一种以纤维素为底物制备昆布二糖的方法与流程

1.本发明属于合成生物学领域，具体涉及一种利用不可食生物质(纤维素)合成具有药用价值的产物—昆布二糖的新的生物合成方法。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.目前可回收秸秆资源中，直接还田的约15.0％，用于生产动物饲料的约30.7％，用于工业能源的约17.9％，用于材料制备等其他项目领域的仅占5.25％，直接废弃燃烧的秸秆资源比例高达31.6％。可见，提高可回收秸秆资源的材料化利用率具有重要意义。以秸秆为原料生产各种材料用途非常广泛。从纤维素中有效地生成可发酵的水解产物，是利用木质纤维素原料生产具有成本竞争力的生物燃料和其他可持续生物基产品的主要要求之一。昆布二糖(3
‑
o
‑
β
‑
d
‑
吡喃葡萄糖基
‑
d
‑
葡萄糖)是一种还原性葡萄糖二糖，由2个通过β
‑
1,3糖苷键连接的葡萄糖单元组成。在自然界中，昆布二糖很少以游离形式存在，而是作为许多天然多糖的亚基而存在，例如海藻多糖、茯苓多糖、地衣素等。与这些多糖相比，昆布二糖具有更广阔的价值和应用前景，包括在制药行业中作为药物的前体分子，用于开发热纤梭菌可调节基因表达系统的诱导物。此外，它在农业领域中可用于促进种子发芽，并且是一种广泛使用的防腐剂和重要的益生元。由于昆布二糖具有全方位的生物效应，使得昆布二糖的应用前景十分广泛。目前，大多数昆布二糖是通过天然的β
‑
1,3
‑
葡聚糖(如昆布多糖、茯苓多糖、地衣素、凝乳聚糖等)部分酶水解或酸水解而成的。β
‑
1,3葡聚糖的部分水解过程难以控制，导致产品收率低且伴随着高昂的净化成本，酸水解还会引起严重的环境问题。化学合成是另一种从葡萄糖开始生产公斤级昆布二糖的方法。但该方法具有一些固有的弱点，例如费力的保护基操作，苛刻的反应条件，繁琐的纯化操作和较低的总收率。迄今为止，难以实现大规模应用。体外酶生物系统是一种很有前途的生物制造平台，可以用来生产所需的产品。与微生物细胞工厂相比，这种生物系统具有产品产量高、反应速度快、易于过程控制和优化等优点。
4.发明人通过检索昆布二糖合成的公开专利，发现：现有技术均以淀粉为底物，没有涉及纤维素和纤维素酶的应用。，而采用淀粉为底物制备昆布二糖时，在反应过程中需要添加了葡萄糖等反应物，没能实现在反应过程中，不添加其他底物的情况下，一锅法合成昆布二糖。


技术实现要素：

5.为了克服上述问题，本发明的目的是提供一种从纤维素生物合成昆布二糖的新方法。本发明通过对昆布二糖合成路径加以研究改进，重新设计了新的合成路线。通过此合成路径，实现了从非粮生物质合成昆布二糖，这为秸秆等农业废弃物的应用开拓了新的前景，
是一种全新的昆布二糖合成方法。
6.为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一个方面，提供了一种以纤维素为底物制备昆布二糖的方法，包括：
8.以无定型纤维素为底物采用三酶级联反应合成昆布二糖；
9.其中，三酶联反应液包括：纤维二糖水解酶、纤维二糖磷酸化酶、昆布二糖磷酸化酶。
10.本发明共涉及三种酶，cbhi(cellobiohydrolases,e.c.3.2.1.91，纤维二糖水解酶)，cbp(cellobiose phosphorylase，ec:2.4.1.20，纤维二糖磷酸化酶)和lbp(laminaribiose phosphorylase，ec:2.4.1.31，昆布二糖磷酸化酶)，通过这三种酶，在不需要外部能量和底物添加的情况下，以磷酸处理纤维素为底物，通过一锅法成功合成了昆布二糖。这是一种全新的昆布二糖合成路径，通过此路径，使得秸秆等农业废弃物有了更高层次的应用。
11.另一方面，基于体外酶生物系统的特点，本发明选择了大肠杆菌作为蛋白表达的工程菌株，用于本合成方法中酶的表达。
12.本发明的第二个方面，提供了任一上述的方法制备的昆布二糖。
13.本发明利用纤维素降解产物合成昆布二糖，是资源再利用的一个优良表现。
14.本发明的第三个方面，提供了纤维素在制备昆布二糖中的应用。
15.本发明的有益效果在于：
16.(1)经本发明方法合成昆布二糖，不涉及atp和其他反应中间物的添加，只需要加入磷酸处理纤维素和适量的磷酸根离子，加入三种酶，在合适的缓冲液、ph、温度下，直接合成昆布二糖。本发明提供的方法中，反应物更易获取且价格低廉，通过本方法，可以缓解目前中国的农业废弃物浪费问题，实现了资源再利用，具有良好的经济意义。
17.(2)本技术的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。
附图说明
18.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
19.图1为本发明的技术路线图。
20.图2为本发明的三酶联反应tlc检测图。其中，1：葡萄糖；2：纤维二糖；3：昆布二糖；4：cbhi cbp lbp三酶联反应液；5：cbhi cbp反应液；6：cbhi反应液；7：未加酶对照。
具体实施方式
21.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
22.一种以纤维素为底物制备昆布二糖的方法，包括：
23.以无定型纤维素为底物采用三酶级联反应合成昆布二糖；
24.其中，三酶联反应液包括：纤维二糖水解酶、纤维二糖磷酸化酶、昆布二糖磷酸化酶。
25.在一些实施例中，所述无定型纤维素为采用磷酸处理后纤维素。
26.在一些实施例中，所述无定型纤维素的浓度为8～12mg/ml，优选地，为10mg/ml。
27.在一些实施例中，所述纤维二糖水解酶的浓度为：60～80μg/ml，优选地，为70μg/ml。
28.在一些实施例中，所述纤维二糖磷酸化酶的浓度为：15～25μg/ml，优选地，为20μg/ml。
29.在一些实施例中，所述昆布二糖磷酸化酶的浓度为：15～25μg/ml，优选地，为20μg/ml。
30.在一些实施例中，所述三酶联反应液还包括：mkh2po4、mg
2
和柠檬酸缓冲液。
31.在一些实施例中，所述三酶级联反应的条件为40～50℃反应18～30h，优选地，45℃反应24h。
32.实验所需溶液配制：
33.(1)麸皮固体培养基：称取10％(w/v)麸皮，加自来水煮沸，小火煮30min，用纱布过滤得麸皮汁，分装，加琼脂粉2％(w/v)，121℃灭菌30min。
34.(2)种子培养基(50ml)：(nh4)2so4：0.1g，kh2po4：0.15g，mgso4：0.025g，caco3：0.25g，蛋白胨：0.5g，微晶纤维素：0.5g。加水定容至50ml。
35.(3)产酶培养基(100ml)：(nh4)2so4：0.2g，kh2po4：0.3g，mgso4：0.05g，caco3：0.5g，蛋白胨：1g，微晶纤维素：1g，尿素：0.1，nano3：0.2g，吐温
‑
80：0.2g，微量元素1：100μl，微量元素2：100μl。加水定容至100ml。
36.(4)洗孢子液(100ml)：nacl：0.9g，吐温
‑
80：50μl，ddh2o定容至100ml，高压蒸汽灭菌后使用。
37.(5)菌种保存液：甘油：50％(m/v)，用ddh2o配制。
38.(6)高效液相色谱流动相溶液：5mm h2so4溶液，用ddh2o配制。
39.(7)8％sds
‑
pag分离胶(10ml)：tris
‑
hcl(1.5m,ph 8.8)：2.6ml，丙烯酰胺溶液(30％)：2.6ml，sds(10％)：0.1ml，aps(10％)：0.1ml，temed：6μl，ddh2o：4.6ml。
40.(8)5％sds
‑
pag浓缩胶(4ml)：tris
‑
hcl(1.5m,ph 8.8)：0.5ml，丙烯酰胺溶液(30％)：0.67ml，sds(10％)：40μl，aps(10％)：40μl，temed：4μl，ddh2o：2.7ml。
41.(9)5
×
sds电泳缓冲液(1l)：tris
‑
hcl：15.1g，glycine：94g，sds：5g，ddh2o定容至1l。
42.(10)蛋白胶染色液(1l)：无水乙醇：450ml，冰醋酸：100ml，考马斯亮蓝：5g，ddh2o：450ml。
43.(11)蛋白胶脱色液(1l)：无水乙醇：50ml，冰醋酸：100ml，ddh2o：850ml。
44.(12)蛋白质纯化pbs缓冲液(1l)：nah2po
4.
2h2o：2.46g，na2hpo
4.
12h2o：12.24g，nacl：1.922g，加ddh2o约800ml溶解，调节ph至7.4后加ddh2o定容至1l。
45.(13)柠檬酸缓冲液(1l)：柠檬酸三钠(c6h5na3o
7.
2h2o)：7.94g，柠檬酸(c6h8o7·
h2o)：4.83g，加ddh2o约800ml溶解，用naoh调ph到4.8后定容至1l，4℃保存备用。
46.(14)0.05m hac
‑
naac(1l)：naac：4.105g，加ddh2o约800ml溶解，用冰醋酸调节ph到4.8，定容至1l。
47.(15)pnpc溶液：pnpc：10mg，d
‑
葡萄糖酸
‑
δ
‑
内酯：10mg，加10ml 0.05m hac
‑
naac
(ph 4.8)溶解，4℃避光保存备用。
48.(16)lb培养基：称取10g/l蛋白胨(tryptone)，5g/l酵母粉(yeast extract)，10g/l氯化钠(nacl)，使用ddh2o配制。高压蒸汽灭菌后备用。在实验中，如有需要，向培养基中加入50mg/l的硫酸卡那霉素作为选择抗性。
49.(17)卡那霉素溶液(100mg/ml)：称取硫酸卡那霉素10g，溶于100ml ddh2o中。完全溶解后，分装到1.5ml离心管中，冷冻保存备用。
50.(18)iptg溶液(1m)：称取iptg 28.3g，溶于100ml ddh2o中。完全溶解后，分装到1.5ml离心管中，冷冻保存备用。
51.(19)柠檬酸缓冲液：7.94g柠檬酸三钠(c6h5na3o
7.
2h2o)，4.83g柠檬酸(c6h8o7·
h2o)，加ddh2o约800ml溶解，用naoh调ph到4.8后使用ddh2o定容至1l，4℃保存备用。
52.(20)50mm tris
‑
hcl缓冲液：称取6.06g tris，使用800ml ddh2o溶解后，用hcl调节至所需ph，定容至1l。
53.(21)50mm hepes缓冲液：称取11.92g hepes，使用800ml ddh2o溶解后，调节至所需ph，定容至1l。
54.(22)pbs缓冲液(无咪唑)：2.46g nah2po
4.
2h2o，12.24g na2hpo
4.
12h2o，11.688g nacl，加ddh2o约800ml溶解，调节ph至7.4后加ddh2o定容至1l。
55.(23)pbs缓冲液(20mm咪唑)：2.46g nah2po
4.
2h2o，12.24gna2hpo
4.
12h2o，11.688g nacl，1.36g咪唑，加ddh2o约800ml溶解，调节ph至7.4后加ddh2o定容至1l。
56.(24)pbs缓冲液(40mm咪唑)：2.46g nah2po
4.
2h2o，12.24gna2hpo
4.
12h2o，11.688g nacl，2.72g咪唑，加ddh2o约800ml溶解，调节ph至7.4后加ddh2o定容至1l。
57.(25)pbs缓冲液(250mm咪唑)：2.46g nah2po
4.
2h2o，12.24gna2hpo
4.
12h2o，11.688g nacl，17g咪唑，加ddh2o约800ml溶解，调节ph至7.4后加ddh2o定容至1l。
58.(26)菌种保存液：甘油：50％(m/v)，用ddh2o配制，高温灭菌后备用。
59.(27)10
×
sds
‑
page缓冲液：30g/l tris，144g/l甘氨酸，10g/l sds，使用ddh2o配制。
60.(28)钼酸铵试剂：溶液中乙酸锌终浓度为0.1m，钼酸铵终浓度为15mm，配制时将乙酸锌和钼酸铵分别加一定量蒸馏水完全溶解后(钼酸铵可加热溶解)，再混合到一起，最后使用hcl调节ph至5.0。
61.(29)抗坏血酸溶液(10％)：称取5g抗环血酸，加入约30ml ddh2o溶解，使用naoh调节ph至5.0后，定容至50ml，避光保持。
62.以下实施例中，cbhi的表达菌株为里氏木霉qm6a(trichdermareeseiqm6a)。cbp和lbp的表达菌株为大肠杆菌(e.coli k12),cbp的氨基酸序列如seq id no:1所示，lbp的氨基酸序列如seq id no:2所示。
63.下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
64.实施例1里氏木霉表达cbhi及酶的纯化、酶活检测
65.i.利用实验室已有的里氏木霉qm6a菌株，进行产酶培养
66.接种里氏木霉qm6a菌株于麸皮平板上，培养4～5天待生孢后，接种于50ml种子培养基，30℃，200rpm培养48小时，用移液器吸取10ml种子液接种于100ml的产酶培养基，30
℃，200rpm培养7天，离心收集酶液。
67.ii.蛋白浓缩及纯化
68.用10kda的超滤管将酶液浓缩10倍，后通过akta avent机器利用分子筛进行蛋白纯化，获得纯化后的cbhi。
69.iii.蛋白浓度检测和pnpc酶活检测
70.使用bradford方法进行胞外蛋白含量的测定，在酶标条中加入200μl bradford，后加入20μl蛋白，在吸光值od595处进行测量。然后在1.5ml的离心管中，加入50μl的pnpc，实验组加入100μl纤维素酶酶液，吹打混匀，50℃水浴反应30min，对照组加入100μl纤维素酶酶液。接下来加入150μl 10％naco3将反应终止，使用分光光度计测量od420时的吸光值并进行酶活换算，测定结果为cbhi酶活0.40
±
0.01u/mg protein。
71.实施例2利用大肠杆菌表达系统表达cbp、lbp。
72.cbp基因来自于clostridium thermocellum，lbp基因来自于paenibacillus sp.
73.i.引物设计
74.选择pet
‑
28a质粒，利用snapgene软件将cbp、lbp基因插入pet
‑
28a质粒中，进行引物设计，设计引物如下表所示。
75.表1扩增cbp和lbp基因的引物
[0076][0077]
ii.细菌基因组的提取
[0078]
取clostridium thermocellum和paenibacillus sp.菌液各5毫升，分别置于15ml离心管中，13000
×
g的离心力下室温离心2min，弃上清，用1ml无菌水重悬菌体，转移至1.5ml离心管中，13000
×
g的离心力下室温离心1min，弃上清，加入500μl抽提缓冲液，及1g石英砂，旋涡剧烈震荡3min，使菌体分散于抽提缓冲液中，65℃水浴30min，将液体转移到新的1.5ml离心管。加入500μl三氯甲烷，旋涡剧烈震荡30s，在13000
×
g的离心力下室温离心10min。转移300μl上清液到另一无菌1.5ml离心管，加入0.1倍体积的3m naac(ph4.8)溶液，
加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，
‑
20℃放置20min，4℃下在13000
×
g的离心力下离心10min，去上清。加入700μl的70％乙醇，洗涤2次(在13000
×
g的离心力下，2min)后倒掉，离心5min，待乙醇完全挥发后，用20μl ddh2o溶解基因组
[0079]
iii.cbp和lbp基因扩增以及与质粒连接
[0080]
用高保真phanta max super
‑
fidelity dna polymerase，以cbp
‑
f/cbp
‑
r为引物，clostridium thermocellum基因组为模板扩增带有15bp pet
‑
28a同源臂的cbp片段，以pet28a
‑
cbp
‑
f/pet28a
‑
cbp
‑
r为引物，以pet28a空质粒为模板扩增带有15bp cbp同源臂的pet
‑
28a片段。以lbp
‑
f/lbp
‑
r为引物，paenibacillus sp.基因组为模板扩增带有15bp pet
‑
28a同源臂的lbp片段，以pet28a
‑
lbp
‑
f/pet28a
‑
lbp
‑
r为引物，以pet28a空质粒为模板扩增带有15bp lbp同源臂的pet
‑
28a片段。pcr反应扩增结束后，用胶回收试剂盒回收每个片段，保证每个dna片段的浓度较高以保证后续试验的成功。然后用multif seamless assembly mix试剂盒进行质粒和片段的连接，获得pet28a
‑
cbp质粒和pet28a
‑
cbp质粒。
[0081]
其中，pcr反应体系如下:
[0082][0083][0084][0085]
iv.pet28a
‑
cbp和pet28a
‑
cbp质粒的转化
[0086]
rosetta(de3)感受态细胞从
‑
80℃拿出，迅速插入冰中，5min后待菌块融化，加入
目的质粒，并用手拨打ep管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25min。42℃水浴热激45s，迅速放回冰上并静置2min，晃动会降低转化效率。向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌lb培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60min。5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含卡那霉素抗性的lb培养基上。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
[0087]
v.菌落验证
[0088]
对过夜培养的平板挑取单菌落，置于1.5ml带有卡那霉素抗性的lb液体培养基的ep管中，37℃，200rpm培养3h至浑浊，进行菌液pcr。pcr进行琼脂糖凝胶电泳，检测是否能获得与cbp和lbp基因相同大小的条带，若有，则说明片段和质粒连接成功且质粒导入成功，可以进行下一步蛋白表达。
[0089]
vi.cbp和lbp的表达和纯化
[0090]
(1)配置lb液体培养基，高温蒸汽灭菌30min。温度选择121℃。
[0091]
(2)待上述溶液冷却后，取出﹣20℃保存的菌株和100mg/ml的卡那霉素溶液，待其完全溶化后摇匀，先向300ml锥形瓶中加入50μl卡那霉素溶液，摇匀；加入50μl菌种保藏液，摇匀。37℃，200rpm过夜活化至od600＝1。活化后可见颜色明显变为不透明的蛋黄色。
[0092]
(3)先从2l的锥形瓶中取出约5ml液体，作为后续吸光度测定的参比。向2l的锥形瓶中每个加入1ml卡那霉素溶液，摇匀后，各加入10ml已活化的大肠杆菌培养液。37℃，200rpm培养。
[0093]
(4)约4
‑
5小时后，从一瓶培养液中取约3ml液体，600nm测吸光度。如果od值不在0.4
‑
0.6之间，则继续培养一段时间，再次测量，直至od值到达0.4
‑
0.6时，每个锥形瓶加入250μl完全融化后的1m浓度的iptg溶液，并将摇床温度降至16℃，200rpm培养约16h(或者过夜)。
[0094]
(5)将大肠杆菌培养液倒入1l的离心杯中，四个离心杯配平后，4000
×
g离心10min(4℃)。离心结束，直接倒出上清，沉淀倒入50ml离心管，加少量含有20mm咪唑的pbs溶液(含有10％甘油)，涡旋振荡重悬细胞，此时可以﹣20℃保存。
[0095]
(6)菌液倒入100ml烧杯中，加入千分之一体积的pmsf溶，混匀。利用超声破碎仪进行细胞破碎。破碎后，超速离心，13000
×
g，4℃离心50min。
[0096]
(7)利用akta和ni柱对蛋白进行纯化，纯化后脱盐，获得较纯的cbp和lbp。
[0097]
实施例3以纤维素为底物三酶级联催化合成昆布二糖
[0098]
i.无定型纤维素的制备
[0099]
将约0.2g的微晶纤维素添加到50ml离心管中，并添加0.6ml蒸馏水以润湿纤维素粉末，从而形成纤维素悬浮浆液。在剧烈搅拌下，将10ml冰冷的86.2％h3po4缓慢加入到浆液中，使最终磷酸浓度约为83.2％。在加入最后2ml磷酸之前，必须将纤维素悬浮液均匀混合。纤维素混合物在几分钟内变成透明，并在冰上放置约一个小时。以每次添加约10ml的速率添加约40ml的冰冷的水，会产生白色浑浊沉淀，所以在每次添加之间剧烈搅拌下。将沉淀的纤维素在约4000
×
g和4℃下离心20min。将沉淀物用冰冷的水悬浮，然后离心除去含磷酸的上清液四次。加入大约0.5ml的2m na2co3中和残留的磷酸，然后，使用45ml的冰冷蒸馏水悬浮纤维素颗粒。离心后，将沉淀物用蒸馏水悬浮，离心两次或直至ph 5
‑
7。可以将磷酸处理纤维素浆液长时间保持在约4℃。
[0100]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0101]
ii.一锅法合成昆布二糖
[0102]
以磷酸处理纤维素为底物通过三酶级联反应合成昆布二糖。反应条件如下：10mg/ml无定型纤维素，30mmkh2po4，5mm mg
2
，70μgcbhi，20μgcbp，20μglbp，柠檬酸缓冲液(ph 4.8)补充至1ml，45℃反应24h。同时做不加酶对照，只加cbhi对照以及加cbhi和cbp对照。利用tlc进行检测。
[0103]
表2本实施例中所涉及的酶
[0104][0105]
三酶联反应tlc检测图如图1所示。对反应条件进行了优化，最终获得2.53mg/ml昆布二糖，转化率达到25.3％。
[0106]
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。