一种抗体纯化过程中配基脱落的复合物去除方法与流程

1.本发明属于基因工程抗体制备技术领域，尤其涉及一种抗体纯化过程中配基脱落的复合物去除方法。


背景技术：

2.现有技术通常会通过阴阳离子柱、疏水柱等方式去除脱落的配基及其复合物，不是特异性的去除，且去除条件要经过各种摸索，去除的同时有些会增大样本体积，导致损失率增加。


技术实现要素：

3.本发明提供一种纯化程度高、抗体回收率高、洗脱体积小、过程损失率低的抗体纯化过程中配基脱落的复合物去除方法。
4.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种抗体纯化过程中配基脱落的复合物去除方法，其包括以下步骤：
5.1)真核蛋白表达：对b1蛋白和b2蛋白进行蛋白质表达设计，然后进行质粒构建和质粒提取，完成质粒提取后转染到目标细胞中进行表达；
6.2)蛋白纯化和鉴定：对表达的蛋白分别进行纯化，去除宿主残留蛋白和内毒素等，得到纯度较高的b1蛋白和b2蛋白，对蛋白进行鉴定；
7.3)蛋白偶联：将b1蛋白和b2蛋白按照一定的比例偶联成b1
‑
b2聚合物，去除该聚合物中未偶联的残余蛋白，保证聚合物含量在90％以上；
8.4)聚合物
‑
亲和柱偶联：将b1
‑
b2聚合物以一定的比例定向偶联于亲和柱上，并形成聚合物亲和柱，封闭未结合聚合物的位点；
9.5)配基脱落去除：对抗体进行亲和纯化，将中和后的抗体与聚合物亲和柱混合以去除配基复合物；
10.6)收样入库：收集去除配基复合物的流穿液，经过透析或者脱盐，收样入库；
11.7)聚合物亲和柱回收：通过低ph酸碱或者盐洗脱挂在聚合物亲和柱柱上的复合物，柱子再生后，可重复用于下一批次纯化。
12.作为上述技术方案的进一步描述：
13.所述步骤1)中的目标细胞为293细胞。
14.作为上述技术方案的进一步描述：
15.所述步骤3)中去除残余蛋白的方式为离子交换或氧化还原。
16.作为上述技术方案的进一步描述：
17.所述步骤4)中的亲和柱为预活化的琼脂糖骨架或葡聚糖骨架。
18.作为上述技术方案的进一步描述：
19.所述步骤4)中，测试亲和柱耐受的ph范围、盐离子种类和酸碱性能，筛选出最佳的偶联方式。
20.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
21.1、本发明中，通过哺乳动物真核表达b1、b2两种蛋白，将这两种蛋白偶联成b1
‑
b2聚合物，并将该复合物定向偶联于亲和柱上，制备成b1
‑
b2聚合物亲和柱，该亲和柱可以结合纯化洗脱过程中因抗原配基脱落产生的抗原抗体复合物，可以快速高效地解决配基脱落问题，减少过程的损失，提高纯度的同时提高抗体的回收率；
22.2、该聚合物可以特异性地结合任何抗原抗体复合物，且可以耐低ph洗脱，盐酸胍再生洗脱后可反复使用于其他项目。
附图说明
23.图1为一种抗体纯化过程中配基脱落的复合物去除方法的框图。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1：
26.s01：真核蛋白表达：对b1蛋白和b2蛋白进行蛋白质表达设计，然后进行质粒构建和质粒提取，完成质粒提取后转染到293细胞中进行表达；
27.s02：蛋白纯化和鉴定：对表达的蛋白分别进行纯化，去除宿主残留蛋白和内毒素等，得到纯度较高的b1蛋白和b2蛋白，对蛋白进行鉴定；
28.s03：蛋白偶联：将b1蛋白和b2蛋白按照一定的比例并使用离子交换法偶联成b1
‑
b2聚合物，去除该聚合物中未偶联的残余蛋白，保证聚合物含量在90％以上；
29.s04：聚合物
‑
亲和柱偶联：将b1
‑
b2聚合物以一定的比例定向偶联于亲和柱上，其中亲和柱为预活化的琼脂糖骨架，并形成聚合物亲和柱，封闭未结合聚合物的位点；
30.s05：配基脱落去除：对抗体进行亲和纯化，将中和后的抗体与聚合物亲和柱混合以去除配基复合物；
31.s06：收样入库：收集去除配基复合物的流穿液，经过透析或者脱盐，收样入库；
32.s07：聚合物亲和柱回收：通过低ph酸碱或者盐洗脱挂在聚合物亲和柱柱上的复合物，柱子再生后，可重复用于下一批次纯化。
33.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
34.1、本发明中，通过哺乳动物真核表达b1、b2两种蛋白，将这两种蛋白偶联成b1
‑
b2聚合物，并将该复合物定向偶联于亲和柱上，制备成b1
‑
b2聚合物亲和柱，该亲和柱可以结合纯化洗脱过程中因抗原配基脱落产生的抗原抗体复合物，可以快速高效地解决配基脱落问题，减少过程的损失，提高纯度的同时提高抗体的回收率；
35.2、该聚合物可以特异性地结合任何抗原抗体复合物，且可以耐低ph洗脱，盐酸胍再生洗脱后可反复使用于其他项目。
36.实施例2：
37.s01：真核蛋白表达：对b1蛋白和b2蛋白进行蛋白质表达设计，然后进行质粒构建
和质粒提取，完成质粒提取后转染到293细胞中进行表达；
38.s02：蛋白纯化和鉴定：对表达的蛋白分别进行纯化，去除宿主残留蛋白和内毒素等，得到纯度较高的b1蛋白和b2蛋白，对蛋白进行鉴定；
39.s03：蛋白偶联：将b1蛋白和b2蛋白按照一定的比例并使用离子交换法偶联成b1
‑
b2聚合物，去除该聚合物中未偶联的残余蛋白，保证聚合物含量在90％以上；
40.s04：聚合物
‑
亲和柱偶联：将b1
‑
b2聚合物以一定的比例定向偶联于亲和柱上，其中亲和柱为预活化的葡聚糖骨架，并形成聚合物亲和柱，封闭未结合聚合物的位点；
41.s05：配基脱落去除：对抗体进行亲和纯化，将中和后的抗体与聚合物亲和柱混合以去除配基复合物；
42.s06：收样入库：收集去除配基复合物的流穿液，经过透析或者脱盐，收样入库；
43.s07：聚合物亲和柱回收：通过低ph酸碱或者盐洗脱挂在聚合物亲和柱柱上的复合物，柱子再生后，可重复用于下一批次纯化。
44.实施例3：
45.s01：真核蛋白表达：对b1蛋白和b2蛋白进行蛋白质表达设计，然后进行质粒构建和质粒提取，完成质粒提取后转染到293细胞中进行表达；
46.s02：蛋白纯化和鉴定：对表达的蛋白分别进行纯化，去除宿主残留蛋白和内毒素等，得到纯度较高的b1蛋白和b2蛋白，对蛋白进行鉴定；
47.s03：蛋白偶联：将b1蛋白和b2蛋白按照一定的比例并使用氧化还原法偶联成b1
‑
b2聚合物，去除该聚合物中未偶联的残余蛋白，保证聚合物含量在90％以上；
48.s04：聚合物
‑
亲和柱偶联：将b1
‑
b2聚合物以一定的比例定向偶联于亲和柱上，其中亲和柱为预活化的琼脂糖骨架，并形成聚合物亲和柱，封闭未结合聚合物的位点；
49.s05：配基脱落去除：对抗体进行亲和纯化，将中和后的抗体与聚合物亲和柱混合以去除配基复合物；
50.s06：收样入库：收集去除配基复合物的流穿液，经过透析或者脱盐，收样入库；
51.s07：聚合物亲和柱回收：通过低ph酸碱或者盐洗脱挂在聚合物亲和柱柱上的复合物，柱子再生后，可重复用于下一批次纯化。
52.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。