具降尿酸能力的胚芽乳酸杆菌BFA-LA04菌株及其用途的制作方法

具降尿酸能力的胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株及其用途
技术领域
1.本发明关于一种胚芽乳酸杆菌菌株，尤其是一种具降尿酸能力的胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株，本发明另外关于该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株的用途。


背景技术：

2.尿酸为包含碳、氮、氧及氢的杂环化合物(heterocyclic compound)，为嘌呤核苷酸(purine nucleotide)代谢分解的产物，可以再经由尿液排出。
3.若是尿酸无法正常排泄，则会再通过血液流向结缔组织，并以针状结晶体(needle-like crystal)的形式沉积于关节、微血管、皮肤及其他的组织中，此时，白血球即会将之当作外来物，吞噬这些针状结晶体而造成局部炎症反应，即为痛风(gout)。一般而言，血液中的尿酸浓度过高﹝即，高尿酸血症(hyperuricemia)﹞即为痛风发生的主要原因，且尿酸浓度过高更可能会导致糖尿病(diabetes)、肾脏疾病(kidney disease)、动脉硬化(arteriosclerosis)及心血管疾病(cardiovascular disease)等并发症的发生。
4.临床上，医者能够使用现有促进尿酸排泄药(uricosuric agent)或现有抑制尿酸生成药(xanthine oxidase inhibitor)来控制血液中的尿酸浓度，前者通过抑制近端肾小管(proximal tubule)对尿酸的重吸收(reabsorption)，而能够促进尿酸的排泄，例如别嘌呤醇(allopurinol)；后者则通过抑制将黄嘌呤(xanthine)代谢成为尿酸的主要酵素
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黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)，使尿酸无法形成，例如丙磺舒(probenecid)。然而，别嘌呤醇的副作用发生率低，但却有部分患者对别嘌呤醇会产生致命性的严重药物不良反应，而当患者的肌酸酐廓清率(ccr)过低时，丙磺舒会失去效用，且会有尿路结石及尿酸肾病变的危险。
5.有鉴于此，若能进一步找到对降低尿酸含量具有显著疗效的活性成分，应用于高尿酸血症药物的开发，都为各界所引领期盼，以有效改善国人健康问题。


技术实现要素：

6.为解决上述问题，本发明的目的是提供一种胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株，其具有良好的降尿酸能力。
7.本发明的次一目的是提供一种胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株的用途，用以制备高尿酸血症药物。
8.本发明的具降尿酸能力的胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株，具有如seq id no：1所示的16s rdna基因序列及如seq id no：2所示的clpp基因序列，且该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株寄存于日本独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄存中心，其寄存编号为nite bp-03110。
9.由此，本发明的胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株不仅能够分解黄嘌呤，也可以抑制黄嘌呤氧化酶的活性，因而能够作为一种降尿酸的活性成分，并可以应用于制备高尿酸血症药物，针对投予现有促进尿酸排泄药或现有抑制尿酸生成药会诱发副作用的患者，提供一
个降尿酸的选择，为本发明的功效。
10.基于相同的技术概念，本发明的胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株的用途，用以制备高尿酸血症药物，其中，该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株寄存日本独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄存中心，其寄存编号为nite bp-03110。
11.由此，本发明的胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株由于能够应用于制备高尿酸血症药物，因此可以供投予该所需个体，使该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株得以于该所需个体体内发挥作用，降低该所需个体的血液中的尿酸含量，进而防止高尿酸血症所导致的痛风、糖尿病、肾脏疾病、动脉硬化及脑心血管疾病等并发症的发生，为本发明的功效。
12.本发明的胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株的用途，其中，该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株投予一所需个体，以降低该所需个体的血液中的尿酸含量。
13.本发明的胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株的用途，其中，该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株以口服的方式投予该所需个体。如此，使用者能够利用简便的方式摄取该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株，进而使该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株得以于该所需个体体内发挥作用，为本发明的功效。
14.本发明的胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株的用途，其中，该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株以1.25
×
105～2.5
×
105cfu/公斤/天的剂量，连续投予该所需个体7～30天。如此，通过投予剂量的调整，使该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株能够有效地发挥其生物活性。
附图说明
15.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
16.图1a：本发明的胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株与其他胚芽乳酸杆菌菌株的16s rdna基因的演化亲缘关系图；
17.图1b：本发明的胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株与其他胚芽乳酸杆菌菌株的clpp基因的演化亲缘关系图；
18.图2：试验(a)中，不同环境中，胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株的存活率变化柱状图；
19.图3：试验(b)中，各组胚芽乳酸杆菌菌株的黄嘌呤分解率变化柱状图；
20.图4：试验(c)中，各组胚芽乳酸杆菌菌株的黄嘌呤氧化酶抑制率变化柱状图。
具体实施方式
21.为让本发明的上述及其他目的、特征及优点能更明显易懂，下文列举本发明的较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下：
22.本发明的胚芽乳酸杆菌(lactobacillus plantarum)bfa-la04菌株能够分解黄嘌呤，也能够抑制黄嘌呤氧化酶的活性，进而可以抑制尿酸的生成，因而能够作为一高尿酸血症药物。
23.该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株自香瓜果实中选殖获得，详而言之，将香瓜果实榨汁后，将香瓜果实原汁涂布于含碳酸钙的mrs固态培养基(配方如表1所示)上，在挑选单一菌落之后，进一步自其中筛选出该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株。该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株已于2020年01月20日寄存于日本独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生物寄存中心(nite patent microorganisms depositary，npmd)，其寄存编号为nite bp-03110。
24.表1用以培养胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株的mrs固态培养基的配方
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此外，对该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株进行16s rdna及clpp基因的分子鉴定，该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株具有如seq id no：1所示的16s rdna基因序列，及具有如seq id no：2所示的clpp基因序列，将该16s rdna基因序列及该clpp基因序列分别于美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology；简称ncbi)的序列比对资料库(blast)进行比对，其结果分别如表2、表3所示。
[0028]
表2胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株的16s rdna基因序列之比对结果
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表3胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株的clpp基因序列之比对结果
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又，以该16s rdna基因序列及该clpp基因序列可以分别绘出如图1a、图1b所示的亲缘关系树图，显示该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株为属于胚芽乳酸杆菌的新颖菌株。
[0033]
该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株与医药学上可以接受的载剂或赋形剂组合形成一医药组成物或一食品组合物，也可以于该医药组合物或该食品组合物中，额外添加他种有助于尿酸代谢的活性成分(例如，绿茶多酚、山楂等)及/或他种有助于抑制黄嘌呤氧化酶的活性成分(例如，花青素、姜黄素等)，并可以制备成任何方便食用的型式，如锭剂、胶囊、粉剂、粒剂或液剂等，以适于食用的形式供生物体以口服方式服用。
[0034]
又，该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株可以供投予一所需个体，例如以1.25
×
105～2.5
×
105cfu/公斤/天的剂量，连续投予该所需个体7～30天，使该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株所含有的活性成分得以于该所需个体体内作用。
[0035]
为证实具有该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株确实能够分解黄嘌呤，并可以抑制黄嘌呤氧化酶，遂进行以下试验：
[0036]
(a)胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株的耐酸及耐胆盐测试
[0037]
为证实本发明胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株可以存活于强酸环境中，本试验将培养至停滞期(stationary phase)的胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株，分别以ph为6.5及ph为3.0的mrs液态培养基静置培养3小时，续以连续稀释法，取得适当稀释倍数后，涂盘至mrs固态培养基中，于37℃培养24小时之后，计数菌数。
[0038]
请参照图2所示，在ph为3.0的环境中，经过3小时之后，仍有约105cfu/ml的胚芽乳
酸杆菌bfa-la04菌株存活，显示该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株可以存活于强酸环境中，因此可以通过胃液，进入肠道以发挥其作用。
[0039]
接着，为证实本发明胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株可以存活于具有胆盐的环境中，本试验另外将培养至停滞期的胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株，分别以含0.2％、0.3％及0.4％的胆盐的mrs培养基静置培养3小时，续以连续稀释法，取得适当稀释倍数后，涂盘至mrs固态培养基中，同样于37℃培养24小时之后，计数菌数。
[0040]
请参照图2所示，在含0.2％、0.3％、0.4％胆盐的环境中，经过3小时之后，存活菌数仍可以达到105cfu/ml以上，显示该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株也可以存活于含有胆盐的环境中，因此可以长时间存活于肠道之中，以发挥其作用。
[0041]
(b)胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株的黄嘌呤分解能力
[0042]
本试验比较选殖自香瓜果实中的新颖胚芽乳酸杆菌菌株(即，该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株)与其他同属同种的胚芽乳酸杆菌菌株的黄嘌呤分解能力。详而言之，所述其他同属同种的胚芽乳酸杆菌菌株包含购自中国台湾食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心的胚芽乳酸杆菌菌株，其编号分别为bcrc 10069及bcrc 910787。
[0043]
将前述胚芽乳酸杆菌菌株培养至停滞期之后，将菌加入稀释10倍的mrs液态培养基中，并添加黄嘌呤与葡萄糖，于培养2、4小时之后，取得上清液，续以hplc分析其中的黄嘌呤含量，进而换算各胚芽乳酸杆菌菌株的黄嘌呤分解率。
[0044]
请参照图3所示，在培养2小时之后，该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株的黄嘌呤分解率即已高于其他同属同种的胚芽乳酸杆菌菌株(bcrc 910787、bcrc 10069，p＜0.05)，而在培养4小时之后，该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株的黄嘌呤分解率即已高于其他同属同种的胚芽乳酸杆菌菌株(bcrc 910787、bcrc 10069，p＜0.02)，显示相较于其他同属同种的胚芽乳酸杆菌菌株，该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株确实具有较佳的黄嘌呤分解能力。
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(c)胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株的黄嘌氧化酶抑制能力
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本试验同样将前述胚芽乳酸杆菌菌株培养至停滞期之后，加入新的mrs液态培养基，并于培养2、4、6小时之后，取得上清液，续将黄嘌呤氧化酶加入上清液中，于37℃反应10分钟，加入黄嘌呤之后再于37℃反应30分钟，最后以盐酸终止反应，再以hplc分析其中的尿酸含量，进而换算各胚芽乳酸杆菌菌株的黄嘌呤氧化酶抑制率。
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请参照图4所示，无论是在培养2、4、6小时之后，该胚芽乳酸杆菌bfa-la04的黄嘌呤氧化酶抑制率均明显高于其他同属同种的胚芽乳酸杆菌菌株(bcrc 910787、bcrc 10069，p≦0.001)，显示相较于其他同属同种的胚芽乳酸杆菌菌株，该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株确实具有较佳的黄嘌呤氧化酶抑制能力。
[0048]
综上所述，本发明的胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株不仅能够分解黄嘌呤，也可以抑制黄嘌呤氧化酶的活性，因而能够作为一种降尿酸的活性成分，并可以应用于制备高尿酸血症药物，针对投予现有促进尿酸排泄药或现有抑制尿酸生成药会诱发副作用的患者，提供一个降尿酸的选择，为本发明的功效。
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再者，本发明的胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株由于能够应用于制备高尿酸血症药物，因此可以供投予该所需个体，使该胚芽乳酸杆菌bfa-la04菌株得以于该所需个体体内发挥作用，降低该所需个体的血液中的尿酸含量，进而防止高尿酸血症所导致的痛风、糖尿病、肾脏疾病、动脉硬化及脑心血管疾病等并发症的发生，为本发明的功效。