一种固氮类芽孢杆菌液体发酵的方法与流程

1.本发明涉及液体发酵技术领域，更具体的说是涉及一种固氮类芽孢杆菌液体发酵的方法。


背景技术：

2.液体发酵是指在生化反应器中，将菌株在生育过程中所必需的糖类、有机和无机含氮化合物、无机盐等一些微量元素以及其他营养物质溶解在水中作为培养基，灭菌后接入菌种，通入无菌空气并加以搅拌，提供适于菌体呼吸代谢所需要的氧气，并模仿自然界控制适宜的外界条件，进行菌种大量培养繁殖的过程。
3.液体发酵主要适于细菌、酵母菌等单细胞微生物。其优点是自动化程度高、劳动强度低、占用场地少、便于高产能大规模生产。
4.但是一般的液体发酵工艺也存在其自身的缺点：生产条件严格、配套设备多、投资大、耗时较长。改良前的液体发酵方式包括以下五个步骤：
①
种子培养基接种一级摇瓶培养基
②
配置二级摇瓶；
③
配置一级种子罐；
④
配置二级种子罐；
⑤
液体发酵。需耗时90h左右，在此过程中，需要耗费较长的发酵时间，造成人力物力财力的相对浪费。
5.因此，如何改良发酵工艺是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种固氮类芽孢杆菌液体发酵的方法。克服了现有技术问题，对液体发酵工艺进行改良。以从工业化生产的角度上看，能大大节省企业的投入成本。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种固氮类芽孢杆菌液体发酵的方法，包括以下步骤：
9.(1)种子菌悬液的制备：将休眠体菌株进行活化后，加入无菌水，得菌悬液；
10.(2)二级种子罐发酵：将步骤(1)的菌悬液和原料a混合后，置于温度30～33℃环境下，风量为第0～4h风量35～45m3/h、第4～8h风量55～70m3/h、第8h～发酵结束风量75～90m3/h，得二级种子发酵液；
11.(3)发酵罐发酵：将二级种子罐中的发酵液接种到发酵罐的原料b中，置于温度30～33℃环境下，风量为第0～4h风量150～200m3/h、第4～8h风量300～400m3/h、第8～12h风量550～650m3/h、第12h～发酵结束风量750～900m3/h，菌体含量≥7
×
108cfu/ml。
12.有益效果：得到的二级种子发酵液中菌体形态均匀整齐。
13.根据固氮类芽孢杆菌的生长需求设定风量参数，对产物的形成有利。通过对发酵原料b的调整，碳氮比更加符合固氮类芽孢杆菌的生长需求，提高了菌含量，有利于芽孢的形成。
14.最终，发酵罐中90％以上形成休眠体芽孢，芽孢着色均匀、整齐。
15.优选的：步骤(1)活化采用种子培养基，种子培养基的原料为每100ml水按重量百
分比包括胰蛋白胨0.5％～1.0％、酵母膏0.4％～0.5％、氯化钠1％～1.5％；
16.活化的条件为30℃状态下培养4～6h；
17.菌悬液的菌浓度≥5
×
108cfu/ml。
18.优选的：步骤(2)菌悬液和原料a按体积比1ml：65～70ml；
19.原料a为每100ml水按重量百分比包括为蔗糖1％～2％、蛋白胨0.1％～0.2％、酵母浸膏0.08％～0.1％、碳酸钙0.5％～1.0％、磷酸二氢钾0.02％～0.03％；发酵的时间为15h
±
2h，二级种子发酵液菌体含量≥5
×
108cfu/ml。
20.优选的：步骤(3)原料b为每100ml水按重量百分比包括豆饼粉0.5％～1.0％、酵母膏0.1％～0.2％、硫酸镁0.05％～0.1％、氯化钠1％～1.5％、钼酸钠0.02％、硫酸亚铁0.02％。
21.有益效果在于：发酵培养基的调整主要是因为所需要的目标物不同，发酵原料a以生长营养体为主，发酵原料b以形成休眠体为主，通过对发酵原料b的调整，其营养成分更加符合固氮类芽孢杆菌目标产物的形成。
22.优选的：步骤(3)以原料b的质量计，接种量为5％～10％。
23.优选的：步骤(3)发酵的时间为35h
±
2h。
24.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种固氮类芽孢杆菌液体发酵的方法，相较于现有技术，本发明中可应用于芽孢类细菌的液体发酵，改良前是采用的菌种的营养体接种，不仅步骤繁琐，增加了侵染杂菌的几率，还在逐步扩大的过程中，容易造成菌种生长的不同步性，最终菌含量5
×
108cfu/ml(此含量为休眠体芽孢的含量)。改良后采用菌种的休眠体接种，虽然在前期对菌的延迟期稍有影响，但对于整个的发酵过程来说利大于弊，对于目标产物的形成没有影响，最终菌含量≥7
×
108cfu/ml(此含量为休眠体芽孢的含量)。减少人力财物损耗40％左右，减少由于液体发酵过程繁琐而导致的杂菌侵染，提高液体发酵的含量40％左右。适用于大多数芽孢类细菌。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.本发明实施例公开了一种固氮类芽孢杆菌液体发酵的方法。
27.实施例中，所使用的固氮类芽孢杆菌来源自中国农业微生物菌种保藏管理中心(accc)菌种编号11008，但并非对菌种或菌株进行限定；
28.实施例1
29.一种固氮类芽孢杆菌液体发酵的方法，包括以下步骤：
30.(1)种子菌悬液的制备：将休眠体菌株进行活化后，加入无菌水，得菌悬液；
31.(2)二级种子罐发酵：将步骤(1)的菌悬液和原料a混合后，置于温度30℃环境下，风量为第0～4h风量40m3/h、第4～8h风量60m3/h、第8～15h风量80m3/h，发酵至菌体含量≥5
×
108cfu/ml，得二级种子发酵液；
32.(3)发酵罐发酵：将二级种子罐中的发酵液按照质量比例的5％接种到发酵罐的原
料b中进行发酵；发酵时间为35h，置于温度30℃环境下，风量为第0～4h风量200m3/h、第4～8h风量400m3/h、第8～12h风量600m3/h、第12h～发酵结束风量800m3/h，菌体含量≥7
×
108cfu/ml。
33.为进一步优化技术方案：步骤(1)活化采用种子培养基，种子培养基的原料为每100ml水按重量百分比包括胰蛋白胨0.5％、酵母膏0.4％、氯化钠1％；
34.活化的条件为30℃状态下培养4h；
35.菌悬液的菌浓度为5
×
108cfu/ml。
36.为进一步优化技术方案：步骤(2)菌悬液和原料a按质量体积比1ml：70ml；
37.原料a为每100ml水按重量百分比包括为蔗糖1％、蛋白胨0.1％、酵母浸膏0.08％、碳酸钙0.5％、磷酸二氢钾0.02％。
38.为进一步优化技术方案：步骤(3)原料b为每100ml水按重量百分比包括豆饼粉0.5％、酵母膏0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钠1％、钼酸钠0.02％、硫酸亚铁0.02％。
39.实施例2
40.一种固氮类芽孢杆菌液体发酵的方法，包括以下步骤：
41.(1)种子菌悬液的制备：将休眠体菌株进行活化后，加入无菌水，得菌悬液；
42.(2)二级种子罐发酵：将步骤(1)的菌悬液和原料a混合后，置于温度32℃环境下，风量为第0～4h风量40m3/h、第4～8h风量60m3/h、第8～15h风量80m3/h，发酵至菌体含量≥5
×
108cfu/ml，得二级种子发酵液；
43.(3)发酵罐发酵：将二级种子罐中的发酵液按照质量比例的8％接种到发酵罐的原料b中进行发酵；发酵时间为36h，置于温度31℃环境下，风量为第0～4h风量200m3/h、第4～8h风量400m3/h、第8～12h风量600m3/h、第12h～发酵结束风量800m3/h，菌体含量≥7
×
108cfu/ml。
44.为进一步优化技术方案：步骤(1)活化采用种子培养基，种子培养基的原料为每100ml水按重量百分比包括胰蛋白胨0.8％、酵母膏0.45％、氯化钠1.3％；
45.活化的条件为30℃状态下培养5h；
46.菌悬液的菌浓度为5
×
108cfu/ml。
47.为进一步优化技术方案：步骤(2)菌悬液和原料a按质量体积比1ml：70ml；
48.原料a为每100ml水按重量百分比包括为蔗糖1.5％、蛋白胨0.15％、酵母浸膏0.09％、碳酸钙0.75％、磷酸二氢钾0.025％。
49.为进一步优化技术方案：步骤(3)原料b为每100ml水按重量百分比包括豆饼粉0.75％、酵母膏0.15％、硫酸镁0.075％、氯化钠1.2％、钼酸钠0.02％、硫酸亚铁0.02％。
50.实施例3
51.一种固氮类芽孢杆菌液体发酵的方法，包括以下步骤：
52.(1)种子菌悬液的制备：将休眠体菌株进行活化后，加入无菌水，得菌悬液；
53.(2)二级种子罐发酵：将步骤(1)的菌悬液和原料a混合后，置于温度33℃环境下，风量为第0～4h风量40m3/h、第4～8h风量60m3/h、第8～15h风量80m3/h，发酵至菌体含量≥5
×
108cfu/ml，得二级种子发酵液；
54.(3)发酵罐发酵：将二级种子罐中的发酵液按照质量比例的10％接种到发酵罐的原料b中进行发酵；发酵时间为37h，置于温度33℃环境下，风量为第0～4h风量200m3/h、第4
～8h风量400m3/h、第8～12h风量600m3/h、第12h～发酵结束风量800m3/h，菌体含量≥7
×
108cfu/ml。
55.为进一步优化技术方案：步骤(1)活化采用种子培养基，种子培养基的原料为每100ml水按重量百分比包括胰蛋白胨1.0％、酵母膏0.5％、氯化钠1.5％；
56.活化的条件为30℃状态下培养6h；
57.菌悬液的菌浓度为5
×
108cfu/ml。
58.为进一步优化技术方案：步骤(2)菌悬液和原料a按质量体积比1ml：70ml；
59.原料a为每100ml水按重量百分比包括为蔗糖2％、蛋白胨0.2％、酵母浸膏0.1％、碳酸钙1.0％、磷酸二氢钾0.03％。
60.为进一步优化技术方案：步骤(3)原料b为每100ml水按重量百分比包括豆饼粉1.0％、酵母膏0.2％、硫酸镁0.1％、氯化钠1.5％、钼酸钠0.02％、硫酸亚铁0.02％。
61.对比例1
62.现有常规发酵工艺：
63.(1)试管种子(营养体菌株)斜面30℃在恒温培养箱中活化2～4h；
64.(2)一级摇瓶：在500ml三角瓶中装入100ml液体培养基，灭菌，然后把步骤(1)活化后的菌株接种到培养基中，32℃、180rpm的条件下培养15～18小时；
65.(3)二级摇瓶：在1000ml的三角瓶中装入400ml液体培养基，灭菌，然后把步骤(2)产物按接种量10％接种到培养基中，32℃、180rpm的条件下培养8～12小时；
66.(4)一级种子罐：把步骤(3)产物接入到灭好菌的一级种子罐中培养，中间调控温度30℃、培养12～15小时；
67.(5)二级种子罐：把步骤(4)产物接入到灭好菌的二级种子罐中培养，中间调控温度30℃、培养12～15小时；
68.(6)主发酵罐：把步骤(5)产物接入到灭好菌的主发酵罐中培养，中间调控温度30℃、培养32～40小时，芽孢含量达到5
×
108cfu/ml以上发酵终止。
69.结果表明，本发明不仅发酵时间短，且菌含量高，节约成本。
70.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
71.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。