一种金属离子递送载体及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种金属离子递送载体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.癌症在社会中已成为威胁人类健康并影响正常生活质量的主要疾病之一，而关于癌症的诊断方法也日新月异，其中对癌症的病灶部位成像在癌症的治疗过程中起到重要的辅助作用。
3.磁共振成像(magnetic resonance imaging，mri)是继x
‑
射线ct之后出现的另一重要成像技术，对医疗实践产生了巨大影响，在临床成像中，为了提高病变部位与正常组织间信号的对比度，超过35％的诊断需要使用造影剂。磁共振造影剂是一类能缩短成像时间、提高成像对比度和清晰度、显示组织器官功能状态的诊断用药，目前用于临床磁共振成像诊断的造影剂主要为小分子钆或锰等顺磁性金属离子，这些小分子造影剂对大脑和中枢神经系统等具有良好的成像效果，但其细胞外分布及较快的肾脏代谢限制了其应用，不能满足组织、器官选择性的要求，因此，开发造价低廉、低毒性、弛豫效能高且对特定组织或器官具有选择性或靶向性的造影剂，是目前磁共振造影剂的发展方向。
4.cn1966088a公开了一种阿拉伯半乳聚糖为载体的磁共振成像造影剂，该造影剂是由乙二胺四乙酸或二乙三胺五乙酸单n
‑
羟基琥珀酰亚胺活性酯或乙二胺四乙酸、二乙三胺五乙酸的双酸酐通过一个短的连接臂与胺化阿拉伯半乳聚糖反应，通过形成酰胺键将乙二胺四乙酸或二乙三胺五乙酸连接到阿拉伯半乳聚糖分子上，进一步与顺磁性金属离子锰、铁或镧系稀土元素的二价或三价离子配位而获得配合物。它们具有较高的弛豫效率、明显的肝脏选择性和相当低的急性毒性，但其仅具有肝脏选择性，难以满足多种癌症检测需求。
5.综上所述，提供一种能够高效负载顺磁性金属离子造影剂的载体，且具备高效肿瘤靶向性，对于肿瘤诊断领域具有重要意义。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种金属离子递送载体及其制备方法和应用，所述金属离子递送载体包括融合有组氨酸标签的铁蛋白，能够高效装载金属离子，且能够特异结合肿瘤细胞和/或肿瘤组织，并进入肿瘤细胞，因此可负载金属离子造影剂应用于体内肿瘤成像诊断。
7.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种金属离子递送载体，所述金属离子递送载体包括铁蛋白和融合在所述铁蛋白上的组氨酸标签，所述组氨酸标签融合于所述铁蛋白的羧基端。
9.本发明中，所述铁蛋白能特异识别肿瘤细胞，并能通过内吞作用进入细胞，此外，所述铁蛋白是一种空心球状颗粒，铁蛋白内腔的羧基端(c端)融合的组氨酸能够与金属离子结合，从而负载金属离子，因此，本发明的金属离子递送载体能够靶向性地将金属离子递
送至肿瘤细胞内。
10.优选地，所述组氨酸标签中组氨酸的个数为5～11个，包括但不限于6个、7个、8个、9个或10个。
11.根据本发明，能够特异性识别肿瘤细胞或肿瘤组织的铁蛋白均能应用于本发明。
12.优选地，所述铁蛋白包括人重链铁蛋白(hfn，包括seq no id.1所示的氨基酸序列)和/或人轻链铁蛋白。
13.根据本发明，人重链铁蛋白能够识别细胞膜上的转铁蛋白受体(tfr1)，肿瘤细胞膜上的tfr1表达量通常远高于普通细胞，因此铁蛋白能够靶向肿瘤细胞，并会被tfr1介导通过内吞作用进入细胞。
14.优选地，所述组氨酸标签通过linker融合于所述铁蛋c端。
15.优选地，所述linker的氨基酸序列包括ggsgg。
16.优选地，所述组氨酸标签包括seq no id.2所示的氨基酸序列。
17.优选地，所述金属离子递送载体包括seq no id.3所示的氨基酸序列。
18.seq no id.1：
19.mttastsqvrqnyhqdseaainrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyflhqsheerehaeklmklqnqrggriflqdikkpdcddwesglnamecalhleknvnqsllelhklatdkndphlcdfiethylneqvkaikelgdhvtnlrkmgapesglaeylfdkhtlgdsdnes。
20.seq no id.2：
21.hhhhhhhh。
22.seq no id.3：
23.mttastsqvrqnyhqdseaainrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyflhqsheerehaeklmklqnqrggriflqdikkpdcddwesglnamecalhleknvnqsllelhklatdkndphlcdfiethylneqvkaikelgdhvtnlrkmgapesglaeylfdkhtlgdsdnesggsgghhhhhhhh。
24.第二方面，本发明提供一种核酸序列，所述核酸序列包括第一方面所述的金属离子递送载体的编码基因。
25.优选地，所述编码基因包括seq no id.4所示的核酸序列。
26.seq no id.4：
27.atgaccaccgcgagcaccagccaggtgcgccagaactatcatcaggatagcgaagcggcgattaaccgccagattaacctggaactgtatgcgagctatgtgtatctgagcatgagctattattttgatcgcgatgatgtggcgctgaaaaactttgcgaaatattttctgcatcagagccatgaagaacgcgaacatgcggaaaaactgatgaaactgcagaaccagcgcggcggccgcatttttctgcaggatattaaaaaaccggattgcgatgattgggaaagcggcctgaacgcgatggaatgcgcgctgcatctggaaaaaaacgtgaaccagagcctgctggaactgcataaactggcgaccgataaaaacgatccgcatctgtgcgattttattgaaacccattatctgaacgaacaggtgaaagcgattaaagaactgggcgatcatgtgaccaacctgcgcaaaatgggcgcgccggaaagcggcctggcggaatatctgtttgataaacataccctgggcgatagcgataacgaaagctaaggtagcggcggtggccatcaccatcatcaccaccatcac。
28.第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包括第二方面所述的核酸序列。
29.第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞包括第二方面所述的核酸序列或第三方面所述的表达载体。
30.第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的金属离子递送载体的制备方法，所述制备方法包括：
31.构建铁蛋白和组氨酸标签融合表达载体，将所述铁蛋白和组氨酸标签融合表达载体导入细胞进行表达，随后进行纯化处理，得到所述金属离子递送载体。
32.优选地，所述铁蛋白和组氨酸标签融合表达载体的构建方法包括：
33.合成铁蛋白和组氨酸标签融合核酸序列，所述融合核酸序列中组氨酸标签核酸序列位于铁蛋白核酸序列的3’端，将所述融合核酸序列插入表达载体，得到所述铁蛋白和组氨酸标签融合表达载体。
34.优选地，所述表达载体包括质粒载体或慢病毒载体。
35.优选地，所述质粒载体包括pet
‑
30a。
36.本发明中，所述金属离子递送载体可以通过静脉、皮下、动脉或者局部的方式作用于患恶性肿瘤的患者。
37.第六方面，本发明提供一种造影剂，所述造影剂包括金属离子和第一方面所述的金属离子递送载体。
38.优选地，所述金属离子包括放射性金属离子、用于磁共振成像的金属离子(如锰离子、钡离子等)或营养所需的金属离子(如铁离子、锌离子等)中的任意一种或至少两种的组合。
39.优选地，所述金属离子包括gd
3
和/或
64
cu
2
。
40.第七方面，本发明提供一种第六方面所述的造影剂的制备方法，所述造影剂的制备方法包括：
41.将所述金属离子递送载体和金属离子混合，加热，随后降温，得到所述造影剂。
42.本发明中，通过加热法装载金属离子，在温度较高的情况下，金属离子递送载体蛋白壳亲水性通道受热扩张，使金属离子易于进入蛋白壳，并与蛋白壳内表面的组氨酸标签结合，当温度降低，亲水性通道恢复封闭状态，因此可负载金属离子。
43.优选地，所述加热的温度为50～70℃，包括但不限于51℃、52℃、53℃、55℃、60℃、62℃、64℃、66℃或68℃。
44.优选地，所述加热的时间为1～3h，包括但不限于1.1h、1.2h、1.3h、1.4h、1.5h、2h、2.2h、2.4h、2.6h或2.8h。
45.优选地，所述降温至20～30℃，包括但不限于21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃或29℃。
46.第八方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的金属离子递送载体或第六方面所述的造影剂。
47.优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂、助溶剂或保湿剂中的任意一种或至少两种的组合。
48.第九方面，本发明提供如第一方面所述的金属离子递送载体、第二方所述的核酸序列、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组细胞、第六方面所述的造影剂或第八方面所述的药物组合物在制备肿瘤磁共振成像检测产品中的应用。
49.优选地，所述肿瘤包括恶性肿瘤和癌症，尤其是人体实质性肿瘤(例如，肺、卵巢癌，乳腺、肠胃、结肠、胰腺、膀胱、肾、前列腺、脑等)以及各种造血系统癌(例如，hodgkin氏
疾病、非hodgkin氏淋巴癌、白血病等)。
50.优选地，所述肿瘤包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌或黑色素瘤中的任意一种或至少两种的组合。
51.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
52.(1)本发明的金属离子递送载体包括c端融合组氨酸标签的铁蛋白，铁蛋白具有壳状结构，内腔的c端融合有组氨酸标签，能够与金属离子结合，负载金属离子，外壳能够特异结合肿瘤细胞和肿瘤组织上的受体，能够被内吞进入肿瘤细胞，从而将金属离子递送至肿瘤细胞内；
53.(2)本发明的金属离子递送载体能够高效负载gd
3
和/或
64
cu
2
。
附图说明
54.图1a为人重链铁蛋白(c端无融合组氨酸标签)的分子筛检测结果；
55.图1b为人重链铁蛋白(c端无融合组氨酸标签)的冷冻电镜检测结果；
56.图1c为人重链铁蛋白(c端融合组氨酸标签)的分子筛检测结果；
57.图1d为人重链铁蛋白(c端融合组氨酸标签)的冷冻电镜检测结果；
58.图2为hfn
‑
his融合蛋白负载金属离子示意图；
59.图3为eds能谱分析hfn
‑
his融合蛋白装载gd
3
结果图；
60.图4为hplc分子排阻分析hfn
‑
his融合蛋白装载
64
cu
2
结果图。
具体实施方式
61.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
62.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
63.实施例1
64.本实施例提供一种金属离子递送载体，所述金属离子递送载体为c端融合有组氨酸标签(his tag)的人重链铁蛋白(hfn)，氨基酸序列如seq no id.3示，所述金属离子递送载体的制备方法包括以下步骤：
65.(1)将组氨酸(his)标签核酸序列(seq no id.5)加到人重链铁蛋白的核酸序列(seq no id.6)的3’端，且位于终止密码子之前，即为融合表达核酸序列；
66.seq no id.5：
67.ggtagcggcggtggccatcaccatcatcaccaccatcac。
68.seq no id.6：
69.atgaccaccgcgagcaccagccaggtgcgccagaactatcatcaggatagcgaagcggcgattaaccgccagattaacctggaactgtatgcgagctatgtgtatctgagcatgagctattattttgatcgcgatgatgtggcgctgaaaaactttgcgaaatattttctgcatcagagccatgaagaacgcgaacatgcggaaaaactgatgaaactgcagaaccagcgcggcggccgcatttttctgcaggatattaaaaaaccggattgcgatgattgggaaagcggcctgaa
cgcgatggaatgcgcgctgcatctggaaaaaaacgtgaaccagagcctgctggaactgcataaactggcgaccgataaaaacgatccgcatctgtgcgattttattgaaacccattatctgaacgaacaggtgaaagcgattaaagaactgggcgatcatgtgaccaacctgcgcaaaatgggcgcgccggaaagcggcctggcggaatatctgtttgataaacataccctgggcgatagcgataacgaaagctaa。
70.(2)基因合成所述融合表达核酸序列，两端酶切位点为ned i和bamh i，并构建到质粒pet
‑
30a上，得到表达载体；
71.(3)将所述表达载体转化入大肠杆菌(escherichia colibl21(de3))，涂板，挑单克隆，表达纯化，得到融合蛋白(hfn
‑
his)，即为所述金属离子递送载体。
72.通过利用蛋白纯化仪akta avant 150和分子排阻层析柱hiload 16/600superdex 200pg表征蛋白的分子量和纯度，利用冷冻电镜成像的方法(样品用乙酸铀复染，电镜仪器型号为thermo fisher scientific,model no.fei titan krios)表征蛋白的壳状形貌，以此鉴定所述金属离子递送载体，以人重链铁蛋白为对照，结果如图1a
‑
图1d所示，由图1a
‑
图1d可知，人重链铁蛋白的c端融合组氨酸标签前后，铁蛋白的结构没有发生变化，表明添加组氨酸标签并不会影响铁蛋白结构。
73.实施例2
74.本实施例利用实施例1制备的金属离子递送载体装载金属离子gd
3
，包括以下步骤：
75.(1)将1mm的金属离子递送载体(即hfn
‑
his融合蛋白)和gd(no3)3混合，在60℃的水浴下，磁力搅拌2小时，hfn
‑
his融合蛋白在60℃的温度下，蛋白壳上的通道受热扩张增大，使得gd
3
离子更易进入蛋白壳，并与蛋白壳内表面的his tag结合，随后降温至25℃，蛋白壳上的通道收缩，与his tag结合的gd
3
离子就被“锁”在了金属离子递送载体的内部，如图2所示；
76.(2)钆(gd)是重金属元素，gd
3
离子能引起蛋白沉淀变性，故12000rpm离心30min，将沉淀变性的hfn
‑
his融合蛋白去除，上清置于透析袋中(viskase,cat.no.md34
‑
14)，随后置于5l体积的20mm tris
‑
hcl(ph 8.0)溶液中，于4℃透析12小时，去除游离的gd
3
离子，得到蛋白溶液即为装载有gd
3
离子的hfn
‑
his融合蛋白；
77.(3)将上述样品超滤浓缩(超滤管，vivaspin 20ultrafiltration tube，sartorius cat.no.vs2042
‑
1)，得高浓度的装载有gd
3
离子的hfn
‑
his融合蛋白(gd
3
‑
hfn
‑
his蛋白)样品；
78.(4)将上述浓缩后的gd
3
‑
hfn
‑
his蛋白样品过分子筛(hiload 16/600superdex 200pg,ge cat.no.28
‑
9893
‑
35)，即得单分散的gd
3
‑
hfn
‑
his蛋白样品。
79.通过利用场发射透射电镜测试(仪器型号为jem 2100f)对样品进行eds能谱分析，结果如图3所示，表明hfn
‑
his重组蛋白内装载有gd
3
金属离子(每个蛋白壳内装载有约30～40个gd
3
金属离子)。
80.实施例3
81.本实施例利用实施例1制备的金属离子递送载体装载金属离子
64
cu
2
，包括以下步骤：
82.(1)将0.1mm的hfn
‑
his融合蛋白和cu
2
离子混合，在60℃的水浴下，磁力搅拌1小时，hfn
‑
his融合蛋白在60℃的温度下，蛋白壳上的通道受热扩张增大，使得
64
cu
2
离子更易
进入蛋白壳，并与蛋白壳内表面的his tag结合，降温至25℃，蛋白壳上的通道收缩，与his tag结合的
64
cu
2
离子就被“锁”在了hfn
‑
his融合蛋白的内部，如图2所示；
83.(2)铜(cu)是重金属元素，
64
cu
2
离子能引起蛋白沉淀变性，故12000rpm离心30min，将沉淀变性的hfn
‑
his融合蛋白去除，上清用pd
‑
10脱盐柱(ge healthcare life sciences，cat.no.17
‑
0851
‑
01)进行纯化，去除游离的
64
cu
2
离子，得到蛋白溶液即为装载有
64
cu
2
离子的hfn
‑
his融合蛋白；
84.(3)将上述样品超滤浓缩(超滤管，vivaspin 20ultrafiltration tube，sartorius cat.no.vs2042
‑
1)，得高浓度的装载有
64
cu
2
离子的hfn
‑
his融合蛋白(
64
cu
2
‑
hfn
‑
his蛋白)样品；
85.(4)将上述浓缩后的
64
cu
2
‑
hfn
‑
his蛋白样品过分子筛(hiload 16/600superdex 200pg，ge cat.no.28
‑
9893
‑
35)，即得单分散的64cu
2
‑
hfn
‑
his蛋白样品。
86.通过利用液相色谱(hplc)进行分子排阻分析(仪器型号为agilent,model no.1260infinity ii，并装配有uv和γ
‑
检测器，检测器型号为ustc chuangxin co.ltd.,model no.gc
‑
1200)，结果如表4所示，表明hfn
‑
his重组蛋白内装载有
64
cu
2
金属离子(每个蛋白壳内装载有约30～40个
64
cu
2
金属离子)。
87.综上所述，本发明的金属离子递送载体包括c端融合组氨酸标签的铁蛋白，铁蛋白具有壳状结构，内腔的c端融合有组氨酸标签，能够与金属离子结合，负载金属离子，外壳能够特异结合肿瘤细胞和肿瘤组织上的tfr1，且与tfr1结合后，能够被内吞进入肿瘤细胞，从而将金属离子递送至肿瘤细胞内，可实现高效负载gd
3
和/或
64
cu
2
。
88.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。