattatagatgact(seq id no.5)
107.sgrna识别区核苷酸序列如下：
108.acuacacauuauagaugacu(seq id no.4)
[0109]2‑
1构建基因打靶载体px458
‑
cas9
‑
sgrna
[0110]
将setd5基因的内含子区作为基因编辑靶点筛选区设计基因编辑靶点。在该区域的dna双链上寻找pam区(5
’‑
ngg)，并将其5’端的20nt作为靶点序列。随后，选取pam区5’端的13nt作为种子序列，与ncbi在线数据库进行比对以进行脱靶效应的估计，剔除掉除靶点外还有较多脱靶位点的靶点序列。使用sgrna结构在线预测网站(http://unafold.rna.albany.edu/q＝mfold/rna
‑
folding
‑
form/)评估各靶点对应的sgrna的结构及自由能，筛选crispr/cas9基因编辑靶点并进行细胞水平的验证。
[0111]
px458
‑
cas9
‑
sgrna打靶载体的具体构建方法如下：将合成的引物setd5
‑
in
‑
sgrna2
‑
f(5
’‑
caccgactacacattatagatgact
‑3’
)和引物setd5
‑
in
‑
sgrna2
‑
r(5
’‑
aaacagtcatctataatgtgtagtc
‑3’
)用ddh2o稀释成100μm的溶液，在退火体系中添加setd5
‑
in
‑
sgrna2
‑
f和setd5
‑
in
‑
sgrna2
‑
r引物溶液各1μl，t4连接酶buffer 1μl，ddh2o 7μl，混匀。将上述退火体系放入pcr仪中：95℃，2min；以
‑
5℃/s的速度降至25℃，随后置于冰上，令sgrna退火体系中的f和r引物互补配对，形成含有黏性末端的双链寡核苷酸(oligo)；并取1μl oligo，用ddh2o稀释100倍，得到oligo稀释液。
[0112]
将px458载体(购于addgene公司)用限制性内切酶bbsi酶切并回收纯化，得到酶切后的线性骨架载体，并在连接体系中添加100ng酶切后的线性骨架载体；在连接体系中加入1μl上述oligo稀释液、1μl t4连接酶buffer、1μl t4连接酶，并用ddh2o补足至10μl，混匀，置于16℃过夜反应。通过常规转化法进行转化、涂板。待单菌落长成后，挑取数个扩大培养并测序验证，结果显示sgrna识别区的编码dna已成功连入骨架载体，得到sgrna2
‑
cas9打靶载体px458
‑
cas9
‑
sgrna。
[0113]2‑
2构建供体质粒(pr
‑
t2/4)
[0114]
为后续的无缝克隆试验，需要在获得的tlr2
‑
4嵌合基因两侧添加同源序列。以山羊基因组dna为模板，利用表1的引物扩增左右同源臂。
[0115]
表1 pcr引物
[0116][0117]
通过表2的引物获得供体质粒pr
‑
t2/4中所需元件cmv
‑
tdtomato和poly(a)。
[0118]
表2 pcr引物
[0119][0120]
表中prosa26
‑
promoter载体购自addgene公司。pcmv
‑
tdtomato载体购自clontech公司。
[0121]
以prosa26
‑
promoter为骨架载体，在poly(a)上游引入ecori、pmli酶切位点，上下游分别添加bamhi及xbai酶切位点；用bamhi及xbai同时双酶切prosa26
‑
promoter载体和poly(a)，将poly(a)克隆到prosa26
‑
promoter载体；用xbai和scai
‑
hf双酶切，通过无缝克隆将右同源臂ha
‑
r插入poly(a)后；用acc65i和scali双酶切载体，在prosa26
‑
promoter载体上游引入paci酶切位点并插入左同源臂ha
‑
l，得到重组载体prosa26
‑
ha。prosa26
‑
ha是将prosa26
‑
promoter的限制性核酸内切酶bamhi和xbal之间的小片段替换为核苷酸序列是seq id no.5所示的dna片段，保持prosa26
‑
promoter的其它核苷酸不变得到的重组载体。
[0122]
用pmli和ecori
‑
hf双酶切prosa26
‑
ha，在prosa26
‑
promoter与poly(a)之间插入tlr2
‑
4基因(seq id no.1)，得到重组载体prosa26
‑
tlr2
‑
4；用saci
‑
hf单酶切prosa26
‑
tlr2
‑
4，在ha
‑
r下游插入从pcmv
‑
tdtomato载体中获得的cmv
‑
tdtomato，获得完整的prosa26
‑
tlr2
‑
4供体质粒，简称为pr
‑
t2/4(图2)。
[0123]
3、tlr2
‑
4定点整合成纤维细胞株的筛选构建的基因编辑载体可表达gfp，供体质粒可表达tdtomato，将打靶载体(px458
‑
cas9
‑
sgrna)与供体质粒(pr
‑
t2/4)共转染至1
‑
3代、80％汇合度的山羊胎儿成纤维细胞，在转染后3天通过流式分选获取同时表达红绿荧光的细胞(即同时表达gfp及tdtomato的细胞)，为了获取细胞单克隆，将约500个细胞均匀分散到100mm的细胞培养皿中，并使用含20％fbs的dmem/f12培养基进行细胞单克隆的培养。培养约10
‑
14天后，可见清晰的细胞单克隆，在倒置显微镜下观察并圈出单克隆的轮廓。用克隆环挑取单克隆并转移至96孔板中，用含20％fbs的dmem/f12培养基继续培养。待96孔板
中的细胞密度达到90％以上，取70％的细胞至新孔中继续培养，剩余细胞在原孔中培养，待新孔中的细胞长满后，消化并裂解细胞，pcr检测同源重组的情况。
[0124]
4、tlr2
‑
4定点整合成纤维细胞的pcr鉴定
[0125]
设计鉴定引物如图3所示，利用pcr扩增打靶载体与基因组连接处的序列，确定打靶载体正确整合到打靶位点上。为去除供体质粒残留及nhej(非同源性末端接合)介导的随机插入的影响，将用于同源重组鉴定pcr的上游引物primer u设计在同源臂ha
‑
l上游，下游引物primer l设计在同源臂外侧基因组上；
[0126]
上述鉴定引物序列如下：
[0127]
primer u：acagccagtatgagtgacacc
[0128]
primer l：tccccctaagactcaggcatc
[0129]
primer l1：agacaccagttgggtcacaag
[0130]
pcr鉴定的阳性克隆细胞(成功定点整合了tlr2
‑
4嵌合基因)，即转基因细胞(tlr2
‑
4)作为供体细胞进行下一步的体细胞核移植。
[0131]
5、体细胞核移植技术制备tlr2
‑
4转基因山羊
[0132]
实验选用体重40
±
4.5kg的黑山羊。使用含300mg孕酮的控制药物释放装置(cidr)给其注射孕酮。供体山羊在去除cidr前60h开始，每12h注射240iu的卵泡刺激素，共注射6次，进行超数排卵。在停止cidr时肌肉注射0.1mg前列腺素，并在cidr停药38h后，肌肉注射100iu促黄体生成素以诱导山羊排卵。在停止供体cidr的同时停止受体的cidr，并给受体山羊注射250iu剂量的妊娠母马血清促性腺激素。
[0133]
为了方便手术和减少术后肠粘连，所有山羊在采集卵母细胞前12h禁食。在cidr去除后62h进行腹腔镜检查以检测排卵反应，显示有黄体的山羊即对超排处理有反应，用于卵母细胞收集。将套管连接到注射器上插入子宫输卵管，用20ml含0.3％bsa的温pbs溶液冲洗输卵管收集卵母细胞。用体式显微镜放大10到40倍寻找卵母细胞，将细胞转移到m199培养液中并记录每只山羊的卵母细胞总数。将带有颗粒细胞的卵母细胞放入含有0.1％透明质酸酶的m199培养液中消化5分钟，并通过轻轻吹打去除颗粒细胞。将合格的卵母细胞放在含有5g/ml hoechst 33342和5g/ml细胞松弛素b(cb)的m199中孵育10分钟。在倒置荧光显微镜下，用安装在显微操作器上的去核针吸出第1极体及部分胞质，将tlr2
‑
4成纤维细胞(转基因细胞tlr2
‑
4)作为供体细胞注入到去核卵母细胞的透明带下，然后通过微电极挤压融合，两次直流电脉冲在20v，每次20μs的条件下进行融合。将融合的重构胚胎放入添加7.5μg/ml cb和10％fbs的m199培养液中，在38.5℃、5％co2、饱合湿度下培养2
‑
3h后观察融合情况。将融合的重构胚胎用含5μmol/l的离子霉素处理4min，然后在含有2mmol/l6
‑
dimethylaminopurine(6
‑
dmap)的培养液内培养3h，洗3次后转移到msof培养液中进行过夜培养。将这些胚胎移植到受体的输卵管中，胚胎移植后60天通过超声检查评估受体的妊娠状态。
[0134]
如图4所示，本发明共移植转tlr2
‑
4基因克隆胚胎126枚到12只同期发情的受体山羊体内，一个月后2只建立妊娠，3个月后2只维持妊娠并继续被监测，共生产转基因克隆山羊1只。
[0135]
实施例2转基因山羊tlr2
‑
4嵌合蛋白的rt
‑
pcr鉴定
[0136]
提取出生小羊外周血巨噬细胞rna，进行rt
‑
pcr检测和wb检测，结果显示转基因山
羊巨噬细胞cdna成功扩增出tlr2
‑
4嵌合基因片段，pcr检测结果见图5。引物如下：
[0137]
primer p1:(tlr2
‑
4嵌合基因扩增引物)
[0138]
forward：tgacttcctgtccttcacaca
[0139]
reverse：ctttaccagttcattccgca
[0140]
primer p2:(内参基因gapdh扩增引物)
[0141]
forward：ctgacctgccgcctggagaaa
[0142]
reverse：gtagaagagtgagtgtcgctgtt
[0143]
结果表明，在转基因山羊中已成功定点整合了tlr2
‑
4嵌合基因并表达出tlr2
‑
4嵌合蛋白。
[0144]
实施例3转tlr2
‑
4基因山羊巨噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌能力的鉴定
[0145]
fitc标记的金黄色葡萄球菌以moi＝10分别感染tlr2
‑
4巨噬细胞和wt对照组山羊巨噬细胞1小时，pbs洗涤三次后，用含有200μg/ml庆大霉素的dmem孵育细胞1h以清除黏附在细胞表面的细菌。流式细胞术检测两组细胞的吞噬指数(巨噬细胞中fitc的平均荧光强度)和吞噬率(fitc阳性细胞数/总细胞术
×
100％)。如图6所示，在感染30min，60min，120min时，tlr2
‑
4巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬指数均显著高于两组野生型山羊巨噬细胞。如图7所示，在感染的所有时间段，tlr2
‑
4巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬率均显著高于两组野生型山羊巨噬细胞。实验结果说明在感染金葡菌后，表达tlr2
‑
4嵌合蛋白能够作为山羊的先天免疫受体识别金葡菌，并且tlr2
‑
4巨噬细胞对金葡菌的吞噬能力显著高于野生型山羊巨噬细胞。采用origin 8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标准偏差表示，采用student’s t检验，p＜0.05(*)表示具有显著性差异，p＜0.01(**)表示具有显著性差异，p＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
[0146]
实施例4转tlr2
‑
4基因山羊巨噬细胞清除金黄色葡萄球菌能力的鉴定
[0147]
金黄色葡萄球菌以moi＝10分别感染tlr2
‑
4巨噬细胞和wt对照组山羊巨噬细胞1小时，pbs洗涤三次后，用含有200μg/ml庆大霉素的dmem培养液孵育细胞1小时以清除黏附在细胞表面的细菌。更换含有200μg/ml庆大霉素的dmem培养液继续培养4h,8h,12h,24h。裂解细胞，通过cfu菌落计数的方法检测巨噬细胞中的金葡菌数。如图8所示，在感染后的4h,8h,12h,24h，tlr2
‑
4巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的清除率均显著高于两组wt山羊巨噬细胞。实验结果表明tlr2
‑
4巨噬细胞比对照组巨噬细胞更有效的清除了金黄色葡萄球菌。采用origin 8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标准偏差表示，采用student’s t检验，p＜0.05(*)表示具有显著性差异，p＜0.01(**)表示具有显著性差异，p＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
[0148]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。