检测非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因的引物对、探针、试剂盒及其应用的制作方法

检测非洲猪瘟病毒mgf360-12l基因的引物对、探针、试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种基于mgf360-12l基因检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、试剂盒、及其应用。


背景技术：

2.非洲猪瘟(african swine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,asfv)感染引起的一种猪急性、热性、高度接触性传染病。临床上主要以高热皮肤和内脏器官出血、共济失调和食欲废绝为主要特征，死亡率接近100％。非洲猪瘟是世界动物卫生组织(oie)要求法定报告的动物疫病，我国动物病原微生物名录将其列为一类病。自2018年8月3日中国农村农业部在辽宁省确认非洲猪瘟疫情以来，非洲猪瘟已蔓延至32个省级行政区域，使得近120万头生猪遭到扑杀，对中国养猪业造成了巨大的经济损失，严重威胁畜牧业的健康发展，也给人类公共卫生造成了威胁。asfv属于非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属，是该科的唯一成员。asfv基因组大小170～190kb，是一种双股dna病毒，编码160～175个基因。用编码vp72蛋白的b646l基因分析不同地区asfv分离株，可以将asfv流行株分为22个主要的基因型，其中流行于中国的主要是基因ii型。
3.目前针对asfv的检测技术主要分为两大类，即基于病毒抗体的免疫学检测方法和基于病毒核酸的pcr检测技术。针对asfv的免疫学检测方法主要有红细胞吸附试验(ha)、直接荧光抗体试验(fat)、酶联免疫吸附试验(elisa)等。免疫学检测方法的优点在于可以准确反应病毒的发生和发展情况。但是，免疫学检测方法试验要求高、费用高、耗时长、敏感性较低。此外，asfv感染早期并不会产生抗体，因此免疫学检测方法的使用受到了局限。近年来，荧光定量pcr由于敏感性高、特异性好、耗时短及定量准确等优点而逐渐被广泛应用。荧光定量pcr主要包括sybr green i法和taqman探针法，taqman探针法相对于sybr green i法具有更高的特异性，应用价值更高。
4.asfv基因组庞大，其基因组中约30％的开放阅读框存在多个拷贝，即多基因家族(multigene families,mgfs)，包括mgf100、mgf110、mgf300、mgf360、mgf505(在malawi分离株中命名为530)。mgf编码的多个拷贝提示病毒的选择进化可能与此相关。虽然对mgfs的功能尚待深入研究，但研究已证明mgf在病毒的感染过程中有重要作用。敲除asfv强毒或弱毒株mgf360和530/505的某些基因将导致病毒在巨噬细胞或软蜱体内的复制效率下降，免疫动物后可以提供针对同源病毒或部分异源病毒的保护力；缺失mgf360的10l、11l、12l、13l、14l和mgf530/505-1r、-2r、-3r基因的弱毒株ourt88/3，在体内和体外均可激发较高水平的ifn(interferon)表达，这种缺失毒株可以对某些基因型提供一定的攻毒保护能力；除此之外，同样缺失asfv benin 97/1毒株的上述基因，并使mgf360-9l与mgf 505-4r失活，以此缺失毒株感染猪巨噬细胞可检测到ifn-β的表达水平较原始毒株明显升高，而以这种缺失毒株免疫猪后可以提供一定的免疫保护，且这种保护还与病毒毒力成剂量相关。最近的研究表明，asfv mgf360-12l是一种多功能宿主逃避蛋白，发挥免疫抑制功能通过多种机制实
现，包括抑制tbk1、irf3、ikkβ和irf9的蛋白表达水平，以抑制ifn-β的表达和ifn-β介导的jak/stat信号。这些都说明mgf360家族有很大的研究价值，有必要建立针对mgf360家族的检测方法。


技术实现要素：

5.本发明要解决目前缺乏快速、准确检测非洲猪瘟病毒试剂盒的技术问题，提供一种荧光定量rt-pcr检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、及试剂盒，该试剂盒能快速、准确、灵敏、特异地对非洲猪瘟病毒(asfv)进行检测。
6.为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
7.在本发明的一个方面，提供了一种检测非洲猪瘟病毒的引物对，所述引物对是针对seq id no：1所示非洲猪瘟病毒mgf360-12l基因序列或其部分序列设计的引物对。
8.优选的，所述引物对具有如seq id no：2和seq id no：3所示的碱基序列。
9.在本发明的另一方面，还提供了一种检测非洲猪瘟病毒的探针，所述探针是特异性针对seq id no：1所示非洲猪瘟病毒mgf360-12l基因序列或其部分序列设计的探针。
10.优选的，所述探针具有如seq id no：4所示的碱基序列。
11.所述探针的5’端标记有荧光报告基团，所述探针的3’标记有荧光淬灭基团。
12.在本发明的另一方面，还提供了一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物对。
13.优选的，所述试剂盒还包含上述探针。
14.优选的，所述试剂盒还包含：含有seq id no：1所示非洲猪瘟病毒mgf360-12l基因序列的阳性重组质粒标准品。
15.所述试剂盒采用荧光定量pcr方法进行检测。
16.优选的，所述荧光定量pcr的反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火延伸10秒，40个循环。
17.本发明试剂盒不仅可用于检测非洲猪瘟病毒，而且还可用于鉴别区分mgf360-12l基因缺失的非洲猪瘟病毒弱毒疫苗株与非洲猪瘟野毒株的感染。
18.在本发明的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用。
19.本发明检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，通过基于非洲猪瘟病毒mgf360-12l基因的taqman探针实时荧光定量pcr检测方法对非洲猪瘟病毒进行检测，最低可检测到790copies/μl，其敏感度比常规pcr高10倍，具有广阔的应用前景。
附图说明
20.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
21.图1是本发明实施例1的标准品扩增曲线图；
22.图2是本发明实施例1的标准曲线图；
23.图3是本发明实施例3的敏感性试验结果图；
24.图4是本发明实施例4的china/2018/anhuixcgq常规pcr敏感性测试结果图；
25.图5是本发明实施例5的特异性试验结果图。
具体实施方式
26.下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克j，拉塞尔d w，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.分子克隆实验指南，第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
27.实施例1非洲猪瘟病毒taqman实时荧光定量pcr检测方法的建立
28.1材料和方法
29.1.1生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可
30.中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病研究中心的生物安全3级实验室(absl-3)，2006年通过cnas高致病性病原微生物生物安全三级实验室认可，2008年获得原农业部高致病性动物病原微生物实验室资格证书，2019年经农业农村部授权成立国家非洲猪瘟参考实验室，具备从事非洲猪瘟活病毒研究的软硬件条件，符合国家相关生物安全政策要求。
31.1.2质粒、毒株与细胞
32.china/2018/anhuixcgq由中国动物卫生与流行病学中心国家非洲猪瘟参考实验室实验室保存，重组质粒pet30a-mgf360-12l由本实验室构建，pam细胞由本实验室制备，wsl细胞由本实验室传代保存。感受态细胞dh-5α购自takara公司。
33.1.3主要试剂
34.dl2,000dna marker，premix ex taq(probe qpcr)等购自takara，dna小提试剂盒(axyprep体液病毒dna/rna小量试剂盒)、质粒小提试剂盒(axypreptm plasmid miniprep kit)购自康宁生命科学。
35.1.4引物与探针
36.针对流行毒株china/2018/anhuixcgq，sy-18和georgia 2007/1株的mgf360-12l基因序列(seq id no：1)设计qpcr的特异性引物q12l-f:5
’-
atttcttcttcattcaaggtttc-3’(seq id no：2)，q12l-r:5
’-
gtaagggaaaacaactacaacct-3’(seq id no：3)和探针12l-probe:5’6-fam-cccg tagttgatgtccgccccccac-3’tamra-n(seq id no：4)，目的片段为146bp；针对mgf360-12l基因的asfv常规检测pcr方法为本实验室建立，12l-f:5
’-
caaaaaggtgtt ggctggacaatgcg-3’(seq id no：5)和12l-r:5
’-
ttcccttacagccttcactaa cgccg-3’(seq id no：6)，目的片段为178bp，引物和探针均由上海生工生物工程有限公司合成。
37.1.5标准品制备
38.以实验室构建的重组质粒pet-30a-mgf360-12l转化后提取质粒，根据其分子量计算浓度并换算成copies/μl，将计算好拷贝数的模板10倍梯度稀释至100copy/μl以制备标准品。
39.1.6反应体系和反应程序的建立与优化
40.按照premix ex taq(probe qpcr)说明书的建议建立最初的taqman实时荧光定量pcr反应体系为20μl，包含premix ex taq(probe qpcr)10μl，q12l-f(10μm)1.0μl，q12l-r(10μm)1.0μl，12l-probe(10μm)1.0μl，以ddh2o补足至20μl。实时荧光定量pcr反应程序为95℃，30s；95℃，5s，60℃，10s，40个循环。以104copies/μl质粒为模板，按照20μl体系进行荧光定量pcr试验以测试建立的反应体系是否可以正常运行。为获得最佳灵敏度，调整实时
荧光定量pcr反应的tm值为52℃、54℃、56℃、58℃、62℃、64℃，以测试实时荧光定量pcr反应的最佳反应温度。通过调整引物浓度(0.1μm～1μm)和探针浓度(0.1μm～0.5μm)来建立最佳实时荧光定量pcr的反应条件。
41.1.7荧光定量标准曲线的建立与绘制
42.分别以稀释好的标准品质粒为模板，根据优化好反应条件进行实时荧光定量pcr反应。利用graphpad prism 8软件，根据标准品质粒的拷贝数和实时荧光定量pcr反应的ct值绘制标准曲线并计算公式。
43.2.结果
44.2.1实时荧光定量pcr反应体系和反应程序的优化
45.经优化后建立的taqman荧光定量pcr反应体系为：premix ex taqtm(takara，大连)10μl、上/下游引物(12l-f/12l-r，10μm)各0.8μl、探针(12l-probe，10μm)0.4μl、模板1μl、水补足至20μl。优化后的实时荧光定量pcr方法最佳反应条件为：95℃，30s；95℃，5s，60℃，10s，40个循环。
46.2.2实时荧光定量pcr标准曲线的建立
47.经过紫外分光光度计测定的质粒溶液质量浓度为78ng/μl，重组质粒长度为6545bp，根据公式计算标准品拷贝数为6.02
×
10
23
copies/mol
×
78ng/μl/(6545
×
660g/mol)＝1.09
×
10
10
copies/μl。调整质粒的浓度为1
×
108copies/μl，然后用ddh2o 10倍倍比稀释至1
×
100copy/μl，以这些质粒作为标准品。取1μl稀释好的标准品质粒为模板，按照优化好的实时荧光定量pcr体系进行扩增，标准品质粒108copies/μl～104copies/μl得到的ct值平均数依次是18.58、22.43、26.37、30.48、33.52，扩增曲线如图1所示，使用graphpad prism 8绘制的标准曲线如图2所示。标准曲线斜率为-3.792，r2＝0.9966，直线方程为y＝-3.792lgx 49.03(图2)。将待测样品的ct值代入标准曲线方程，即可通过计算得到起始病毒核酸量，以此来达到检测的目的。
48.实施例2实时荧光定量pcr的重复性试验
49.以108copies/μl～104copies/μl浓度的标准品质粒为模板进行实时荧光定量pcr试验，每个样品重复3次，通过计算ct值的变异系数cv来评价建立的实时荧光定量pcr试验的稳定性。
50.将不同拷贝数的标准品(108～104copies/μl)重复测定3次，将试验结果进行统计分析，对建立的实时荧光定量pcr检测方法的重复性进行考查。结果见表1。由表1可知，同一稀释度的ct值差值较小，重复性较好。3次标准曲线具有良好的重复系数和扩增效率。
51.表1实时荧光定量pcr反应的精确度和重复性
[0052][0053]
实施例3实时荧光定量pcr的敏感性试验
[0054]
以108copies/μl～100copy/μl浓度的标准品质粒为模板，以最佳反应条件进行实时荧光定量pcr试验，确定反应的最小检出量。
[0055]
将标准品作连续10倍倍比稀释，分别以108copies/μl、107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl、100copies/μl的重组质粒为模板进行荧光定量pcr反应，以出现阳性曲线所用模板的最高稀释度为其敏感度，结果见图3及表2。由图3可知，建立的实时荧光定量pcr检测方法可检测到的最低质粒浓度1000copies/μl。
[0056]
表2敏感性试验对应ct值
[0057][0058]
实施例4实时荧光定量pcr试验和普通pcr试验对比
[0059]
在采用实时荧光定量pcr试验的同时，进行普通pcr反应，比较两种检测方法的敏感性。
[0060]
将病毒滴度为10
7.5
tcid
50
/ml的china/2018/anhuixcgq以未感染asfv的健康猪血清10倍倍比稀释以模拟病毒感染猪后在血液内的状态。取200μl倍比稀释的带毒血清提取dna，分别以普通pcr和实时荧光定量pcr进行检测。结果表明(见表3)，建立的实时荧光定量pcr方法最低可以检测到790copies/μl，对应病毒滴度为10
3.5
tcid
50
/ml，ct值为35.01，稀释度为10-4
。同时用普通pcr进行检测，结果表明常规pcr可以检测到稀释度为10-3
的病毒(图4)，m.dl2000 dna marker；1～8.china/2018/anhuixcgq na连续10倍倍比稀释后，从100～10-7
，使用普通pcr的mgf360-12l引物进行常规pcr检测；9.空白对照。因此建立的实时荧光定量pcr方法敏感度比常规pcr高10倍。
[0061]
表3以asfv-18的dna为模板的敏感性试验
[0062][0063]
实施例5实时荧光定量pcr的特异性试验
[0064]
以建立的实时荧光定量pcr方法对常见的猪传染病毒包括猪伪狂犬病毒(prv)、猪蓝耳病病毒(prrs)、猪瘟病毒(csfv)、猪细小病毒(ppv)、猪圆环病毒(pcv2)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪腺病毒(padv)、猪副流感病毒5型(piv5)进行检测，以评价引物和探针的特异性。将实验室保存的病毒组织样品与含1％牛血清0.1mol/l pbs(ph值为7.2)溶液混合，在研钵中研磨后取200μl上清液备用。利用axyprep体液病毒dna/rna小量试剂盒(康宁，
吴江)提取dna病毒和rna病毒的核酸。rna病毒的核酸进行反转录以获得cdna，反转录体系如下：rnase ribonuclease inhibitor(索莱宝，北京),2μl；5
×
m-mlv buffer,4μl；m-mlv reverse transcriptase(takara，大连),1μl；random primers(100μm)(takara，大连),1μl；dntp(10mm),1μl；rna模板 depc水,10μl。反应程序为30℃,10min；42℃,60min；70℃,10min。取病毒dna或者cdna 2μl为模板进行实时荧光定量pcr反应。每次检测时设定阳性对照和阴性对照，当阴性对照实验结果为阴性，阳性对照实验结果为阳性时整个试验有效，可进一步判定结果。
[0065]
结果：利用建立的实时荧光定量pcr方法，以实验室收集保存的7种猪源病毒(分别为：猪传染性肠胃炎病毒(tgev)、伪狂犬病毒(prv)、蓝耳病病毒(prrs)、圆环病毒(pcv2)、细小病毒(ppv)、猪腺病毒(padv)、猪副流感病毒5型(piv5))的dna或者cdna为模板，利用建立的实时荧光定量pcr引物和探针进行荧光定量pcr扩增反应，同时以去离子水为模板设立阴性对照并且以重组质粒为阳性对照，以优化好的实时荧光定量pcr体系和程序进行试验。结果显示只有阳性对照出现荧光报告信号，其他均未出现，表明建立的实时荧光定量pcr检测方法具有较好的特异性(图5)。
[0066]
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。