一种基于嘌呤-香草醛的钯和铜离子检测荧光探针及其制备方法与应用与流程

一种基于嘌呤
‑
香草醛的钯和铜离子检测荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于嘌呤
‑
香草醛的检测钯和铜离子检测荧光探针及其制备方法与应用。


背景技术：

2.铜元素广泛存在于自然界中，且由于其具有良好的导电性、耐腐蚀性，被广泛地应用于工业和新兴产业中。在中国铜的消费仅次于铝，与此同时，铜是人体中含量排名第三的金属元素，也是人体所必需的微量元素，人体缺乏铜元素会引起贫血，甚至会导致毛发和动脉的异常生长。但一旦人体摄入过多的铜元素，就会引起代谢紊乱，甚至是知觉神经障碍。根据世界卫生组织的标准，饮用水中 cu
2
的最大限量应小于2ppm(31.5μm)。钯虽然不是人体所必需的元素，但是由于其独特的物理和化学性质，被广泛的应用于工业中，如电子产品，医疗器械等领域。正因为应用广泛，钯离子很容易被人摄入到体内。多个研究表明，pd
2
可与dna，蛋白质和其他生物大分子结合生成复合物，这种复合物会导致人类的多种细胞进程受阻。根据欧洲药品评估局的建议，饮食中钯的摄入量为每人每天1.5
‑
15mg。因此，迫切需要开发出能够快速追踪或检测pd
2
和cu
2
的技术。
3.近年来，已报道了多种检测pd
2
和cu
2
的荧光探针，但是关于同时检测pd
2
和cu
2
的嘌呤类荧光探针几乎没有。


技术实现要素：

4.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提提供了一种基于嘌呤
‑
香草醛的钯离子和铜离子检测荧光探针，该荧光探针是一种以嘌呤为母体且能快速并同时检测pd
2
和cu
2
的席夫碱型荧光探针，其对钯离子和铜离子具有专一性识别，响应时间短以及灵敏度高等优点。
5.本发明还提供了基于嘌呤
‑
香草醛的钯离子和铜离子检测荧光探针的制备方法和应用。
6.技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述一种基于嘌呤
‑
香草醛的钯和铜离子检测荧光探针，其结构式如下式i所示：
7.8.本发明所述的基于嘌呤
‑
香草醛的钯和铜离子检测荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
9.先将4,6
‑
二氯
‑5‑
氨基嘧啶和1
‑
萘胺通过取代反应得到中间体ⅱ；再以中间体ⅱ和2
‑
萘甲酸为原料，于有机溶剂中进行合环反应，得到中间体ⅲ；再将中间体ⅲ溶于有机溶剂中与水合肼发生取代反应，得到中间体iv；最后将中间体iv 和香草醛通过缩合反应得到基于嘌呤
‑
香草醛的荧光探针ⅰ；
10.其反应路线如下所示：
[0011][0012]
其中，所述4,6
‑
二氯
‑5‑
氨基嘧啶和1
‑
萘胺加入到有机溶剂中，待固体溶解后加入浓盐酸，回流搅拌，待反应完全后，通过减压蒸馏除去有机溶剂，用naoh 溶解，然后用乙酸乙酯进行萃取，后用减压蒸馏的方法除去乙酸乙酯，用甲醇与水重结晶，得到ⅱ式中间体。
[0013]
进一步地，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇或者异丙醇。
[0014]
作为优选，所述有机溶剂为甲醇。
[0015]
其中，将所述ⅱ式中间体、2
‑
萘甲酸和十二烷基三甲基氯化铵溶于二甲苯中，然后向反应液中缓慢的滴加三氯氧磷，进行回流搅拌，待反应完全后，将反应液完全冷却至室温，通过减压蒸馏除去有机溶剂，柱层析分离提纯得到式ⅲ中间体。
[0016]
作为优选，通过硅胶柱色谱法纯化，使用ch3oh/ch2cl2(v/v，1/250)洗脱，减压蒸馏除去溶剂后得到式ⅲ中间体。
[0017]
其中，所述式ⅲ中间体溶于乙醇后，待固体溶解后，加入水合肼，进行回流搅拌，待反应完全后，将反应物冷却至室温，抽滤，用有机溶剂洗固体，得到式iv中间体。
[0018]
其中，所述式iv中间体和香草醛溶解于有机溶剂中，将混合物料进行回流搅拌，反应完成后，将反应液冷却至室温，有大量淡黄色固体析出，过滤收集后用冷乙醇进行洗涤，得到式i结构的基于嘌呤
‑
香草醛的钯和铜离子检测荧光探针。
[0019]
作为优选，所述有机溶剂为乙醇、丙醇或者异丙醇。
[0020]
进一步地，所述式iv中间体和香草醛溶解于乙醇中，并将混合物在78℃下回流搅拌2小时。反应液冷却至室温后，有大量淡黄色固体析出，过滤收集后用冷乙醇进行洗涤，得
到荧光探针化合物ⅰ。
[0021]
作为优选，本发明探针的合成路线如下所示：
[0022][0023]
其中，式ⅱ中间体为6
‑
氯
‑
n
‑
(萘
‑1‑
基)嘧啶
‑
4,5
‑
二胺,式ⅲ中间体为6
‑
氯
‑9‑ꢀ
(萘
‑1‑
基)
‑8‑
(萘
‑2‑
基)
‑
9h
‑
嘌呤，式iv中间体为6
‑
肼基
‑9‑
(萘
‑1‑
基)
‑8‑
(萘
ꢀ‑2‑
基)
‑
9h
‑
嘌呤，式ⅰ化合物(e)
‑3‑
甲氧基
‑4‑
((2
‑
(9
‑
(萘
‑1‑
基)
‑8‑
(萘
ꢀ‑2‑
基)
‑
9h
‑
嘌呤
‑6‑
基)肼基)甲基)苯酚为本发明所述检测钯和铜离子荧光探针。
[0024]
进一步地，所述制备过程包括：
[0025]
(1)制备中间体ⅱ[0026]
将4,6
‑
二氯
‑5‑
氨基嘧啶和1
‑
萘胺加入到有机溶剂中，待溶解后加入12mol/l 浓盐酸，在65℃下回流搅拌，待反应完全后，减压除去有机溶剂，用1m naoh 溶解，然后用乙酸乙酯进行萃取，减压蒸馏除去乙酸乙酯，用甲醇与水重结晶，得到中间体ⅱ。
[0027]
(2)制备中间体ⅲ[0028]
将所述中间体ⅱ、2
‑
萘甲酸、十二烷基三甲基氯化铵溶解在二甲苯中，然后向反应液中缓慢的滴加pocl3，在80℃下回流搅拌72h。反应完成后，待反应液冷却至室温后，通过减压蒸馏除去有机溶剂得到黑色粘稠状的粗产物，用柱层析分离提纯(ch3oh/ch2cl2(v/v，1/250))，得到白色固体，即为中间体ⅲ。
[0029]
(3)制备中间体iv
[0030]
将所述中间体ⅲ溶解在乙醇中，接着向烧瓶中加入水合肼。将混合物在65℃下回流搅拌3小时。反应完成后(通过tlc监测)，将反应混合物冷却至室温，有大量黄色固体物质析出，过滤后用大量冷乙醇进行洗涤，烘干得到白色固体物质，即为中间体iv。
[0031]
(4)制备基于嘌呤
‑
香草醛的检测钯和铜离子荧光探针ⅰ[0032]
将中间体iv和香草醛溶解在乙醇中，并将混合物在78℃下回流搅拌2h。反应液冷
却至室温后，有大量淡黄色固体析出，过滤收集后用冷乙醇进行洗涤，得到荧光探针化合物ⅰ。
[0033]
本发明所述的荧光探针在检测溶液中钯和铜离子中的应用。
[0034]
本发明采用的席夫碱骨架是结合金属离子的有效配体，同时在考虑嘌呤和香草醛的基础上,制备了新型荧光探针。本发明中使用的嘌呤类衍生物不仅拥有一个大的平面共轭结构，且它的结构中含有多个氮原子，可供给金属进行配位。香草醛广泛存在于甜菜、香草豆等天然植物中，是一种广泛使用的可食用香料，此外，本发明香草醛其具有出色的荧光团，它含有一个强的供体位点，如苯氧原子，提供孤电子对，作为配位原子与铜或者钯离子金属离子形成配位键，同时香草醛具有醛基可发生席夫碱反应可以作为合成席夫碱的原料。本发明以嘌呤衍生物和香草醛为荧光基团，合成了一种新型的基于嘌呤
‑
香草醛的铜和钯离子检测荧光探针分子，填补了关于同时检测pd
2
和cu
2
的嘌呤类荧光探针几乎没有的技术空白，本发明中同时检测pd
2
和cu
2
是指该探针既可以检测pd
2
又可以检测 cu
2
。
[0035]
本发明制备的探针：
[0036]
1、可快速定性金属离子类别，荧光探针分子在多组分金属离子存在的情况下，也能够快速而精确的对特定的金属离子进行识别与络合。从而产生特定的物理现象改变，指示出样品中是否含有该种金属离子。
[0037]
2、可精确定量金属离子浓度
[0038]
荧光探针分子与特定的金属离子络合，完全符合朗伯比尔定律，即某一波长光的吸收强弱与吸收光物质的浓度之间成线性关系。依据多次试验所得数据，可对朗伯比尔定律曲线进行拟合，即可得到金属离子浓度与特定吸收光强度之间的关系，从而达到精确定量的效果。
[0039]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0040]
本发明以嘌呤环和香草醛为荧光基团，水合肼为连接基团，合成了一种基于嘌呤
‑
香草醛的钯和铜离子荧光探针，本发明探针的制备方法简单方便，易工业化生产应用，操作简单、对设备依赖性小、无需复杂前处理、检测限低；选用嘌呤类衍生物为钢性平面，它在杂环上具有9个中心原子，电子离域大，且环中的四个氮原子为金属离子提供了潜在的配位点；选用香草醛为合成席夫碱的原料，其具有出色的荧光团，它含有一个强的供体位点，如苯氧原子。该荧光探针对钯和铜离子具有专一性识别，响应时间短，灵敏度高，对溶液中痕量pd
2
和cu
2
表现出高灵敏度和高选择性。
附图说明
[0041]
图1为实施例1中制得的钯和铜离子检测荧光探针在dmso/h2o(v/v＝3:2) 溶液中对荧光探针本身和加入钯离子(pd
2
)和铜离子(cu
2
)后的荧光探针的紫外吸收对比光谱图；
[0042]
图2为实施例1中制得的钯离子和铜离子检测荧光探针在dmso/h2o (v/v＝3:2)溶液中对不同金属离子选择性荧光光谱图；
[0043]
图3为实施例1中制得的钯离子和铜离子检测荧光探针在dmso/h2o (v/v＝3:2)溶液中对不同浓度钯离子(pd
2
)和铜离子(cu
2
)的荧光光谱响应图；左图为探针在dmso/h2o溶液中用pd
2
(0
‑
5equiv，0
‑
50μm，曲线由上到下) 滴定时的荧光光谱；右图为探针在dmso/h2o
溶液中用cu
2
(0
‑
5equiv，0
‑
50μm，曲线由上到下)滴定时的荧光光谱。
[0044]
图4为实施例1中制得的钯离子和铜离子检测荧光探针在dmso/h2o (v/v＝3:2)溶液中对不同金属离子选择干扰性检测的荧光响应图；
[0045]
图5为实施例1中制得的钯离子和铜离子检测荧光探针检测钯和铜离子时的响应时间图；
[0046]
图6为实施例1中制得的钯离子和铜离子检测荧光探针在dmso/h2o (v/v＝3:2)与钯离子(pd
2
)和铜离子(cu
2
)络合比的job’s
‑
plot曲线；
[0047]
图7为实施例1中制得的钯离子和铜离子检测荧光探针与不同浓度的钯离子 (pd
2
)和铜离子(cu
2
)所制备的探针试纸；
[0048]
图8为实施例1中制得的钯离子和铜离子检测荧光探针的质谱ms谱图；
[0049]
图9为实施例1中制得的钯离子和铜离子检测荧光探针的核磁共振1h
‑
nmr 谱图；
[0050]
图10为实施例1中制得的钯离子和铜离子检测荧光探针的核磁共振
13
c
‑
nmr谱图。
具体实施方式
[0051]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0052]
本发明中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实验所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所选用的以下所有试剂皆为市售分析纯或化学纯。
[0053]
其中，实施例中的各种金属离子溶液是由纯度为99％以上的氯化盐化学试剂如、无水氯化钯、无水氯化镉、无水氯化铁等加去离子水配置而成的。
[0054]
实施例1
[0055]
基于嘌呤
‑
香草醛的钯和铜离子检测荧光探针，采用如下方法制备而成：
[0056]
(1)制备中间体ⅱ(6
‑
氯
‑
n4‑
(萘
‑1‑
基)嘧啶
‑
4,5
‑
二胺)
[0057]
在50ml圆底烧瓶中，加入4，6
‑
二氯
‑5‑
氨基嘧啶(2.50g，15mmol)和 1
‑
萘胺(4.29g，30mmol)，并溶解在甲醇(25ml)中，再逐滴缓慢加入浓hcl (98％，2.5ml，30mmol)，在65℃下回流搅拌5天。待反应液冷却至室温后，首先过滤掉反应液中析出的固体物质，接着通过减压蒸馏除去溶剂，得到暗紫色的粗产物。向粗产物中加入1m的naoh溶液(25ml)进行溶解，并用乙酸乙酯萃取(3
×
25ml)，合并并干燥有机相后，进行减压蒸馏后得到粗产物。最后将得到的粗产物用ch3oh/h2o(v/v,1:5)进行重结晶得到浅紫色固体(2.87g, 70％),即为中间体ii。
[0058]
所得中间体ⅱ的结构式为：
[0059][0060]
(2)制备中间体ⅲ(6
‑
氯
‑9‑
(萘
‑1‑
基)
‑8‑
(萘
‑2‑
基)
‑
9h
‑
嘌呤)
[0061]
将中间体ⅱ(1.00g，3.70mmol)，2
‑
萘甲酸(3.19g，18.50mmol)和十二烷基三甲基
氯化铵(0.10g，10％mmol)溶解在25ml二甲苯中，然后向反应液中缓慢的滴加pocl3(25ml)，在80℃下搅拌72h。反应完成后，待反应液冷却至室温后，减压蒸馏，得到黑色粘稠状的粗产物，用柱层析分离提纯(ch3oh/ ch2cl2(v/v，1/250))，得到白色固体(0.62g,48％)，即为中间体ⅲ。
[0062]
所得中间体ⅲ的结构式为：
[0063][0064]
(3)制备中间体iv(6
‑
肼基
‑9‑
(萘
‑1‑
基)
‑8‑
(萘
‑2‑
基)
‑
9h
‑
嘌呤)
[0065]
将中间体ⅲ(212mg，0.8mmol)溶解在20ml的乙醇中，接着向烧瓶中(0.25 mg，4mmol)加入水合肼。将混合物在65℃下回流搅拌3小时。反应完成后(通过tlc监测)，将反应混合物冷却至室温，有大量黄色固体物质析出，过滤后固体用大量冷乙醇进行洗涤，干燥得到白色固体物质(192mg,83％)，即为中间体iv。
[0066]
所得中间体iv的结构式为：
[0067][0068]
(4)制备基于嘌呤
‑
香草醛的钯和铜离子检测荧光探针ⅰ[0069]
将中间体iv(200mg,0.56mmol)和香草醛(128mg,0.84mmol)溶解在 25ml乙醇中，并将混合物在78℃下回流搅拌2小时。反应液冷却至室温后，有大量淡黄色固体析出，过滤收集后用冷乙醇进行洗涤，干燥得到探针化合物 (phm)，为白色固体(217mg，80％)。
[0070]
所得到的荧光探针化合物结构式为：
[0071][0072]
本发明制得的检测钯离子和铜离子荧光探针1h
‑
nmr(400mhz,dmso
‑
d6) δ12.01
–
11.68(m,1h),8.46
–
8.17(m,3h),7.93(ddd,j＝31.9,8.5,5.6hz,5h), 7.70
–
7.60(m,1h),7.53
–
7.44(m,5h),7.42(d,j＝3.9hz,2h),7.30(t,j＝7.7hz, 1h),7.08(d,j＝8.1hz,1h),6.80(d,j＝8.1hz,1h).
[0073]
13
c
‑
nmr(100mhz,dmso
‑
d6)δ153.07,150.23,149.13,148.37,133.81, 133.20,
131.70,131.42,130.28,130.15,129.87,129.09,128.52,128.42,127.76, 127.63,127.35,127.19,126.97,126.62,126.18,125.64,124.82,122.78,121.84, 118.55,115.63,109.07,79.50,56.34,55.21,18.85.
[0074]
esi
‑
ms:calcd for[m h]

536.6,found 537.0.
[0075]
实施例1中制得的荧光探针的质谱ms谱图、核磁共振1h
‑
nmr谱图、核磁共振
13
c
‑
nmr谱图分别如图8、图9和图10所示，说明本发明的荧光探针成功合成。
[0076]
实施例2
[0077]
将实施例1制得的钯和铜离子检测荧光探针用二甲基亚砜配置成1mm的探针储备液，各金属离子用去离子水配置成3mm的金属离子储备液，向3ml的空白溶液dmso/h2o(v/v＝9：1)中加入30μl的探针储备液和50μl的金属离子储备液并用荧光光谱仪和紫外分光光度计进行检测，测试得知荧光探针的最大激发波长为352nm，最大发射波长为425nm，具体测试结果如下：
[0078]
向3ml的空白储备液(dmso/h2o solution(9/1,v/v,ph 7.4,hepes buffer, 0.2mm))中先加入30μl的探针储备液，再其中加入50μl的cu
2
或者pd
2
储备液，静置半小时后进行紫外光谱的测试。如图1所示，探针在352nm处的吸光度较强，继续向探针溶液中加入cu
2
或者pd
2
后，峰值所对应的波长发生了蓝移(从352nm到287nm/302nm)发生蓝移的主要原因产生了探针
‑
cu
2
和探针
ꢀ‑
pd
2
络合物。因此，该探针在检测pd
2
和cu
2
可作为肉眼可见的比色探针，如图1所示，探针在350nm处具有明显的吸收峰。
[0079]
如图2所示，荧光探针加入各种金属离子后的荧光光谱图。向3ml的空白溶液dmso/h2o(v/v＝9：1)中分别加入30μl的探针储备液和50μl的各种金属离子储备液，实验结果表明探针自身就有较强的荧光，在添加其他金属离子储备液后，荧光强度未发生明显的变化。但是，向探针溶液中分别加入pdcl2,cucl2·
2h2o后，荧光强度骤然下降，产生了荧光淬灭的现象，与此同时，溶液从无色到浅黄色。上述结果表明，本实验发明的荧光探针对cu
2
和pd
2
有很好的选择性。
[0080]
此外，如图2所示，探针溶液在加入其他金属离子时，如zn
2
，sn
2
，fe
3
， fe
2
，na

，mn
2
，al
3
，ca
2
，ba
2
，k

，cd
2
，mg
2
，ag

，cs
2
，pb
2
，cr
3
，在452nm处会发射出很强的荧光。而加入pd
2
时，探针溶液的荧光会被完全淬灭。加入cu
2
时，探针溶液的荧光部分淬灭。该结果清楚地表明，探针具有对 pd
2
和cu
2
的高选择性，且可通过淬灭后荧光强度对pd
2
和cu
2
进行区分。
[0081]
如图3所示，为本发明的荧光探针对不同浓度钯和铜离子的荧光光谱响应图。向3ml的空白储备液dmso/h2o(v/v＝9：1)中加入30μl的探针储备液和分别加入0～50μl(0、1、2、3
……
40、45、50μl)的钯离子或者铜离子储备液。当pd
2
浓度逐渐增加时，探针在480nm处的荧光强度在缓慢下降，最终荧光强度稳定在了3.0
×
104。在刚加入cu
2
时，荧光强度渐渐降低，但加入cu
2
的浓度大于2个当量比时(20μm)，荧光强度突然降低，说明溶液中所有游离的探针分子都与cu
2
发生了络合。
[0082]
为了确保探针在检测pd
2
和cu
2
不受外界干扰，设计了两组竞争性实验。即在各个3ml的空白储备液dmso/h2o(v/v＝9：1)中加入30μl的探针储备液和50μl的其他任意一种金属离子储备液包括cdcl2,fecl3,sncl2·
2h2o, cacl2,fecl2·
4h2o,cucl2·
2h2o,mgcl2·
6h2o,cocl2·
6h2o,zncl2,,pdcl2,nacl, mncl2,agno3,cs2co3和pb(no3)2。紧接着分别向样品
中加入50μl的钯离子或铜离子储备液。结果如图4所示，向探针溶液中加入除pd
2
或cu
2
以外的其他金属离子，静置后进行荧光测试(红色条状图，较高条状图)发现上述样品都有较强的荧光，且和探针自身的荧光强度几乎相同。紧接着向样品中加入pd
2
或者cu
2
的储备液，再次静置后进行荧光测试(黑色条状图，较低条状图)，发现上述样品的荧光都发生了淬灭，是因为形成了无荧光的稳定的配合物。通过上述实验表明探针有较强的抗干扰能力，可用于复杂环境中检测pd
2
和cu
2
。
[0083]
在3ml的空白溶液dmso/h2o(v/v＝9：1)中加入30μl的探针储备液和分别加入50μl的钯离子或者铜离子储备液，每间隔1分钟测试一次样品的荧光强度。如图5所示，探针自身发射出很高的荧光强度，在探针溶液中分别加入cu
2
、 pd
2
后1
‑
2分钟内，荧光强度立即降至最低值，并在随后的十分钟内保持稳定。上述结果都表明，探针对于cu
2
、pd
2
的检测快速且稳定，因此该探针有很好的应用前景。
[0084]
如图6所示，通过job's plot方法研究了荧光探针与pd
2
和cu
2
的结合率，向3ml的空白溶液dmso/h2o(v/v＝9：1)中加入一定体积探针储备液(1mm) 和分别加入pd
2
或者cu
2
储备液(均为3mm)，检测钯和铜离子荧光探针和钯或者铜离子的浓度总和为50μm，通过改变二者的浓度比(荧光探针和金属离子物质的量比依次为1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1) 得到352nm处的荧光强度与该浓度下金属离子荧光探针化合自身荧光强度的差值，与离子占总浓度的比例作图。由图6，当探针 pd
2
的值为0.61时达到最大峰值；当探针 cu
2
的值为0.5时达到最大峰值。这表明探针与pd
2
和cu
2
的化学计量比分别为2:1和1:1。由此，可以得出探针与pd
2
/cu
2
的结合方式。
[0085]
如图7，以固体形式检测pd
2
和cu
2
的应用。将滤纸浸入含有探针(10mm) 的dmso
‑
h2o(v/v＝9：1)储备溶液中，浸泡半小时，干燥后分别放置在不同浓度(0、0.1、0.3、0.5和1.0mm)的钯离子或者铜离子的溶液中浸泡30分钟，干燥后，在365nm紫外灯下记录它们的荧光颜色。如图7所示，滤纸的颜色从强的蓝色荧光变成暗淡的灰黑色，也就是说，从肉眼就能分辨出是否有pd
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和 cu
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的存在，同时说明本发明的探针可以以固体状态检测钯离子和铜离子。