一种合作猪源粘膜乳杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种合作猪源粘膜乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.仔猪腹泻一直是困扰养猪生产的主要疾病之一，严重影响养猪业的经济效益。据报道我国仔猪死亡率为15%～20%，其中由腹泻引起的仔猪死亡数约占死亡总数的40%，每年给养猪业带来的直接经济损失达数百亿元。c型产气荚膜梭菌，又称c型魏氏梭菌，是引起仔猪腹泻的主要病原之一；其感染主要发生于2周龄以内的仔猪，且具有发病急、病程短的特点，发病仔猪死亡率达70%以上，严重影响着养猪业的健康发展。据报道，产气荚膜梭菌感染性腹泻在世界各养猪国家均有发生；经调查2015年我国广东、江西、湖北和云南的33个规模化猪场，产气荚膜梭菌在仔猪哺乳阶段的感染率高达80%。
3.尽管目前通过加强饲养管理、注射疫苗和使用抗生素药物防治等措施在一定程度上减少和控制了该腹泻疾病的发生，但抗生素的长期使用，出现了病原菌耐药性增强和抗生素残留等问题。与此同时，预防该病原感染的类毒素疫苗的效果易受其类毒素抗原成分的影响。这些问题使得对仔猪c型产气荚膜梭菌感染性腹泻防治的难度不断加大，且无抗养殖和绿色健康养殖也要求尽可能减少甚至禁止抗生素的使用。因此，寻求一种替代抗生素的策略是防治仔猪c型产气荚膜梭菌性腹泻的迫切需求。
4.粘膜乳杆菌（lactobacillus mucosae）是存在于动物肠道中的乳酸杆菌类益生菌之一。近年来，有研究发现，粘膜乳杆菌在细胞黏附、代谢碳水化合物产酸和拮抗致病菌等方面具有重要作用，其可通过紧密连接蛋白去磷酸化和肌动蛋白调节等影响肠屏障的完整性和功能。还有研究发现，粘膜乳杆菌在粘附于肠上皮组织形成生物被膜的同时产生抗菌素，具有抑制病原菌的定植并调节肠道免疫系统的益生作用。此外，lactobacillus mucosae nk41与长双歧杆菌（bifidobacterium longum）协同作用，通过抑制核因子κb（nuclear factor kappa
‑
b，nf
‑
κb）蛋白活化、肿瘤坏死因子
‑
α（tumor necrosis factor
‑
α，tnf
‑
α）表达以及细菌脂多糖的产生来减轻小鼠的结肠炎症状。说明开发利用粘膜乳杆菌作为防治畜禽细菌感染性肠道疾病的抗生素替代策略，具有广阔的发展前景和应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是提供一种合作猪源粘膜乳杆菌，该粘膜乳杆菌具有良好的产酸、耐酸和耐胆盐能力以及拮抗c型产气荚膜梭菌生长的能力。
6.本发明的第二个目的是提供上述粘膜乳杆菌在防治c型产气荚膜梭菌感染致猪肠上皮细胞ipec
‑
j2损伤中的应用，在畜禽细菌感染性肠道疾病防治方面具有广阔的发展前景和应用价值。
7.为了解决上述问题，本发明首先提供了一种合作猪源粘膜乳杆菌，该粘膜乳杆菌是2021年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc）的粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae，保藏编号为cgmcc no.22828。保藏单位地址：北京市朝阳区
北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
8.所述粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae是从健康的合作猪粪便样品中分离纯化得到的。
9.所述粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae的16s rdna序列为genbank no. mz047317。
10.所述粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae具有良好的产酸、耐酸和耐胆盐能力以及拮抗病原菌能力。在ph为4.0、3.0和2.0的mrs肉汤的存活率均大于80.00%；在猪胆盐添加量为0.10%、0.20%和0.30%的mrs肉汤的存活率均大于90.00%；与c型产气荚膜梭菌共培养时，显著抑制c型产气荚膜梭菌的生长。
11.本发明的第二个目的是提供了上述菌株在防治c型产气荚膜梭菌致猪ipec
‑
j2细胞损伤中的应用。
12.所述粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae在活菌数为10
7 cfu/ml和10
8 cfu/ml时对ipec
‑
j2细胞形态和活率无显著影响，并可有效缓解c型产气荚膜梭菌感染造成的ipec
‑
j2细胞形态损伤，显著增加c型产气荚膜梭菌感染后的ipec
‑
j2细胞的活力。
13.所述粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae可以显著抑制c型产气荚膜梭菌感染ipec
‑
j2细胞后炎性因子表达的增加，显著增加c型产气荚膜梭菌感染ipec
‑
j2细胞紧密连接蛋白表达的降低。
14.本发明具有的有益效果在于：本发明首次从合作猪粪便中分离出了的粘膜乳杆菌lm410，其具有良好的体外益生潜能，可抑制c型产气荚膜梭菌的生长并对c型产气荚膜梭菌致ipec
‑
j2细胞损伤具有明显保护作用，可用于防治猪细菌感染性腹泻疾病的防治。
附图说明
15.图l为本发明实施例1中分离菌株菌落形态图；图2为本发明实施例1中分离菌株触酶试验结果。a为阳性对照（c型产气荚膜梭菌），b为分离菌株；图3为本发明实施例1中分离菌株氏染色镜检结果（1000
×
）；图4为本发明实施例1中分离菌株pcr扩增图。m为2000 bp dna marker；1为阴性对照；2为分离菌株；图5为本发明实施例1中分离菌株系统发育树；图6为本发明实施例2中粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae的生长曲线和产酸曲线；图7为本发明实施例2中粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae抑制c型产气荚膜梭菌生长图。lm为粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae纯培养活菌数；lm in co
‑
culture为粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae在与c型产气荚膜梭菌共培养中的活菌数；cp为c型产气荚膜梭菌纯培养活菌数；cp in co
‑
culture为c型产气荚膜梭菌在与粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae共培养中的活菌数；图8为本发明实施例3中不同浓度粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae对ipec
‑
j2细胞活力的影响；图9为本发明实施例3中粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae对c型产气荚膜梭菌
感染ipec
‑
j2细胞形态的影响（100
ꢀ×
）；control为空白对照组；lm为粘膜乳杆菌lm410培养组；cp为c型产气荚膜梭菌培养组；lm cp为粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae与c型产气荚膜梭菌共培养组；图10、图11、图12相同；图10为本发明实施例3中粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae对c型产气荚膜梭菌感染ipec
‑
j2细胞活力的影响；图11为本发明实施例3中粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae对c型产气荚膜梭菌感染ipec
‑
j2细胞因子表达的影响；图12为本发明实施例3中粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae对c型产气荚膜梭菌感染ipec
‑
j2细胞紧密连接蛋白表达的影响。
具体实施方式
16.下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。这些实施例仅用于说明本发明而不限于本发明的范围。
17.实施例1，粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae的分离鉴定1. 菌株的分离纯化取0.5g左右的健康合作猪粪便样品，用1
×
dpbs缓冲液稀释成10
‑3、10
‑4、10
‑
5 3个梯度。分别取70.00
ꢀµ
l不同浓度粪便稀释液涂布于含万古霉素（过滤除菌，终浓度2.00mg/ml）的caco3‑
mrs平板，37℃厌氧培养48 h。挑取有明显溶钙圈的符合乳酸杆菌属典型菌落形态特征的单个菌落，在mrs平板上划线培养，反复纯化三次。挑选出符合乳白色，呈圆形，边缘光滑，整体饱满等乳酸杆菌属菌落形态特征的疑似菌株70株（图1）。
18.本发明使用的caco3
‑
mrs培养基成分如下：蛋白胨10.0 g/l、牛肉膏5.0 g/l、葡萄糖20.0 g/l、磷酸氢二钾2.0 g/l、柠檬酸三铵2.0 g/l、乙酸钠5.0 g/l、硫酸镁0.2 g/l、硫酸锰0.05 g/l、吐温
‑
80 1.0 g/l、琼脂15.0 g/l、caco
3 15.0 g/l。调节至最终ph 6.2
ꢀ±ꢀ
0.1。
19.2. 菌株鉴定菌株鉴定包括过氧化氢触酶试验，革兰氏染色镜检观察菌体形态，生化鉴定及16s rdna分子鉴定。
20.（1）触酶试验取1张洁净载玻片，用接种环挑取单个菌落涂于载玻片上，滴一滴3%过氧化氢（现用现配），立即观察是否有气泡生产。若有气泡为触酶阳性，无气泡则为触酶阴性，以大肠杆菌为阳性对照，筛选出阴性菌株52株（图2）。
21.（2）革兰氏染色镜检将触酶阴性菌株按照革兰氏染色试剂盒说明书进行染色后，用显微镜观察菌体形态特征，筛选出符合乳酸杆菌典型菌体特征的革兰阳性菌株33株（图3）。
22.（3）生化鉴定将筛选菌株接种到mrs肉汤培养基，37℃摇床培养24 h。采用hbi乳酸菌生化鉴定条（gb）进行培养鉴定，鉴定结果与《伯杰氏系统细菌学手册》第二版vol.3（2009年）中粘膜乳杆菌的生化特性进行比对，筛选出疑似菌株7株（表1）。 表示阳性、
‑
表示阴性。
23.表1 分离菌株生化鉴定结果
本发明使用的mrs肉汤培养基成分如下：称取本品48.30 g，加热溶解于1l蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min，调节至最终ph 6.2
ꢀ±ꢀ
0.1。
24.（4）16s rdna分子鉴定将筛选菌株接种到mrs肉汤，37℃摇床培养24 h。根据粘膜乳杆菌16s rrna基因设计特异性引物（labm
‑
f：5
’‑
tgagtaacacgtaggtaacctg
‑3’
；labm
‑
r：5
’‑
atgctgatccgcgattact
‑3’
），按照质粒小提试剂盒说明书的操作步骤提取各菌株的基因组dna，进行pcr扩增和1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出片段大小为1261bp（图4）。pcr反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；58℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min。
25.pcr产物送杨凌天润奥科生物技术有限公司测序，获得序列通过blast与ncbi数据库中标准菌株比对并根据参比序列构建系统发育树，分离菌株2与lactobacillus mucosae lm011（nz_cp062966.1）亲缘关系最近，序列覆盖率为100%，同源性为99%（图5），确定分离菌株2为粘膜乳杆菌的一个种或变种，命名为lactobacillus mucosae lm410。
26.将粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae的16s rdna基因序列提交至ncbi数据库，genbank no. mz047317。
27.粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae加入终浓度为30%的灭菌甘油
‑
80℃保存。
28.实施例2，粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae生物学特性分析1. 生长曲线和产酸曲线将活化的粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae按1.00%的接种量接种于mrs肉汤，37℃摇床中培养24 h，每2 h进行取样，测定培养基的吸光值（od
600
）和ph值，以培养时间为横坐标，分别以吸光值和ph为纵坐标绘制生长曲线和产酸曲线。结果显示，0～8 h生长相对比较缓慢，8～20 h为对数生长期，20 h之后进入稳定期和衰亡期；培养过程中ph逐渐降低，培养22 h后mrs肉汤ph值降低至4.50以下并趋于稳定（图6），说明其具有良好的产酸性能，。
29.2. 耐酸能力测定用6.00 mol
·
l
‑1的盐酸分别调节mrs肉汤ph至4.00、3.00和2.00。将活化的粘膜乳
杆菌lactobacillus mucosae按1.00%的接种量分别接种至ph为4.00、3.00和2.00的mrs液体培养基中，37℃厌氧培养24 h，以未接种的相应ph的mrs肉汤为空白对照，采用平板涂布法对菌液进行活菌计数，计算存活率。结果显示，粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae在ph为4.00、3.00和2.00的mrs肉汤的存活率均在80.00%以上（表2），说明其具有较强的耐酸能力。
30.表2 粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae耐酸能力ph值活菌数（lgcfu/ml）存活率（%）6.209.32100.004.008.2688.633.007.8884.552.007.7883.483. 耐胆盐能力测定将活化的粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae按1.00%的接种量分别接种至含0.10%、0.20%和0.30%猪胆盐的mrs肉汤，37℃厌氧条件下培养24 h，以未添加猪胆盐的mrs肉汤为空白对照，采用平板涂布法对菌液进行活菌计数，计算存活率。结果显示，粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae在猪胆盐添加量为0.10%、0.20%和0.30%的mrs肉汤的存活率均大于90.00%（表3），说明其具有较强的耐胆盐能力。
31.表3 粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae耐胆盐能力猪胆盐添加量（%）活菌数（lgcfu/ml）存活率（%）0.009.32100.000.108.9295.700.208.8494.850.308.7393.674. 抑菌能力将活化的粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae和c型产气荚膜梭菌隔夜培养后，4℃ 5000
×
g离心10min，用pbs洗涤，将细胞颗粒重悬于mrs肉汤，调整至终浓度为2
×
10
7 cfu/ml。将两种菌株悬浮液等体积混合，37℃孵育8h。共培养样品分别涂布于在lb琼脂和mrs琼脂上进行活菌计数，计算存活率。结果显示，粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae可显著抑制c型产气荚膜梭菌生长（图7）。
32.以上结果均说明粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae具有良好的体外益生功能。
33.实施例3，粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae在防治c型产气荚膜梭菌致猪ipec
‑
j2细胞损伤中的应用1. 不同浓度粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae对ipec
‑
j2细胞活力的影响将ipec
‑
j2单层细胞用无菌pbs润洗2遍后，进行以下处理：（1）对照组：2ml dmem/f12培养液培养ipec
‑
j2细胞；（2）处理组：107、108、10
9 cfu/ml粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae分别与ipec
‑
j2共培养。分别于处理2 h、4 h和6 h后，吸取上清于10ml灭菌离心管内，并用无菌pbs清洗细胞3～5遍，接着用300 μl 0.05％胰酶
‑
edta对细胞进行消化。终止消化后309
×
g离心5min，弃上清，用500 μl dmem/f12基础培养液重悬细胞。采用cck
‑
8法检测ipec
‑
j2细胞活力，结果见图8。10
7 cfu/ml和10
8 cfu/ml浓度的粘膜乳杆菌
lactobacillus mucosae处理ipec
‑
j2细胞2h、4h、6h后，细胞活力与对照相比差异均不显著（p>0.05）。109cfu/ml浓度的粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae处理ipec
‑
j2细胞6h后，细胞活力显著降低（p<0.01）。说明粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae促进ipec
‑
j2细胞活性的适宜浓度为10
8 cfu/ml。
34.2. 粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae对c型产气荚膜梭菌感染ipec
‑
j2细胞形态的影响将ipec
‑
j2单层细胞用无菌pbs润洗2遍后，将10
8 cfu/mll. mucosae与ipec
‑
j2细胞共培养2 h，加入10
8 cfu/mlc型产气荚膜梭菌处理细胞4 h。处理为：（1）control：dmem/f
‑
12细胞培养液；（2）lm：10
8 cfu/ml l. mucosae；（3）cp：10
8 cfu/ml cpc；（4）lm cp：10
8 cfu/ml l. mucosae 10
8 cfu/ml cpc。
35.分别于处理1h、2h和3h后，pbs清洗细胞3遍，彻底洗去未黏附的菌体。之后用甲醇固定15min后，吉姆萨染液染色30min。用蒸馏水清洗细胞2次后用倒置显微镜观察细胞形态。每个试验重复3次。结果见图9。与正常细胞形态相比，10
8 cfu/ml浓度的粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae处理的ipec
‑
j2细胞均未发生明显变化；108cfu/ml浓度的c型产气荚膜梭菌处理的ipec
‑
j2细胞发生明显凋亡和损伤；lm cp组中，粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae可以有效缓解c型产气荚膜梭菌造成的ipec
‑
j2细胞形态损伤。
36.3. 粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae对c型产气荚膜梭菌感染ipec
‑
j2细胞活力的影响试验处理同实施例三 2，收集细胞，采用cck
‑
8法检测粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae对c型产气荚膜梭菌感染ipec
‑
j2细胞活力的影响。结果见图10。结果显示，与c型产气荚膜梭菌单独处理组相比，粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae与c型产气荚膜梭菌共同处理细胞，可显著增加细胞活力（p<0.01），说明粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae可增加c型产气荚膜梭菌感染ipec
‑
j2细胞后的细胞活力。
37.4. 粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae对c型产气荚膜梭菌感染ipec
‑
j2细胞细胞因子表达的影响试验处理同实施例三 2，处理结束后收集细胞，用无菌pbs清洗3遍，6孔板每孔加入1mltrizol试剂，常温裂解5min，吹打完全转移至1.5 ml无rna酶离心管内，
‑
80℃保存，进行后续rna提取，检测细胞因子il
‑
8、tnf
‑
α和il
‑
1βmrna的表达。每个试验重复3次。结果见图11，由图可见，c型产气荚膜梭菌处理细胞4h后，与对照组相比，极显著增加ipec
‑
j2细胞炎性因子il
‑
8、tnf
‑
α和il
‑
1β的表达（p<0.01）；粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae与c型产气荚膜梭菌共处理细胞4h，可以显著抑制c型产气荚膜梭菌感染ipec
‑
j2细胞后炎性因子il
‑
8和il
‑
1β的表达（p<0.01）。
38.5. 粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae对c型产气荚膜梭菌感染ipec
‑
j2细胞紧密连接蛋白表达的影响试验处理同实施例三 2，处理结束后收集细胞，用无菌pbs清洗3遍，6孔板每孔加入1mltrizol试剂，常温裂解5min，吹打完全转移至1.5 ml无rna酶离心管内，
‑
80℃保存，进行后续rna提取，检测细胞紧密连接蛋白ocln和cldn1 mrna的表达。试验重复3次。结果见图12，由图可见，c型产气荚膜梭菌处理细胞4h后，与对照组相比，显著降低ipec
‑
j2细胞ocln和cldn1的表达（p<0.05）；粘膜乳杆菌lactobacillus mucosae与c型产气荚膜梭菌共处理
细胞4h，可以显著增加c型产气荚膜梭菌感染ipec
‑
j2细胞后ocln和cldn1的表达（p<0.05）。