一种适用于谷氨酸棒杆菌的高强度启动子及应用的制作方法

1.本发明涉及一种适用于谷氨酸棒杆菌的高强度启动子及应用，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)作为一种重要的工业模式微生物，能够利用粗糙的底物合成很多有用的化合物。然而，野生型的谷氨酸棒杆菌很难直接得到应用，必须对其进行必要的改造。诱变育种已经实现很多化合物的谷氨酸棒杆菌发酵生产，但是有些化合物的产量与转化率还是受到很大的限制。为此，研究者们转向了代谢工程与合成生物学的应用。通过质粒表达或者强启动子的基因组整合过表达相关基因往往可以使代谢流更多地流向目标产物。对于多基因途径，质粒表达容易造成菌体负担，最终影响产物的合成，此时使用基因组整合表达会有很大的优势。
3.不管是质粒表达还是基因组整合表达，基因的拷贝数对于基因上调水平都有很大的作用。基因组整合表达的拷贝数一般都很低，要实现多拷贝地整合比较困难，因此使用强启动子成为更为简单有效的手段。先前的研究中，谷氨酸棒杆菌已经具备了一些强启动子(如p
sod
、p
tuf
),后来又补充了p
h36
、p
45
等强启动子，但是这些启动子还是无法满足需要。因此，筛选更高强度的启动子对于完善谷氨酸棒杆菌的合成生物学工具包有很大的意义。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，设计不同引物扩增dna片段，以荧光蛋白为报告基因，构建重组质粒，并转化宿主得到重组菌株，比较重组菌荧光强度，筛选强启动子。
5.本发明的第一个目的是提供一种高强度启动子，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.本发明的第二个目的是提供含有seq id no.1所示启动子的表达载体。
7.在一种实施方式中，将seq id no.1所示的启动子与质粒可操作性连接获得所述表达载体；所述可操性连接是指具有启动子活性的核苷酸功能地连接至基因序列，以起始和介导靶基因转录，该连接过程可以利用本领域已知的基因重组技术实现，并可以通过使用本领域已知的限制酶和连接酶进行位点特异性dna切割和连接。
8.在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于pec-xk99e、pxz10145、pxmj19、pjyw-4、pjyw-5。
9.本发明的第三个目的是提供含有所述高强度启动子或所述表达载体的微生物细胞。
10.在一种实施方式中，所述微生物细胞是重组谷氨酸棒杆菌。
11.在一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌atcc 13032为宿主，将所述启动子引入基因组。
12.在一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌atcc 13032为宿主，将所述表达载体转化至谷氨酸棒杆菌atcc 13032细胞中。
13.在一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌是将seq id no.1所示的启动子与seq id no.20所示的编码高丝氨酸乙酰基转移酶的基因与载体pec-xk99e连接，转化至谷氨酸棒杆菌atcc 13032细胞中。
14.本发明的第四个目的是提供所述高强度启动子在强化基因或蛋白质表达方面的应用。
15.在一种实施方式中，所述应用是强化基因在谷氨酸棒状杆菌中的表达。
16.在一种实施方式中，所述基因包括但不限于参与微生物生长或代谢的基因。
17.在一种实施方式中，所述基因为红色荧光蛋白基因mcherry。
18.在一种实施方式中，所述蛋白质为内源蛋白或外源蛋白。
19.在一种实施方式中，所述蛋白质为高丝氨酸乙酰基转移酶，氨基酸序列含有seq id no.21所示的氨基酸序列。
20.本发明的第五个目的是提供所述高强度启动子在提高谷氨酸棒杆菌生产o-乙酰-l-高丝氨酸方面的应用。
21.在一种实施方式中，所述应用是将seq id no.1所示的启动子与seq id no.20所示的编码高丝氨酸乙酰基转移酶的基因与载体pec-xk99e连接，转化至产高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌中，获得重组谷氨酸棒杆菌；再将重组谷氨酸棒杆菌在25-37℃、150-250rpm条件下培养至少36h。
22.在一种实施方式中，所述应用是将seq id no.1所示的启动子与seq id no.20所示的编码高丝氨酸乙酰基转移酶的基因与载体pec-xk99e连接，转化至产高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌中，获得重组谷氨酸棒杆菌；再将重组谷氨酸棒杆菌培养2-4d后转接至含有40-60g/l葡萄糖与0.1-1.0g/l酵母提取物的cgxii培养基中，培养12-24h后再以1-2％接种量转接至含有1～2ml发酵培养基的48孔或96孔深孔板中，在25-37℃、150-250rpm条件下培养至少36h。
23.在一种实施方式中，所述发酵培养基是含有：60-120g/l d-葡萄糖，10-30g/l玉米浆，10-30g/l(nh4)2so4，0.5-2g/l kh2po4，0.2-0.6g/l mgso4,，0.05-0.15g/l mnso4·
h2o，0.005-0.012g/l feso4·
7h2o，0.5-1.5mg/l维生素b1，4-8mg/l维生素b6，2-6mg/l维生素b
12
，0.02-0.04mg/l生物素。
24.有益效果：本发明筛选获得的启动子可以被导入生产氨基酸的微生物中，经证实，在谷氨酸棒杆菌中，该启动子可强化基因的表达量使其涉及的目标产物产量提高2～10倍甚至更高，具有重要的工业化应用价值。
附图说明
25.图1：ptrc-mcherry重组质粒的构建流程图。
26.图2：重组菌pec-xk99e(a)与重组菌ptrc-mcherry(b)培养72h后分别在平板培养基、光学显微镜、荧光荧光显微镜观察结果。
27.图3：px-mcherry文库的构建流程图。
28.图4：(a)为实施例2构建的含有ptrc-mcherry质粒的重组菌的生长曲线；(b)为含
有不同启动子的重组菌px-mcherry的荧光强度/od
600
值，其中，横轴的数值代表启动子编号，第1～18分别对应seq id no.1～18的启动子。
具体实施方式
29.为使本发明的上述目的能够更加易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
30.(一)培养基：
31.lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l。加入20g/l琼脂条，以配制lb固体培养基。
32.lbb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，脑心浸出液18.5g/l；加入20g/l琼脂条，可得lbb固体培养基。
33.cgxii培养基：尿素5g/l，(nh4)2so
4 20g/l，kh2po
4 1g/l，k2hpo
4 1g/l，mgso4·
7h2o 0.25g/l，mops 42g/l，cacl
2 0.01g/l，mnso
4 0.01g/l，柠檬酸钠0.02mg/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，znso4·
7h2o 0.01g/l，cuso4·
5h2o 0.2mg/l，nicl2·
6h2o 0.02mg/l，生物素25μg/l。
34.o-乙酰-l-高丝氨酸发酵培养基：100g/l d-葡萄糖，20g/l玉米浆，20g/l(nh4)2so4，1g/l kh2po4，0.5g/l mgso4,，0.01g/l mnso4·
h2o，0.01g/l feso4·
7h2o，1mg/l维生素b1，6mg/l维生素b6，4mg/l维生素b
12
，0.025mg/l生物素(使用氨水调节ph为7.0)
35.(二)荧光强度检测方法：以开始转接时间为0h，间隔6-12h定时取样，吸取100-200μl菌液放至96浅孔板中，并于600nm处检测吸光值(od
600
)；然后检测荧光值：激发波长为587nm，发射波长为610nm，测定吸光值(od
610
)；od
610
/od
600
值即为重组菌的荧光强度。
36.(三)实施例中的部分启动子信息如表1所示。
37.表1 启动子及对应的序列
[0038][0039]
实施例1重组质粒ptrc-mcherry的构建
[0040]
以质粒pec-xk99e为模板，以引物p
trc-f(cggcatgcatttacgtgtcgacgcgcaacgcaattaatgtgagttagc)与p
trc-r(tcgcccttgctcactctagacattactagtctccttctggatccccgggtaccgagc)扩增得到p
trc
片段(如seq id no.19所示)。
[0041]
使用引物xk99e-f(atggacgagctgtacaagtaactgcaggcatgcaagcttg)与xk99e-r(gtcgacacgtaaatgcatgccg)线性化质粒pec-xk99e，得到xk99e-xxh；再以xk99e-xxh为模板，使用引物mcherry-f(atgtctagagtgagcaagggcgaggag)与引物mcherry-r(ttacttgtacagctcgtccatgccg)扩增mcherry基因，得到mcherry基因片段；使用gibson组装方式连接p
trc
片段、xk99e-xxh、mcherry基因片段得到重组质粒ptrc-mcherry。
[0042]
实施例2表达荧光蛋白的重组菌ptrc-mcherry的构建
[0043]
使用电击转化法等方式转化重组质粒ptrc-mcherry至谷氨酸棒杆菌atcc 13032，获得ptrc-mcherry重组菌。
[0044]
将重组菌划线于lbb固体培养基平板上，培养3d后转接至含有40-60g/l葡萄糖的cgxii培养基，培养18-24h后以1-2％接种量转接至含有1.5-2ml培养基的48孔或96孔深孔板中，在25-37℃、150-250rpm条件下培养，选取6-12h定时取样。
[0045]
检测培养36h细胞培养液中的荧光强度，结果显示，培养36h的荧光强度为81361.82。实施例3含有不同启动子的重组px-mcherry文库的构建
[0046]
在25-37℃条件下，使用lbb固体培养基划线培养谷氨酸棒杆菌atcc 13032，2-4d培养后接种至lbb液体培养基，培养12-48h后收集菌体提取基因组。以谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组为模板，设计引物并扩增得到不同启动子片段px(px1、px2、px3
……
pxn)；其中部分启动子的核苷酸序列如seq id no.1～18所示。
[0047]
使用限制性内切酶sali、xbai消化实施例1构建的重组质粒ptrc-mcherry，得到线性化片段p-mcherry-xxh；使用gibson组装方式连接px与p-mcherry-xxh得到重组质粒px-mcherry。使用电击转化法等方式转化重组质粒至谷氨酸棒杆菌atcc 13032，即可得到重组px-mcherry文库。
[0048]
将重组px-mcherry文库中的菌株，分别单独划线于lbb固体培养基平板上，培养3d后转接含有40g/l葡萄糖与0.5g/l酵母粉的cgxii培养基，培养20h后以2％接种量转接至含有2ml补充40g/l葡萄糖的cgxii培养基的48孔或96孔深孔板中，在30℃、220rpm条件下培养，每6-12h定时取样。
[0049]
检测培养36h细胞培养液中的荧光强度，结果显示，seq id no.1所示的启动子片段pncgl1676构建得到的重组菌pncgl1676-mcherry的od
610
/od
600
值最高，为275880.91，是重组菌psod-mcherry的5倍左右。
[0050]
实施例4
[0051]
按照实施例1～3相同的策略构建以seq id no.1所示启动子pncgl1676表达metx基因的重组质粒pncgl1676-metx，区别在于，将mcherry基因替换为seq id no.20所示的编码高丝氨酸乙酰基转移酶的基因metx，将重组质粒pncgl1676-metx转化至产l-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌中，获得重组菌pncgl1676-metx。
[0052]
以相同宿主细胞但转化重组质粒psod-metx(以seq id no.9所示的sod启动子(ncgl2826)替换启动子pncgl1676，并以metx基因替换mcherry基因)，得到重组菌psod-metx。
[0053]
以相同宿主细胞但转化质粒pec-xk99e，获得重组菌pec-xk99e。
[0054]
以重组菌psod-metx、pec-xk99e为对照，按照标准的氨基酸测定方法测定重组菌pncgl1676-metx和对照在o-乙酰-l-高丝氨酸发酵培养基中，于30℃、220rpm培养48h后的o-乙酰-l-高丝氨酸的含量，结果显示：重组菌pncgl1676-metx、psod-metx、pec-xk99e的o-乙酰-l-高丝氨酸产量为1.57g/l、0.82g/l、0.13g/l。
[0055]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。