猪伪狂犬病变异病毒毒株及其应用的制作方法

1.本技术属于病毒分子生物学和基因工程领域技术领域，更具体地，涉及一种猪伪狂犬病变异病毒毒株及其应用。


背景技术：

2.伪狂犬病是伪狂犬病病毒(以下简称prv)引起的一种猪的以瘙痒、发热和脑脊髓炎神经症状等为特征的重要传染病，是当前危害养猪业的最为严重的传染病之一，在世界范围内广泛流行，每年给世界养猪业造成巨大的经济损失。由于该病毒同时可以感染多种家畜(猪、牛、绵羊、山羊、犬、兔、马等)和野生动物(狐、狼、鼠、蝙蝠、鹿、熊、野猪等)，该病是典型的自然疫源性疾病。因为猪是其唯一的自然携带者，部分大猪潜伏感染长期带毒并间歇排毒，成为猪群的传染源。主要通过接触传播，可通过空气、水和污染的媒介传播，也可通过胎盘和精液传播，鼠、猫、狗等野生或者家养哺乳动物也可传播该病。该病最早报道于1902年，90年代后呈世界性分存，尤其是猪群密集的地区。bartha
‑
k61疫苗株的使用，曾经有效的控制了rpv的病毒的传播，但并没有阻断感染。大多数欧洲国家、美国和新西兰通过免疫净化已经清除了饲养猪群中的经典prv感染。
3.prv属于疱疹病毒目，疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，水痘
‑
带状病毒属，prv是双链dna病毒，基因组全长约150kb，可编码7～100个基因，毒力相关基因有tk，糖蛋白gc、gi、ge、gg等。prv当前只有一个血清型，但不同毒株的生物学特性和毒力强弱不同，2011年以来我国东北、华东和华南新出现的prv变异毒株，对免疫过prv经典疫苗的猪场造成严重的经济损失，表现为母猪流产、产死胎和木乃伊胎，仔猪中枢神经症状、呼吸困难、高死亡率，生长育肥猪呼吸道疾病，偶尔也有发生死亡，实验室确诊为prv野毒感染，流行病学调查结果表明，prv变异毒株毒力基因gi、ge等发生多个位点插入或突变，主要抗原基因gb、gc和gd也发生了多个位点的插入、缺失和点突变，导致中和和抗体发生突变；免疫攻毒保护试研究表明，传统的bartha k61株疫苗能对prv经典毒株(如ea株)等提供良好的免疫保护，但对流行病毒的变异株仅能提供部分保护，这与临床上免疫过bartha k61疫苗的猪屡屡发生rpv感染现象一致。
4.因此，构建以变异毒株为基础的疫苗侯选株，通过加强免疫、区分感染和免疫策略(diva)，逐步建立净化猪群，才能有效的控制prv变异株侵袭，最终净化prv感染。


技术实现要素：

5.本技术的目的包括，例如，提供一种猪伪狂犬病变异病毒毒株及其在制备猪伪狂犬病疫苗上的应用，以至少改善部分上述问题。
6.本技术的实施例可以这样实现：
7.一方面，本技术实施例提供一种猪伪狂犬病变异病毒毒株，命名为prv sd2020株，prv sd2020毒株的gb、gc、gd、gi、ge和tk基因序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示。
8.另一方面，以prv sd2020毒株为基础进行改造，使其上的gi/ge双基因片段缺失，以构建新的猪伪狂犬病变异病毒基因工程毒株。
9.在一些实施例中，prv sd2020株缺失gi/ge片段为2907bp，构建了新的猪伪狂犬病变异病毒基因工程毒株，命名为prv sd2020δgi/ge株，prv sd2020δgi/ge株的保藏信息如下：
10.保藏编号：no:v202150
11.分类命名：伪狂犬病病毒prv sd2020δgi/ge
12.保藏日：2021/5/25
13.保藏单位：中国典型培养物保藏中心(简称：cctcc)
14.保藏单位地址：中国武汉武汉大学
15.另一方面，以prv sd2020株为基础进行改造，使其上的gi/ge/tk三基因片段缺失，构建新的猪伪狂犬病变异病毒基因工程毒株。
16.在一些实施例中，prv sd2020毒株缺失gi/ge片段为2907bp、缺失tk片段为891bp，构建了新的猪伪狂犬病变异病毒基因工程毒株，命名为prv sd2020δgi/ge/tk株，prv sd2020δgi/ge/tk株的保藏信息如下：
17.保藏编号：no:v202149
18.分类命名：伪狂犬病病毒prv sd2020δgi/ge/tk
19.保藏日：2021/5/25
20.保藏单位：中国典型培养物保藏中心(简称：cctcc)
21.保藏单位地址：中国武汉武汉大学
22.另一方面，本技术实施例还提供了一种猪伪狂犬病变异病毒毒株在制备猪伪狂犬病疫苗的应用，以免疫量的prv sd2020毒株缺失了gi/ge片段或缺失了gi/ge/tk片段的基因工程毒株作为抗原。
23.本技术基于某猪场prv病发体中分离的病毒，经毒力测试和pcr鉴定，确认属于prv病毒，命名为prv sd2020株，并针对该毒株开展了基因测序以及基因缺失毒株构建，对构建的基因缺失株疫苗性能进行研究。
24.本技术实施例采用prv sd2020缺失gi/ge片段或缺失了gi/ge/tk片段的基因工程毒株制备的prv灭活疫苗，具有良好的免疫原性和安全性。
附图说明
25.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
26.图1为vero致病图，其中，图1
‑
a为接种prv sd2020株24h后的显微图，图1
‑
b为接种prv sd2020株48h后的显微图。
27.图2为实施例2中gi/ge缺失前后的pcr检测结果。
28.图3为实施例2中prv sd2020毒株gi/ge缺失后的pcr电泳检测图。
29.图4为实施例2中prv sd2020毒株缺失gi/ge后ifa鉴定ge基因的表达情况图。
30.图5为实施例3中prv sd2020毒株gi/ge/tk缺失前后的pcr电泳检测图。
31.图6为实施例3中prv sd2020毒株缺失gi/ge/tk后测序图。
32.图7为实施例6中各组接种试剂后每日体温监测情况图。
33.图8为实施例7中各组攻毒后每日体温监测情况图
34.图9为实施例7中各组在免疫前、免疫后4周、攻毒后2周时血液中ge抗体含量检测图。
35.图10为实施例7中各组在免疫前、免疫后4周、攻毒后2周时血液中中和抗体含量检测图。
具体实施方式
36.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本技术实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
37.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术的实施例中的特征可以相互结合。
38.实施例1：伪狂犬流行变异强毒株分离与鉴定
39.在来自山东某猪场的流产胎儿进行猪伪狂犬野毒抗原检测，结果为ge抗原阳性，将该阳性病料上清液接种vero细胞进行病毒分离，分离得到一株毒株，对该毒株进行基因鉴定和特异性鉴定，发现该毒株可扩增到prv相应基因(no.1～6)，并且该毒株可以被伪狂犬病毒特异性阳血清中和，鉴定其为prv病毒，命名其为prv sd2020株。
40.prv sd2020株致vero细胞病变如图1所示。图1
‑
a、图1
‑
b分别为接种prv sd2020毒株24h、48h后的情况，由图1可知，prv sd2020毒株特异性地使感染细胞产生典型规律病变(cpe)。
41.prv sd2020株的gb、gc、gd、gi、ge和tk基因序列依次如seq no 1～6所示。
42.取prv sd2020 f7代细胞培养物上清，以2ml
×
106tcid
50
/ml和2mlpbs液分别滴鼻接种55～60日龄健康猪(ge抗原阴性，gb抗体阴性)各5头，连续观察2周试验猪临床表现并监测试验猪体温变化。试验结果表明，prv sd2020株2ml
×
106tcid
50
/ml滴鼻接种试验猪，可使55～60日龄试验猪猪5/5发病，并表现出明显的临床症状，高热40.5℃以上持续3日以上，精神沉郁、食欲降低、呼吸困难或神经症状，而且1头死亡。
43.表1 prv sd2020株毒力测定
44.组别毒株剂量动物头数攻毒途径发病死亡发病率攻毒组prv sd20202ml
×
106tcid
50
/ml5滴鼻51100％对照组pbs2ml5滴鼻000
45.实施例2：猪伪狂犬病毒流行变异强毒株基因工程毒株(prv sd2020δgi/ge株)构建
46.采用crispr/cas9技术敲除prv上的gi/ge双毒力基因，具体过程概述如下：
47.1、sgrna序列设计及重组载体构建
48.参照发表在genbank的prv全基因组序列，设计合成gi、ge基因的sgrna序列，gi、ge基因的sgrna序列见表2，并将其插入到psgrna载体的bbsi酶切位点，构建打靶质粒。
49.表2设计gi/ge sgrna序列
50.通过电泳鉴定pcr扩增产物，电泳结果如图2所示。
51.获得prv sd2020δgi/ge株后，通过基因组提取，pcr扩增获得基因缺失区上下游的基因序列，如seq id no.7所示，再通过测序和多重比对，证实为gi/ge基因缺失，测序结果如图3所示，该图显示该637位点为分界点，该位点处缺失2907bp。
52.(2)间接免疫荧光鉴定
53.bhk21细胞按1:5消化传代，以2ml/孔滴加到含有盖玻片的六孔板中，置37℃5％co2的恒温培养箱中培养，待生长至80％融合时，0.01moi接种prv sdδgi/ge毒株，继续培养2日；收集细胞并固定染色(过程为：弃培养基上清，加入冷pbs 1ml轻轻润洗1次，弃洗液；以80％冷丙酮室温固定细胞6～8分钟，然后以冷pbs洗3次，每次5分钟，再以含有2％bsa的pbs(封闭液)孵育30分钟；孵育prv ge单克隆抗体，再以含有2％bsa的pbs稀释一抗，轻轻加入100μl稀释后一抗，室温孵育60分钟；以pbs洗涤3次，每次5分钟；以含有2％bsa的pbs稀释二抗，轻轻加入100μl稀释后二抗，室温孵育60分钟；以pbs洗涤分钟；以pbs洗涤3次，每次5分钟。)。荧光显微镜下观察拍照，结果如图4所示，亲代毒株prv e6感染细胞后用ge单克隆抗体可检测到特异绿色荧光。而prv sd2020δgi/ge株则在感染细胞后用ge单克隆抗体检测不到特异的荧光。因此，prv sd2020δgi/ge株感染细胞内ge蛋白缺失表达。
54.实施例3：猪伪狂犬病毒流行变异强毒株基因工程毒株(prv sd2020δgi/ge/tk株)构建
55.采用crispr/cas9技术敲除prv上的gi/ge/tk三毒力基因，具体过程概述如下：
56.同样的，参照实施例2过程，进一步设计tk基因靶位点(tk基因sgrna序列见表3)，构建重组载体、转染、使质粒与病毒基因组发生同源重组，然后通过噬斑纯化，获得缺失gi、ge、tk三基因的prv sd2020δgi/ge/tk株，对毒株进行鉴定。
57.表3 tk基因sgrna序列
[0058][0059]
毒株pcr鉴定结果如图5所示，测序的tk序列如seq id no.8所示，峰图文件
[0060]
2、转染
[0061]
按照标准的转染方法(例如ltx或transfectamine2000 protocol)转染打靶质粒，转染后24小时以0.01moi感染prv e6毒株。连续观察3～5日，待出现明显的细胞病变时收集细胞培养物。
[0062]
3、噬斑纯化
[0063]
(1)将vreo细胞消化均匀铺于6孔细胞培养板上，待细胞长成单层后吸去培养液，将收集的细胞培养物分别进行10
‑3、10
‑4倍稀释，向培养板内加入病毒稀释液，37℃吸附2小时后弃残液；
[0064]
(2)将2％的低熔点琼脂糖溶液(42℃保存)与2
×
细胞维持液(42℃保存)按1:1的比例混匀后，以2ml/孔标准加入两培养孔中，使冷却凝固成覆盖层；
[0065]
(3)倒置培养板，置37℃5％co2恒温培养箱中培养；
[0066]
(4)连续观察3～4日，当出现明显的噬斑时，分别收集噬斑(使用1ml的蓝色枪头，提前剪掉尖端部位，然后用移液器直吸取噬斑)，重复以上步骤3次，以获得缺失gi/ge基因单一克隆毒株。
[0067]
4、prv sd2020δgi/ge毒株的鉴定
[0068]
(1)gi/ge基因pcr鉴定
[0069]
将挑出的噬斑下的细胞培养物接种至已长成bhk
‑
21单层细胞的培养板中，待出现明显病变时，收集培养物。取出50μl培养物稀释至200μl，抽提dna进行pcr鉴定。
[0070]
鉴定过程大致如下：
[0071]
pcr鉴定引物序列：
[0072]
f:5
’‑
gcg tgt gcg tct aca tct tct
‑3’
；
[0073]
r:5
’‑
ggt att taa gcg ggg cgg gca t
‑3’
；
[0074]
pcr反应体系(50μl)：2
×
gc buffer 25μl，dntp mixture 5μl，上下游引物各2μl，prime star 0.5μl，cdna模板2μl，h2o 13.5μl。
[0075]
反应条件:94℃预变性1分钟；98℃变性10秒、56℃退火15秒，72℃延伸3秒，共35个循环；72℃延伸5分钟。
[0076]
如图6所示。由图可知，prv sd2020δgi/ge/tk株的tk基因在70和71位碱基因之间缺失891bp。
[0077]
实施例4：猪伪狂犬病毒gi/ge基因缺失株(prv sd2020δgi/ge株)灭活疫苗的制备
[0078]
(1)取检验合格prv sd2020δgi/ge病毒液(病毒含量10
8.5
tcid
50
/ml)加入终浓度为0.05％(v/v)的二乙稀亚胺(bei)，混匀，置30℃恒温摇床中灭活30小时，加入终浓度为2％硫代硫酸钠溶液，37℃摇床中终止2小时，置2～8℃保存。
[0079]
(2)取出抗原和佐剂回温到30℃，然后向乳化罐中输入佐剂1份，以适宜转速(以能形成旋涡为宜)搅拌，再缓慢输入等质量的灭活抗原1份，30℃恒温条件下，350r/mim继续搅拌30～40分钟，即获得乳白色或淡粉红色的油乳剂灭活疫苗。
[0080]
(3)将疫苗定量分装，加盖密封，并粘贴标签，2～8℃保存。
[0081]
实施例5：猪伪狂犬病毒gi/ge/tk基因缺失株(prv sd2020δgi/ge/tk株)活疫苗的制备
[0082]
取检验合格prv sd2020δgi/ge/tk病毒液与一定体积(1:1～1:1.2)的冻干保护(明胶、蔗糖等成分)剂混匀，分装，冻干，制得含prv sd2020δgi/ge/tk株的活疫苗(病毒含量106tcid
50
)。
[0083]
实施例6：疫苗安全性试验
[0084]
挑选21～28日龄健康易感仔猪15头，分成3组，分别为sd1组、sd2组和对照组，sd1组试验猪颈部肌肉注射prv sd2020δgi/ge株灭活疫苗(灭活前含量10
8。5
tcid
50
/ml)4.0ml，sd2组试验猪颈部肌肉注射prv sd2020δgi/ge/tk株活疫苗(10
7。0
tcid
50
/ml)1.0ml，对照组颈部肌肉注射pbs稀释液1.0ml，连续观察14日，并在接种后连续测温7天，观察是否由疫苗引起的局部或全身不良反应。各组体温监测结果如图7所示。
[0085]
表4安全性试验
[0086]
试验分组疫苗免疫数量免疫途径免疫剂量sd1组prv sd2020δgi/ge株灭活疫苗5头颈部肌注2
×
10
8.5
tcid
50
sd2组prv sd2020δgi/ge/tk株活疫苗5头颈部肌注2
×
107tcid
50
对照组pbs5头颈部肌注/
[0087]
观察结果显示，sd1、sd2组中所有免疫猪均存活，而且精神状态良好，行为活动正常，呼吸、采食和排便情况均正常。
[0088]
由图7可知，sd1、sd2中组所有免疫猪体温与注射前相比无异常，与空白对照组相比也无异常；据观察，疫苗注射部位(颈部肌肉)吸收良好，无红肿、脓肿、结痂等异常。表明，prv sd2020δgi/ge株灭活疫苗和prv sd2020δgi/ge/tk株活疫苗具有良好的安全性。
[0089]
实施例7：prv sd2020δgi/ge株灭活疫苗和prv sd2020δgi/ge/tk株活疫苗免疫原性试验
[0090]
挑选21～28日龄prv gb和ge抗体阴性健康仔猪15头，随机分为3组，每组5头，分别为sd1组、sd2组、攻毒对照组；sd1组颈部肌肉注射实施例1疫苗2ml(10
8.5
tcid
50
/ml)，sd2组颈部肌肉注射实施例1疫苗1ml(106tcid
50
/ml)，攻毒对照组不注射，免疫接种后，自由采食，隔离饲养。4周后进行攻毒试验，sd1组、sd2组和对照组分别滴鼻接种2ml(106tcid
50
/ml)prv sd2020株f7代病毒液，每天观察试验猪临床表现，连续观察14天并记录试验猪体温。分别在免疫前、免疫后28日(攻毒前)和攻毒后14日采集试验猪血液，分离血清并检测ge抗体以及中和抗体。
[0091]
表5免疫原性试验
[0092][0093]
攻毒后，sd2组实验猪均精神状态、行为活动正常，采食和排便情况也正常，体温有一例呈一过性升高(超过40.5℃)，但没有超过3个温次，并很快降到正常水平；sd1组实验猪均精神状态、行为活动正常，采食和排便情况也正常，1例试验猪体温升高超过40.5℃，达到3个温次，精神沉郁，其它均正常；而攻毒对照组在攻毒后第3天开始，所有攻毒对照试验猪高热40.5℃以上超过3天(见图8)，并且猪精神沉郁，食欲降低，倒地轻触不起，2头试验呼吸困难，并有一头出现典型神经症状并死亡。
[0094]
免疫攻毒保护试验结果表明，sd2组试验猪获得5/5保护，sd1组试验猪获得4/5保护，而攻毒对照组试验猪5/5发病。各组ge抗体检测结果如图9所示，由图9可知，sd2组试验
猪没有ge抗体阳转，而sd1组试验猪有一头发生阳转，攻毒对照组全部阳转。各组中和抗体检测结果如图10所示，由图10可知，sd1组、sd2组中和抗体滴度在1:8～1:32，攻毒后2周，免疫组中和抗体滴度则快速达到1:256～1:1024，明显高于攻毒对照组。
[0095]
综上所述，试验结果表明由prv sd2020的gi/ge双基因缺失毒株灭活疫苗和gi/ge/tk三基因缺失毒株活疫苗均具有良好的免疫原性，可以使免疫猪获得良好的保护，并且可以有效的阻断ge抗体阳转，这将为伪狂犬净化提供强有力的支持。
[0096]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本技术的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本技术进行了详细的说明，本领域的普通技术人员当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不驱使相应技术方案的本质脱离本技术各实施例技术方案的精神和范围。