多功能的融合蛋白及其用途的制作方法

1.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)请求在2019年1月7日所提交的美国临时专利申请案第62/789,212号的优先权，其内容通过引用整体并入本文中。


背景技术：

2.多种途径调节受感染细胞及癌细胞的存活，以及诸如t细胞及自然杀手(natural killer，nk)细胞的免疫系统的细胞的激活或抑制。向t细胞提供共刺激第二信号及抑制性第二信号的一途径是由程序性死亡1(programmed death 1，pd
‑
1，亦称为cd279)受体及其配体、pd
‑
l1(b7
‑
h1，cd274)及pd
‑
l2(b7
‑
dc，cd273)表示。pd
‑
1是cd28/ctl4家族的成员，其在活化的t细胞而非静息态t细胞上表达(nishimura等人(1996)int.immunol.8：773)。pd
‑
1与其配体的结合介导一抑制信号，其导致降低细胞因子的产生，以及降低t细胞的存活率(nishimura等人(1999)immunity 11：141；nishimura等人(2001)science 291：319；开姆尼茨等人(2004)j.immunol.173：945)。
3.病毒的巨噬细胞炎症蛋白
‑
ii(vmip
‑
ii)是由人类疱疹病毒8(hhv
‑
8)所编码的一趋化因子，其可与cc及cxc趋化因子受体相互作用，包括ccr5及cxcr4趋化因子受体。vmip
‑
ii对于hiv
‑
1进入的抑制是通过ccr3、ccr5及cxcr4所介导的，ccr3、ccr5及cxcr4是hiv
‑
1进入一靶细胞的hiv
‑
1受体。
4.正信号及负信号的复杂的相互作用调节t细胞的活化及t细胞效应因子功能的维持。tnf配体/tnf受体超家族的成员、免疫系统的桥接细胞以及其他器官系统的细胞在此信号矩阵中扮演重要角色。在此过程中，tnf超家族成员通过影响细胞存活及死亡、细胞分化及炎症，促进体内平衡及发病机制。
5.仍然需要用于治疗诸如癌症的疾病的改良疗法。本发明解决此种需要。


技术实现要素：

6.如本文所述，本发明涉及具有多点分子附着能力的一融合蛋白以及其使用的方法。
7.本发明的一方面包括一种融合蛋白，所述融合蛋白包括组分a及/或组分b。组分a包括组分y、组分z2及组分z3。组分b包括组分x’、组分z2’
及组分z3’
。
8.本发明的另一方面包括一种融合蛋白，所述融合蛋白包括组分a、组分b，及组分c。组分a包括组分y、组分z2及组分z3。组分b包括组分x’、组分z2’
及组分z3’
。组分c包括组分x及组分c’l
。组分y包括pd
‑
1的至少一部分，组分z2及组分z2’
包括人类fc的ch2结构域，及组分z3及组分z3’
包括人类fc的ch3结构域。组分x’及组分x包括vmip
‑
ii的至少一部分，以及组分c
l’包括人类igg1κ的至少一ch1结构域。
9.本发明的又另一方面包括一种产生一融合蛋白的方法。所述方法包括向所述细胞施予编码人类pd
‑1‑
hfca的一第一核酸、编码vmipii
‑
ch
’‑
hfcb的一第二核酸，以及编码vmipii
‑
cl’的一第三核酸。
10.本发明的又另一方面包括一种融合蛋白，所述融合蛋白包括如seq id no：14、seq id no：49及seq id no：57所示的氨基酸序列。
11.在另一方面，本发明包括一种药物组合物，所述药物组合物包括一药学上可接受的载体及如本文所述的多个融合蛋白中的任一者。
12.在另一方面，本发明包括一种治疗一患者的一增殖性疾病的方法。所述方法包括向有需要此种治疗的一患者施予一治疗有效量的如本文所述的多个融合蛋白中的任一者。
13.在以上方面或本文所描述的本发明的任何其他方面的各种实施例中，组分b进一步包括组分z1’
。在某些实施例中，组分a进一步包括组分z1。
14.在某些实施例中，所述融合蛋白进一步包括组分c，其中组分c包括组分x及组分c
l’。
15.在某些实施例中，所述融合蛋白进一步包括组分d，其中组分d包括组分q及组分c
l
。
16.在某些实施例中，组分y包括一配体结构域、一受体结构域、一scfv结构域或一脂质运载蛋白结构域(lipocalin domain)。在某些实施例中，组分y包括pd
‑
1、cd112r、cd113或mhc
‑
i多肽相关的序列a(mica)的至少一部分。
17.在某些实施例中，所述融合蛋白与pd
‑
l1或pd
‑
l2结合。
18.在某些实施例中，组分x’包括一病毒衍生的肽、一配体衍生的肽、一受体衍生的肽，或一hts选择的肽。
19.在某些实施例中，组分x’包括vmip
‑
ii的至少一部分。在某些实施例中，
20.在某些实施例中，组分x’包括v1或v1δ。
21.在某些实施例中，组分x包括一病毒衍生的肽、一配体衍生的肽、一受体衍生的肽或一hts选择的肽。在某些实施例中，组分x包括v1或v1δ。
22.在某些实施例中，所述融合蛋白与cxcr4结合。
23.在某些实施例中，组分y及组分z2通过一铰链连接。在某些实施例中，组分z1’
及组分z2’
通过一铰链连接。
24.在某些实施例中，组分x’及组分z1’
通过一连接子(lilnker)连接。在某些实施例中，组分x及组分c
l
通过一连接子连接。在某些实施例中，组分q及组分c
l
通过一连接子连接。
25.在某些实施例中，所述融合蛋白与一免疫细胞上的一受体或配体结合。在某些实施例中，所述受体是一fc受体。
26.在某些实施例中，x’包括pd
‑
1、tigit、cd96、cd112r、cd113、cd155、cd111、cd112、mhc
‑
i多肽相关的序列a(mica)、nkg2a(cd94)、micb、ulbp1
‑
5、tim
‑
3、cd226、necl2、crtam、cd80、ctla
‑
4、kir2dl1/2/3，或cd48的至少一部分。
27.在某些实施例中，组分y包括pd
‑
1、tigit、cd96、cd112r、cd113、cd155、cd111、cd112、mhc
‑
i多肽相关的序列a(mica)、nkg2a(cd94)、micb、ulbp1
‑
5、tim
‑
3、cd226、necl2、crtam、cd80、ctla
‑
4、kir2dl1/2/3，或cd48的至少一部分。
28.在某些实施例中，组分x包括pd
‑
1、tigit、cd96、cd112r、cd113、cd155、cd111、cd112、mhc
‑
i多肽相关的序列a(mica)、nkg2a(cd94)、micb、ulbp1
‑
5、tim
‑
3、cd226、necl2、crtam、cd80、ctla
‑
4、kir2dl1/2/3，或cd48的至少一部分。
29.在某些实施例中，组分q包括pd
‑
1、tigit、cd96、cd112r、cd113、cd155、cd111、
cd112、mhc
‑
i多肽相关的序列a(mica)、nkg2a(cd94)、micb、ulbp1
‑
5、tim
‑
3、cd226、necl2、crtam、cd80、ctla
‑
4、kir2dl1/2/3，或cd48的至少一部分。
30.在某些实施例中，组分a包括如seq id nos：14至22中任一者所示的氨基酸序列。
31.在某些实施例中，组分b包括如seq id nos：32至35中任一者所示的氨基酸序列。在某些实施例中，组分b包括如seq id nos：49至55中任一者所示的氨基酸序列。
32.在某些实施例中，组分a包括如seq id nos：14至22中任一者所示的氨基酸序列，以及组分b包括如seq id nos：32至35中任一者所示的氨基酸序列。
33.在某些实施例中，组分c包括如seq id nos：57至63中任一者所示的氨基酸序列。
34.在某些实施例中，组分b包括如seq id nos：49至55中任一者所示的氨基酸序列，以及组分c包括如seq id nos：57至63中任一者所示的氨基酸序列。
35.在某些实施例中，所述融合蛋白能够结合(i)pd
‑
l1或pd
‑
l2，(ii)cxcr4，以及(iii)一免疫细胞上的一fc受体或配体。
36.在某些实施例中，组分a包括如seq id no：29所示的氨基酸序列，以及组分b包括如seq id no：30所示的氨基酸序列。
37.在某些实施例中，组分y包括如seq id no：1或seq id no：2所示的氨基酸序列。
38.在某些实施例中，组分z2包括如seq id no：12所示的氨基酸序列及/或组分z3包括如seq id no：13所示的氨基酸序列。
39.在某些实施例中，组分a包括如seq id no：14或seq id no：15所示的氨基酸序列。
40.在某些实施例中，组分b包括如seq id no：49所示的氨基酸序列。
41.在某些实施例中，组分x’包括如seq id no：37所示的氨基酸序列。在某些实施例中，组分x包括如seq id no：37所示的氨基酸序列。
42.在某些实施例中，组分z2’
包括如seq id no：12所示的氨基酸序列及/或组分z3’
包括如seq id no：48所示的氨基酸序列。
43.在某些实施例中，组分c
l’包括如seq id no：64所示的氨基酸序列。
44.在某些实施例中，组分b包括如seq id no：53所示的氨基酸序列。
45.在某些实施例中，组分c包括如seq id no：61所示的氨基酸序列。
46.在某些实施例中，组分a包括如seq id nos：14所示的氨基酸序列，组分b包括如seq id nos：53所示的氨基酸序列，以及组分c包括如seq id nos：61所示的氨基酸序列。
47.在某些实施例中，所述方法包括其中所述第一核酸编码如seq id no：14所示的氨基酸序列，及/或所述第二核酸编码如seq id no：49所示的氨基酸序列，及/或所述第三核酸编码如seq id no：57所示的氨基酸序列。
48.在某些实施例中，所述增殖性疾病是癌症。在某些实施例中，所述癌症是一实体肿瘤。在某些实施例中，所述癌症是胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、黑色素瘤(melanoma)、胶质母细胞瘤(glioblastoma)、急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，all)、急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia，aml)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)或结肠癌。
附图说明
49.当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的优选的实施例的以下详细描述。为了
说明本发明，在附图中示出目前优选的实施例。然而，应当理解，本发明并不限于附图中所示的实施例的精确的设置及手段。
50.图1a及图1b是一融合蛋白平台的一些实施例的示意图。
51.图2是一融合蛋白平台的一些实施例的示意图。所述图说明靶向自然杀手(natural killer，nk)细胞：肿瘤细胞界面的一融合蛋白。
52.图3是与cxcr4、pd
‑
l1及fcγriiia结合的一融合蛋白的示意图。
53.图4是与cxcr4、pd
‑
l1及fcγriiia结合的一融合蛋白与一癌细胞及nk细胞相互作用的示意图。
54.图5是与cxcr4、pd
‑
l1及fcγriiia结合的一融合蛋白与各种类型的细胞可能的相互作用的示意图。
55.图6是与各种融合蛋白的各种类型的细胞的可能的相互作用的示意图。
56.图7是与各种融合蛋白的各种类型的细胞的可能的相互作用的示意图。
57.图8是与各种融合蛋白的肿瘤相关巨噬细胞(m1)可能的相互作用的示意图。
58.图9是hpd
‑1‑
fca/hfcb(seq id no：14加上seq id no：36)的考马斯蓝(coomassie blue)染色的(还原的)sds
‑
page凝胶。
59.图10是hfca/hfcb(seq id no：23加上seq id no：36)的考马斯蓝(coomassie blue)染色的sds
‑
page凝胶。
60.图11是hmica
‑
fca/hfcb(seq id no：22加上seq id no：36)的考马斯蓝(coomassie blue)染色的sds
‑
page凝胶。
61.图12是hfca/htigit
‑
fcb(seq id no：14加上seq id no：36)、hfca/hcd155
‑
fcb(seq id no：23加上seq id no：32)、hfca/hfcb(seq id no：23加上seq id no：36)及hmica
‑
fca/htigit
‑
fcb(seq id no：22加上seq id no：33)的考马斯蓝(coomassie blue)染色的(还原的)sds
‑
page凝胶。
62.图13是hcd112r
‑
fca/hfcb(seq id no：16加上seq id no：36)的考马斯蓝(coomassie blue)染色的sds
‑
page凝胶。
63.图14是ha
‑
pd
‑1‑
fca/hcd113
‑
fcb(seq id no：15加上seq id no：35)的考马斯蓝(coomassie blue)染色的sds
‑
page凝胶。
64.图15是hfca/hcd113
‑
fcb(seq id no：23加上seq id no：33)及pd
‑1‑
hfca/hcd113
‑
fcb(seq id no：14加上seq id no：35)的考马斯蓝(coomassie blue)染色的sds
‑
page凝胶。
65.图16是hfca/hcd155
‑
fcb(seq id no：23加上seq id no：32)的考马斯蓝(coomassie blue)染色的sds
‑
page凝胶。
66.图17是hfca/tim
‑3‑
hfcb(seq id no：23加上seq id no：34)及pd
‑1‑
hfca/tim
‑3‑
hfcb(seq id no：14加上seq id no：34)的考马斯蓝(coomassie blue)染色的sds
‑
page凝胶。
67.图18显示hfca/htigit
‑
fcb(seq id no：23加上seq id no：33)与表达人类cd155的细胞结合。
68.图19显示hfca/htigit
‑
fcb(seq id no：23加上seq id no：33)与表达人类cd112的细胞结合。
69.图20显示hfca/htigit
‑
fcb(seq id no：23加上seq id no：33)与表达人类tigit的细胞结合。
70.图21显示hfca/htigit
‑
fcb(seq id no：23加上seq id no：33)及hfca/hcd155
‑
fcb(seq id no：23加上seq id no：32)与表达cd16(fcγriiia)的细胞结合。
71.图22显示在sds
‑
page，考马斯(coomassie)凝胶染色上分离的及还原(reduced，r)的融合蛋白。如所描绘，
‘
a’是指hfca/hfcb(seq id no：23加上seq id no：36)，
‘
b’是指pd
‑1‑
hfca/fcb(seq id no：14加上seq id no：36)，
‘
c’是指hfca/vpi
‑
ch
’‑
fcb/vpi
‑
cl(seq id no：23加上seq id no：53及seq id no：61)以及
‘
d’是指pd
‑1‑
hfca/vpi
‑
ch
’‑
fcb/vpi
‑
cl(seq id no：14加上seq id no：53及seq id no：61)。
72.图23a至23d是一系列蛋白质印迹。对来自使用表达构建体所转染的expi
‑
cho细胞的条件培养基的蛋白
‑
a纯化的融合蛋白进行蛋白质印迹分析，如图22所示。所观察到的条带与pd
‑1‑
hfca(seq id no：14)及vmipii
‑
cl’(seq id no：57)的预期的一致；针对非还原的(non
‑
reduced，nr)样品为125kda，针对还原的(reduced，r)样品分别为60kda及20kda。使用(图23a)抗pd1的抗体、(图23b)抗iggκ轻链的抗体、(图23c)抗igg重链的抗体及(图23d)抗vmip
‑
ii的抗体探测蛋白质印迹。
73.图24显示融合蛋白与b16黑色素瘤细胞株结合，所述b16黑色素瘤细胞株在其细胞表面上表达pd
‑
l1及cxcr4或cxcr7。测试的融合蛋白是(从上至下的顺序)：hfca/hfcb(seq id no：23加上seq id no：36)、pd
‑1‑
hfca/fcb(seq id no：14加上seq id no：36)、hfca/v1δmut
‑
ch
’‑
fcb/v1δmut
‑
cl’(seq id no：23加上seq id no：52及seq id no：60)、hfca/v1δ
‑
ch
’‑
fcb/v1δ
‑
cl’(seq id no：23加上seq id no：51及seq id no：59)、pd
‑1‑
hfca/v1δmut
‑
ch
’‑
fcb/v1δmut
‑
cl’(seq id no：14加上seq id no：52及seq id no：60)及pd
‑1‑
hfca/v1δ
‑
ch
’‑
fcb/v1δ
‑
cl’(seq id no：14加上seq id no：51及seq id no：59)。
74.图25显示一transwell分析，测量融合蛋白对于黑色素瘤细胞迁移的抑制作用。显示使用100ng/ml的cxcl12及融合蛋白处理的迁移的b16
‑
f10细胞的单一transwell迁移分析的代表性图像。经测试的融合蛋白是(从上至下的顺序)：hfca/hfcb(seq id no：23加上seq id no：36)、pd
‑1‑
hfca/fcb(seq id no：14加上seq id no：36)、hfca/v1δmut
‑
ch
’‑
fcb/v1δmut
‑
cl’(seq id no：23加上seq id no：52及seq id no：60)、hfca/v1δ
‑
ch
’‑
fcb/v1δ
‑
cl’(seq id no：23加上seq id no：51及seq id no：59)、pd
‑1‑
hfca/v1δmut
‑
ch
’‑
fcb/v1δmut
‑
cl’(seq id no：14加上seq id no：52及seq id no：no：60)以及pd
‑1‑
hfca/v1δ
‑
ch
’‑
fcb/v1δ
‑
cl’(seq id no：14加上seq id no：51及seq id no：59)。分析是使用2％结晶紫进行染色。
75.图26a至图26b显示在b16f10黑色素瘤皮下模型中通过融合蛋白(fusion protein，fp)pd1
‑
hfca/v1δ
‑
ch
’‑
hfcb/v1δ
‑
cl’(seq id no：14加上seq id no：51及seq id no：59)所介导的肿瘤生长的抑制。c57bl/6小鼠在皮下注射接种1
×
105个b16f10肿瘤细胞后，在第13、14、15、16及21天使用含有100μl(10g/ml)fp的pbs(小鼠r、小鼠2l及小鼠2r)或仅pbs(小鼠x或小鼠l)进行治疗。在图26a中检测并绘制各只小鼠的肿瘤尺寸随时间的变化。图26b显示来自仅pbs治疗组(顶部)及pd1
‑
hfca/v1δ
‑
ch
’‑
hfcb/v1δ
‑
cl’(fp)治疗组(底部)的一只小鼠的代表性图像。
76.图27显示通过添加多功能的融合蛋白增强nk细胞介导的adcc。将skov
‑
3卵巢细胞
株[靶细胞(t)]以3000个细胞/孔接种在96孔盘中，使其粘附，并使用细胞质红色荧光探针(celltracker red cmtpx)试剂进行标记。之后使用一绿色荧光caspase
‑
3试剂标记skov
‑
3细胞。将cd16.nk
‑
92细胞株[v158变体，即效应因子细胞(e)]以e：t为5：1的比率与各种融合蛋白为25mg/ml或无蛋白加入孔中，并使用incucyte活细胞分析系统，检测荧光双阳性(红色 绿色)的细胞的数量。所显示的结果描述20小时的时间点。经测试的融合蛋白：高亲和力(ha)
‑
pd
‑1‑
hfca/fcb(seq id no：15加上seq id no：36)、hfca/hcd113
‑
fcb(seq id no：23加上seq id no：35)以及高亲和力(ha)
‑
pd
‑1‑
hfca/hcd113
‑
fcb(seq id no：15加上seq id no：35)。
具体实施方式
[0077]
除非另有定义，本文所使用的所有技术及科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所述的彼等相似或等效的任何方法及材料可用于测试本发明的实施中，但本文描述优选的材料及方法。在描述级要求保护本发明时，将使用以下术语。
[0078]
亦应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在进行限制。
[0079]
冠词“一(a)”及“一(an)”在本文中用于指代冠词的一个或一个以上(即至少一个)语法对象。例如，“一元素”是指一个元素或一个以上的元素。
[0080]
当提及诸如数量、持续时间等可测量值时，本文所用的“大约”意在涵盖指定值的
±
20％或
±
10％、更优选地
±
5％、甚至更优选地
±
1％，且更优选地
±
0.1％的变化，因为此种变化适合于执行所公开的方法。
[0081]
如本文中所使用，“活化”是指已被充分地刺激，以诱导细胞因子的产生、可检测的效应子功能，以及细胞增殖中的一或多者的t细胞的状态。术语“活化的t细胞”是指显示一或多个此等活化特征的t细胞等。
[0082]
如本文中所使用，术语“抗体”是指与一抗原特异性地结合的一免疫球蛋白分子。抗体可为衍生自天然来源或重组来源的完整的免疫球蛋白，且可为完整的免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体，亦可作为此种四聚体的高级多聚体存在。本发明中的抗体可以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、fv、fab及f(ab)2，以及单链抗体(scfv)及人源化抗体(哈洛等人，1999，在：使用抗体：实验室手册，cold spring harbor laboratory press，ny；哈洛等人，1989，在：抗体：实验室手册，cold spring harbor，new york；休斯顿人，1988，proc.natl.acad.sci.usa 85：5879
‑
5883；伯德等人，1988，science 242：423
‑
426)。
[0083]
术语“抗体片段”是指一完整的抗体的一部分，以及是指一完整的抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括，但不限于，fab、fab’、f(ab’)2及fv片段、线性抗体、scfv抗体以及由抗体片段所形成的多特异性抗体。
[0084]
如本文中所使用，一“抗体重链”是指以其自然发生的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较大者。伽玛(γ)、姆(μ)、德尔塔(δ)、阿尔法(α)及伊普西龙(ε)重链是指五种主要的抗体重链同型。
[0085]
如本文中所使用，一“抗体轻链”是指以其自然发生的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较小者。卡帕(κ)及拉姆达(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同型。
[0086]
如本文中所使用，术语“合成的抗体”是指使用重组dna技术产生的抗体，例如由本文所述的噬菌体所表达的抗体。所述术语亦应解释为表示通过合成编码抗体的dna分子所产生的抗体，且所述dna分子表达编码一抗体蛋白的rna，或指定抗体的氨基酸序列，其中dna、rna或氨基酸序列已使用本领域可取得且众所周知的合成核酸或氨基酸序列的技术获得。
[0087]
如本文中所使用，术语“抗原”或“ag”被定义为诱导免疫反应或结合一免疫识别部分，例如一抗体及一t细胞受体的一分子。此免疫反应可涉及抗体的产生，或特定免疫性胜任细胞的激活，或两者。本领域技术人员会理解任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，皆可用作一抗原。此外，抗原可衍生自重组dna或基因组dna。本领域技术人员将理解，包括编码引发一免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna，因此编码本文中所使用的术语“抗原”。再者，本领域技术人员将理解抗原无需仅由一基因的全长核苷酸序列编码。很明显的，本发明包括，但不限于使用一种以上基因的部分核苷酸序列，且此等核苷酸序列以各种组合排列，以引发所需的免疫反应。此外，本领域技术人员将理解抗原根本无需由一“基因”编码。很明显的，抗原可从一生物样品中产生、合成或衍生。此种生物样品可包括，但不限于一组织样品、一肿瘤样品、一细胞或一生物流体。
[0088]
如本文中所使用，术语“抗肿瘤作用”是指可表明为肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加，或改善与癌症状况相关的各种生理症状的一生物性效果。“抗肿瘤作用”亦可通过本发明的肽、多核苷酸、细胞及抗体在预防肿瘤出现在首次出现的位置的能力来表明。
[0089]
根据本发明，术语“自身抗原”是指被免疫系统识别为外来的任何自身抗原。自身抗原包括，但不限于，细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
[0090]
如本文中所使用，术语“自身免疫病”被定义为由一自身免疫反应引起的一病症。自身免疫性疾病是对一自身抗原的不适当及过度反应的结果。自身免疫性疾病的例子包括但不限于，阿狄森氏病(addision’s disease)、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩病(crohn’sdisease)、糖尿病(第i型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病(graves’disease)、格林
‑
巴尔综合征(guillain
‑
barr syndrome)、桥本氏病(hashimoto’s disease)、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力症、寻常型天疱疮、银屑病、风湿病、类风湿性关节炎、类肉瘤病、硬皮病、薛格连氏综合征(sjogren's syndrome)、脊椎关节病、甲状腺炎、血管炎、白斑症、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等。
[0091]
如本文中所使用，术语“自身的(autologous)”是指源自同一个体的任何材料，随后将其重新引入所述个体。
[0092]“同种异体(allogeneic)”是指源自同一物种的不同动物的一移植物。
[0093]“异种异体(xenogeneic)”是指源自不同物种的动物的一移植物。
[0094]
如本文中所使用，术语“癌症”被定义为特征在于异常细胞的快速且不受控制的增殖及/或积累的疾病。癌细胞可局部扩散或通过血流及淋巴系统扩散至身体的其他部位。各种癌症的例子包括但不限于，乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。在某些实施例中，癌症是甲状腺髓样癌
(medullary thyroid carcinoma)。
[0095]
术语“裂解(cleavage)”是指共价键的断裂，例如在一核酸分子的主链中。裂解可通过多种方法引发，包括，但不限于，磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链裂解及双链裂解皆是可能的。双链裂解可作为两个不同的单链裂解事例的结果而发生。dna裂解可导致产生钝端(blunt end)或交错末端(staggered end)。在某些实施例中，融合多肽可用于靶向裂解的双链dna。
[0096]
如本文中所使用，术语“保守序列修饰(conservative sequence modification)”旨在指不显着地影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此种保守修饰包括氨基酸置换、添加及缺失。通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变及pcr介导的诱变，可将修饰引入本发明的一抗体中。保守氨基酸置换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中定义。此等家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β
‑
支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，一抗体的cdr区内的一或多个氨基酸残基可被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基取代，且可使用本文中所述的功能分析法测试改变的抗体结合抗原的能力。
[0097]“疾病(disease)”是一动物的健康状态，其中所述动物无法维持体内平衡，倘若疾病未改善，则动物的健康继续恶化。相较之下，动物的一“病症(disorder)”是一健康状态，在此种状态下，动物能够维持体内平衡，但动物的健康状况不如无疾病时的健康状态。倘若未加以治疗，一病症不一定会导致动物的健康状况进一步下降。
[0098]“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，是指如本文所述的有效实现一特定生物学结果或提供一治疗或预防益处的一化合物、制剂、材料或组合物的量。此种结果可包括，但不限于，通过本领域任何合适的方法所确定的抗肿瘤活性。
[0099]“编码”是指多核苷酸，例如基因、cdna或mrna)中特定核苷酸序列的固有特性，可用作在生物过程中合成其他聚合物及大分子的模板，此等聚合物及大分子具有一确定的核苷酸序列(即，rrna、trna及mrna)或一确定的氨基酸序列及由此产生的生物学特性。因此，倘若一基因转录为mrna，且对应于所述基因的mrna在细胞或其他生物系统中进行转译产生一蛋白质，则所述基因编码所述蛋白质。编码链，其核苷酸序列与mrna序列相同，且通常在序列表中提供，以及非编码链，用作一基因或cdna转录的模板，皆可被称为编码蛋白质或所述基因或cdna的其他产物。
[0100]
如本文中所使用，“内源性”是指来自一生物体、细胞、组织或系统的任何材料或在一生物体、细胞、组织或系统的内部所产生的任何材料。
[0101]
如本文中所使用，术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或产生于生物体、细胞、组织或系统之外的任何材料。
[0102]
如本文中所使用，术语“扩增(expand)”是指数量增加，如t细胞数量增加。在一实施例中，离体扩增的t细胞的数量相对于原始存在于培养物中的数量增加。在另一实施例中，离体扩增的t细胞相对于培养物中的其他细胞类型在数量上增加。如本文中所使用，术
语“离体(ex vivo)”是指已从一活生物体(例如，人类)中取出，且在所述生物体的外部(例如，在一培养皿、试管或生物反应器中)繁殖的细胞。
[0103]
如本文中所使用，术语“表达”定义为一特定的核苷酸序列通过其调节元件，例如一启动子所驱动的转录及或转译。
[0104]“表达载体”是指包括一重组多核苷酸的一载体，所述重组多核苷酸包括与待表达的一核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。一表达载体包括用于表达的足够的顺式作用元件(cis
‑
acting element)；其他表达元件可由宿主细胞或在一体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有彼等，例如结合重组多核苷酸的粘质体、质粒(例如，裸露的或包括在脂质体中)及病毒(例如，仙台病毒(sendai virus)、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒)。
[0105]
如本文中所使用，“同源”是指在两个聚合分子之间，例如两个核酸分子之间，例如两个dna分子或两个rna分子之间，或两个多肽分子之间的亚基序列的同一性。当两个分子中的一亚基位置被同一单体亚基占据时；例如，倘若两个dna分子中的各个中的一位置被腺嘌呤占据，则其在所述位置是同源的。两个序列之间的同源性是相匹配位置或同源位置的数量的一直接函数；例如，倘若两个序列中一半(例如，十个亚基长度的聚合物中的五个位置)的位置是同源的，则两个序列具有50％的同源性；倘若90％的位置(例如，10个中的9个)是相匹配的或同源的，则两个序列具有90％的同源性。
[0106]
非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如fv、fab、fab’、f(ab’)2或抗体的其他抗原结合亚序列)，其包括衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的一互补决定区(complementary
‑
determining region，cdr)的残基被来自一非人类物种(供体抗体)，例如小鼠、具有所需特异性、亲和力及能力的大鼠或兔子的残基取代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的fv框架区(framework region，fr)残基被相应的非人类残基取代。此外，人源化抗体可包括既不在受体抗体中，且亦不在导入的cdr或框架序列中所发现的残基。进行此等修饰是为了进一步完善及优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包括基本上所有的至少一个，通常为两个可变域，其中所有或基本上所有的cdr区对应于一非人类免疫球蛋白的彼等cdr区及所有或基本上所有的fr区是人类免疫球蛋白序列的fr区。人源化抗体优选地亦包括一免疫球蛋白恒定区(immunoglobulin constant region，fc)的至少一部分，通常是一人类免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见琼斯等人，nature，321：522
‑
525，1986；赖希曼等人，nature，332：323
‑
329，1988，presta，curr.op.struct.biol.，2：593
‑
596，1992。
[0107]“完全人源”是指一免疫球蛋白，例如一抗体，其中整个分子是人类来源的或由与所述抗体的一人类形式相同的一氨基酸序列组成。
[0108]
如本文中所使用，“同一性”是指两个聚合分子之间，特别是两个氨基酸分子之间，例如，两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个氨基酸序列在相同位置具有相同残基时；例如，倘若两个多肽分子中的各个中的一位置被精氨酸占据，则其在所述位置是相同的。两个氨基酸序列在比对中的相同位置具有相同残基的同一性或程度通常是以百分比表示。两个氨基酸序列之间的同一性是相匹配的位置或相同的位置的数量的一直接函数；例如，倘若两个序列中一半(例如，十个氨基酸长度的聚合物中的五个位置)的位置是同一性
的，则两个序列具有50％的同一性；倘若90％的位置(例如，10个中的9个)是相匹配的或同源的，则两个序列具有90％的同一性。
[0109]
如本文中所使用，术语“免疫球蛋白”或“ig”被定义为蛋白质的一类别，其作为抗体进行作用。通过b细胞表达的抗体有时称为bcr(b细胞受体)或抗原受体。包括在此种别的蛋白质中的五个成员是igg、igm、igd、iga及ige。igg是最常见的循环抗体。igm是大多数受试者在初级免疫反应中产生的主要免疫球蛋白。其是在凝集、补体固定及其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，且在防御细菌及病毒方面很重要。igd是一种免疫球蛋白，无已知的抗体功能，但可作为一抗原受体。iga是存在于身体分泌物中的主要抗体，例如唾液、眼泪、母乳、胃肠道分泌物以及呼吸道及泌尿生殖道的粘液分泌物。ige是一种免疫球蛋白，通过在暴露于过敏原时导致来自肥大细胞及嗜碱性粒细胞所释放的介质来介导即时超敏反应。
[0110]
如本文中所使用，术语“免疫反应”被定义为当淋巴细胞将抗原分子识别为外来物，并诱导抗体的形成及/或激活淋巴细胞，以去除抗原时，发生对一抗原的一细胞反应。
[0111]
如本文中所使用，术语“脂质运载蛋白(lipocalin)”被定义为蛋白质的一类别，其在自然环境中运输疏水性分子，例如类固醇、比林(bilin)、类视网醇及脂质。其共享序列同源性的有限区域及一共同的三级结构架构，所述共同的三级结构架构包括一个八链反平行β桶，其具有包括一内部配体结合位点的重复的 1拓扑结构。脂质运载蛋白存在于革兰氏阴性细菌、脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞及植物中，且与许多生物过程有关，其中包括免疫反应、信息素转运、生物前列腺素合成、类视网醇结合及癌细胞相互作用。脂质运载蛋白可以许多与抗体修饰相同的方式进行修饰，以改变或增强其结合特性，例如，结合一细胞表面分子，并以此方式阻断、增强或以其他方式改变其功能特性。
[0112]
如本文中所使用，“指导材料(industructional material)”包括一出版物、一录音、一图表或可用于传达本发明的组合物及方法的有用性的任何其他的表达媒介。本发明的试剂盒的指导材料可例如附加在含有本发明的核酸、肽及/或组合物的一容器上，或与含有核酸、肽及/或组合物的一容器一起运输。或者，所述指导材料可与容器分开运输，以便接收者可配合地使用指导材料及化合物。
[0113]“分离的”是指改变或脱离自然状态。例如，自然存在于一活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但与其自然状态的共存材料部分地或完全地分离的相同核酸或肽是“分离的”。一分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化的形式存在，或者可存在于一非天然的环境，例如，一宿主细胞中。
[0114]
如本文中所使用，“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独一无二的，其能够感染非分裂的细胞；其可将大量遗传信息传递至宿主细胞的dna中，因此其是一基因传递载体的最有效方法之一。hiv、siv及fiv皆为慢病毒的例子。衍生自慢病毒的载体提供在体内实现显着水平的基因转移的手段。
[0115]
如本文中所使用，术语“修饰的”是指本发明的分子或细胞的一改变状态或结构。分子可通过多种方式进行修饰，包括化学性、结构性及功能性的修饰。可通过引入核酸来修饰细胞。
[0116]
如本文中所使用，术语“调节”是指相较于不存在治疗或化合物的情况下的受试者的反应水平，及/或相较于其他相同的但未经治疗的受试者的反应水平，介导一受试者的反应水平的可检测的增加或减少。所述术语包括扰乱及/或影响一天然信号或反应，从而在一
受试者，优选地，一人类中介导一有益的治疗反应。
[0117]
在本发明的内容中，对于常见的核酸碱基使用以下的缩写。“a”指腺苷，“c”指胞嘧啶，“g”指鸟苷，“t”指胸苷，“u”指尿苷。
[0118]
除非另有说明，“编码一氨基酸序列的一核苷酸序列”包括彼此简并型式且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码一蛋白质或一rna的核苷酸序列亦可包括多个内含子，其程度使得编码蛋白质的核苷酸序列在某些型式中可包括一或多个内含子。
[0119]
术语“可操作的连接”是指在一调节序列及一异源核酸序列之间的功能性连接，导致后者表达。例如，当一第一核酸序列与一第二核酸序列处于一功能关系时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列是可操作地连接。例如，倘若一启动子影响一编码序列的转录或表达，则所述启动子与所述编码序列是可操作地连接。一般而言，可操作地连接的dna序列是连续的，且在需要连接两个蛋白质编码区时，在相同的读框(reading frame)中。
[0120]
术语“过度表达”的肿瘤抗原或一肿瘤抗原的“过度表达”旨在表示来自一疾病区域的细胞中的一肿瘤抗原的一异常表达水平，例如患者的特定组织或器官内的一实体瘤相对于来自所述组织或器官的正常细胞中的表达水平。可通过本领域已知的标准分析法确定患有实体瘤或以肿瘤抗原的过度表达所表征的血液肿瘤的患者。
[0121]
一免疫原性组合物的“肠胃外”给药包括，例如皮下(subcutaneous，s.c.)、静脉内(intravenous，i.v.)、肌肉内(intramuscular，i.m.)或胸骨内注射，或输注技术。
[0122]
如本文中所使用，术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文中所使用的核酸及多核苷酸是可互换的。本领域技术人员公知核酸是多核苷酸，其可被水解成单体“核苷酸”。所述单体核苷酸可被水解成核苷。如本文中所使用，多核苷酸包括，但不限于，通过本领域可取得的任何方式所获得的所有核酸序列，包括，但不限于重组手段，即，使用普通的克隆技术及pcr
tm
等，以及通过合成手段，从一重组库或一细胞基因组中克隆核酸序列。
[0123]
如本文中所使用，术语“肽”、“多肽”及“蛋白质”可互换使用，且是指由通过肽键共价地连接的氨基酸残基所组成的一化合物。一蛋白质或肽必须包括至少两个氨基酸，且对于可构成一蛋白质序列或肽序列的氨基酸的最大数量并无限制。多肽包括含有通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文中所使用，所述术语指的是短链及更长的链二者，所述短链在本领域中通常亦被称为肽、寡肽及寡聚体，例如，所述更长的链在本领域中通常被称为蛋白质，其具有很多类型。“多肽”包括，例如，生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。所述多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
[0124]
如本文中所使用，术语“融合蛋白”及“嵌合蛋白”可互换使用，且是指由两个或更多个多肽所组成的一化合物。在一些实施例中，所述两个或更多个多肽是共价地连接。在进一步的实施例中，所述两个或更多个多肽通过肽键、连接子或二硫键共价地连接。融合蛋白可通过本领域技术人员熟知的多种方法产生，最常见的是通过将包括编码或指定一融合蛋白氨基酸序列的一核酸序列的一载体引入一细胞。可将额外的氨基酸或多肽掺入一融合蛋白中，以引发额外的功能特性，例如稳定性、半衰期、多聚化、易于纯化。此种元件的一例子是一多肽连接子。
[0125]
如本文中所使用，术语“启动子”被定义为被细胞的合成工具或引入的合成工具所
识别的一dna序列，其需要启动一多核苷酸序列的特异性转录。
[0126]
如本文中所使用，术语“启动子/调节序列”是指表达与启动子/调节序列可操作地连接的一基因产物所需的一核酸序列。在某些情况下，此序列可为核心启动子序列，而在其他情况下，所述序列亦可包括一增强子序列及所述基因产物的表达所需的其他调节元件。例如，所述启动子/调节序列可为以一组织特异性方式表达基因产物的序列。
[0127]“组成型(constitutive)”启动子是一核苷酸序列，当与编码或指定一基因产物的一多核苷酸可操作地连接时，导致所述基因产物在细胞的大部分或所有生理条件下在一细胞中产生。
[0128]“诱导型(inducible)”启动子是一核苷酸序列，当与编码或指定一基因产物的一多核苷酸可操作地连接时，基本上仅当在细胞中存在对应于启动子的一诱导物时，才导致所述基因产物在细胞中产生。
[0129]“组织特异性”启动子是一核苷酸序列，当与编码或指定一基因的一多核苷酸可操作地连接时，基本上仅当细胞是与启动子相对应的组织类型的一细胞时，才导致所述基因产物在细胞中产生。
[0130]“信号转导路径”是指在多个信号转导分子之间的生化关系，此等信号转导分子在将一信号从一细胞的一部分传递至一细胞的另一部分中扮演一角色。短语“细胞表面受体”包括能够接收一信号，并跨越一细胞的质膜的传输信号的分子及分子的复合物。
[0131]
术语“特异性结合”，如本文中所使用的关于一抗体，是指识别一特定的抗原，但基本上不识别或结合一样品中的其他分子的一抗体。例如，与来自一物种的一抗原特异性结合的一抗体亦可与来自一或多种物种的抗原结合。但是，此种跨物种反应性本身不会改变抗体的特异性分类。在另一例子中，特异性结合一抗原的一抗体亦可结合抗原的不同等位基因形式。然而，此种交叉反应性本身不会改变一抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异地结合”可用于指一抗体、一蛋白质或一肽与一第二化学物质的相互作用，以表示所述相互作用是取决于存在化学物种上的一特定结构(例如，一抗原决定簇或表位)，例如，一抗体识别并结合至一特定的蛋白质结构，而非一般的蛋白质。倘若一抗体对于表位“a”具有特异性，则在含有标记的“a”及所述抗体的一反应中存在含有表位a(或游离的、未标记的a)的一分子，将减少与所述抗体结合的标记的a的数量。
[0132]
术语“受试者”旨在包括其中可引发一免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物)。其中使用的一“受试者”或“患者”可为一人类或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物包括，例如，家畜及宠物，诸如绵羊、牛、猪、犬、猫及鼠哺乳动物。优选地，所述受试者是人类。
[0133]
如本文中所使用，一“基本上纯化的”细胞是基本上不含其他细胞类型的一细胞。一基本上纯化的细胞亦指已经与其他细胞类型分离的一细胞，所述其他细胞类型通常与其自然发生的状态相关联。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指一同质的细胞群。在其他情况下，此术语仅指在自然状态下与其自然关联的细胞分离的细胞。在一些实施例中，所述细胞在体外培养。在其他的实施例中，所述细胞非为体外培养。
[0134]“靶位点”或“靶序列”是指一基因组核酸序列，其定义在足以发生结合的条件下，一结合分子可特异性地结合的一核酸的一部分。
[0135]
如本文中所使用，术语“治疗”是指治疗及/或预防。通过抑制、缓解或根除疾一疾病状态所获得的一治疗效果。
[0136]
如本文中所使用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源的核酸转移或引入宿主细胞的一过程。一“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是使用外源的核酸进行转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括初级受试者细胞及其后代。
[0137]
术语“转基因”是指已经或即将被人工插入一动物的基因组中的遗传物质，特别是一哺乳动物，且更特别是一活体动物的一哺乳动物细胞。
[0138]“治疗”一疾病，如本文中所使用的术语，是指降低一受试者经历的一疾病或病症的至少一体征或症状的频率或严重性。
[0139]
如本文中所使用，短语“在转录的控制下”或“可操作地连接”是指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置及方向，以控制rna聚合酶的转录起始及多核苷酸的表达。
[0140]“载体”是包括一分离的核酸且可用于将分离的核酸递送至一细胞的内部的物质的组合物。许多载体是本领域已知的，包括，但不限于，线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒及病毒。因此，术语“载体”包括一自主复制的质粒或一病毒。所述术语亦应解释为包括促进核酸转移至细胞中的非质粒及非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。一质粒载体的一实例是一附着型载体，其中自我复制是通过源自一病毒，例如，爱泼斯坦
‑
巴尔病毒(epstein
‑
barr virus)及bk病毒的调节元件驱动或增强。病毒载体的实例包括，但不限于，仙台病毒(sendai virus)载体、腺病毒载体、腺相关的病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
[0141]
范围：本公开的全文，本发明的各个方面可以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便及简洁，不应理解为对本发明的范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应被视为已明确揭露所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，诸如自1至6的范围的描述应被视为具有具体公开的子范围，例如自1至3、自1至4、自1至5、自2至4、自2至6、自3至6等，以及所述范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。无论范围的广度如何，其皆适用。
[0142]
当任何氨基酸序列由登录号特别提及时，所述序列部分及/或全部通过引用并入本文中。与登录号相关的信息，例如信号肽、胞外域、跨膜域、启动子序列及转译起始的识别，亦部分及/或全部通过引用并入本文中。
[0143]
如本发明关于所公开的物质的组合物及方法所设想的，一方面，本发明的实施例包括本文所公开的组分及/或步骤。在另一方面，本发明的实施例基本上由本文所公开的组分及/或步骤组成。在又一方面，本发明的实施例由其中所公开的组分及/或步骤组成。
[0144]
描述：
[0145]
提供一种融合蛋白。在一些示例性实施例中，融合蛋白的所述第一组分阻断一趋化因子受体，例如，cxcr4及/或cxcr7(通过融合蛋白中的vmipii或v1肽或其衍生物的结合)，且此阻断用于固定肿瘤细胞并干扰其迁移、侵袭、转移，及其他致瘤的特性；融合蛋白的所述第二组分阻断所述肿瘤细胞上的一检查点抑制剂，例如，pd
‑
l1及/或pd
‑
l2(通过融合蛋白中的pd1或其衍生物的结合)，且此阻断用于干扰抑制一肿瘤导向的免疫效应细胞，例如nk细胞；融合蛋白的所述第三组分触发同一免疫效应细胞上的一激活受体，例如fc
γ
riiia受体(通过fc
γ
或其衍生物在融合蛋白中的结合)，其驱动nk细胞活化并促进adcc及adcp。
[0146]
在一些示例性实施例中，融合蛋白的一种组分阻断一肿瘤或其他细胞上的一检查
点抑制剂，且另外两种组分各自触发一免疫效应细胞上的不同激活受体。在一些实施例中，当检查点抑制剂位于一肿瘤细胞上时，融合蛋白分子桥接一免疫效应细胞及一靶肿瘤细胞。此外，融合蛋白的三种相互作用，检查点抑制途径阻断及激活受体触发的组合，用于在功能上相互增强，所有三者皆协同驱动所述免疫效应细胞，例如，nk细胞的激活。在一优选的实施例中，通过融合蛋白所阻断的检查点抑制剂是由pd
‑
l1、pd
‑
l2、cd113、cd112、cd155或cd111组成，且通过融合蛋白共同触发的两种激活受体是在nk细胞上的fc
γ
riiia受体及4
‑
1bb。
[0147]
融合蛋白：
[0148]
提供包括组分a及/或组分b的融合蛋白；其中组分a包括组分y、组分z2及组分z3；以及
[0149]
其中组分b包括组分x’、组分z2’
及组分z3’
。在一些实施例中，组分b进一步包括组分z1’
。因此，在一些实施例中，组分b包括组分x’、组分z1’
、组分z2’
及组分z3’
。
[0150]
在一些实施例中，组分a进一步包括组分z1。因此，在一些实施例中，组分a包括组分y、组分z1、组分z2及组分z3。
[0151]
在一些实施例中，融合蛋白进一步包括组分c，其中组分c包括组分x及组分c
l’。在进一步的实施例中，组分c
l’包括一免疫球蛋白轻链的至少一部分。在一些实施例中，融合蛋白进一步包括组分d，其中组分d包括组分q及组分c
l
。在进一步的实施例中，组分c
l
包括一免疫球蛋白轻链的至少一部分。
[0152]
在一些实施例中，组分a进一步包括一前导序列。在进一步的实施例中，所述前导序列是一人类白蛋白前导序列。
[0153]
在一些实施例中，组分b进一步包括一前导序列。在进一步的实施例中，所述前导序列是一人类白蛋白前导序列。
[0154]
在一些实施例中，组分y包括一配体结构域、一受体结构域、一scfv结构域或一脂质运载蛋白结构域。在进一步的实施例中，组分y包括pd
‑
1、tigit、cd96、cd112r、cd113、cd155、cd111、cd112、mhc
‑
i多肽相关的序列a(mica)、nkg2a(cd94)、micb、ulbp1
‑
5、tim
‑
3、cd226、necl2、crtam、cd80、ctla
‑
4、kir2dl1/2/3，或cd48的至少一部分。在更进一步的实施例中，所述融合蛋白与pd
‑
l1或pd
‑
l2结合。
[0155]
在一些实施例中，组分z1包括一免疫球蛋白的一结构域、一tnf超家族成员、一tnf
‑
l超家族成员、一转铁蛋白、一转铁蛋白受体、一人类血清白蛋白或一脂质运载蛋白。在一些实施例中，一免疫球蛋白的结构域是一ch1结构域。在一些实施例中，所述免疫球蛋白是igg。在更进一步的实施例中，所述免疫球蛋白是ige。
[0156]
在一些实施例中，组分z2包括一免疫球蛋白的结构域、一tnf超家族成员、一tnf
‑
l超家族成员、一转铁蛋白、一转铁蛋白受体、一人类血清白蛋白或一脂质运载蛋白。在一些实施例中，一免疫球蛋白的结构域是一ch2结构域。在一些实施例中，所述免疫球蛋白是igg。在更进一步的实施例中，所述免疫球蛋白是ige。
[0157]
在一些实施例中，组分z3包括一免疫球蛋白的结构域、一tnf超家族成员、一tnf
‑
l超家族成员、一转铁蛋白、一转铁蛋白受体、一人类血清白蛋白或一脂质运载蛋白。在一些实施例中，一免疫球蛋白的一结构域是一ch3结构域。在一些实施例中，所述免疫球蛋白是igg。在更进一步的实施例中，所述免疫球蛋白是ige。
[0158]
在一些实施例中，组分z
l’包括一免疫球蛋白的结构域、一tnf超家族成员、一tnf
‑
l超家族成员、一转铁蛋白、一转铁蛋白受体、一人类血清白蛋白或一脂质运载蛋白。在一些实施例中，一免疫球蛋白的一结构域是一ch1结构域。在一些实施例中，所述免疫球蛋白是igg。在更进一步的实施例中，所述免疫球蛋白是ige。
[0159]
在一些实施例中，组分z2’
包括一免疫球蛋白的结构域、一tnf超家族成员、一tnf
‑
l超家族成员、一转铁蛋白、一转铁蛋白受体、一人类血清白蛋白或一脂质运载蛋白。在一些实施例中，一免疫球蛋白的一结构域是一ch2结构域。在一些实施例中，所述免疫球蛋白是igg。在更进一步的实施例中，所述免疫球蛋白是ige。
[0160]
在一些实施例中，组分z3’
包括一免疫球蛋白的结构域、一tnf超家族成员、一tnf
‑
l超家族成员、一转铁蛋白、一转铁蛋白受体、一人类血清白蛋白或一脂质运载蛋白。在一些实施例中，一免疫球蛋白的一结构域是一ch3结构域。在一些实施例中，所述免疫球蛋白是igg。在更进一步的实施例中，所述免疫球蛋白是ige。
[0161]
在一些实施例中，组分x’包括一病毒衍生的肽、一配体衍生的肽、一受体衍生的肽或一高通量筛选(high
‑
throughput screen，hts)选择的肽。在一些实施例中，组分x’包括一肽序列，所述肽序列与一趋化因子受体、一细胞因子受体、针对一功能性配体的一反受体、一整联蛋白、一配体或一膜信号传导复合物的一部分结合。在一些实施例中，组分x’包括pd
‑
1、tigit、cd96、cd112r、cd113、cd155、cd111、cd112、mhc
‑
1多肽相关序列a(mica)、nkg2a(cd94)、micb、ulbp1
‑
5、tim
‑
3、cd226、necl2、crtam、cd80、ctla
‑
4、kir2dl1/2/3或cd48的至少一部分。在进一步的实施例中，组分x’包括vmip
‑
ii的至少一部分。在进一步的实施例中，组分x’包括v1或v1δ多肽。在更进一步的实施例中，所述融合蛋白与cxcr4结合。
[0162]
在一些实施例中，组分q包括pd
‑
1、tigit、cd96、cd112r、cd113、cd155、cd111、cd112、mhc
‑
i多肽相关的序列a(mica)、nkg2a(cd94)、micb、ulbp1
‑
5、tim
‑
3、cd226、necl2、crtam、cd80、ctla
‑
4、kir2dl1/2/3或cd48的至少一部分。
[0163]
在一些实施例中，组分x包括一病毒衍生的肽、一配体衍生的肽、一受体衍生的肽或一hts选择的肽。在进一步的实施例中，组分x包括v1或v1δ多肽。在进一步的实施例中，所述融合蛋白与cxcr4结合。
[0164]
在一些实施例中，组分z1’
及组分z2’
通过一铰链连接，例如一igg铰链。在一些实施例中，组分z1'及组分z2'通过铰链连接，例如一igg铰链。在一些实施例中，组分x’及组分z1’
通过一连接子连接。在一些实施例中，组分x及组分c
l
通过一连接子连接。
[0165]
在一些实施例中，融合蛋白包括组分a及fc。在进一步的实施例中，融合蛋白包括组分a及人类fcb(hfcb)。
[0166]
在一些实施例中，融合蛋白包括组分b及fc。在进一步的实施例中，融合蛋白包括组分b及人类fca(hfca)。
[0167]
在一些实施例中，组分a及组分b是共价地连接。在一些实施例中，共价连接是经由二硫键或经由一连接子。
[0168]
在一些实施例中，组分a及组分b不是共价地连接。在一些实施例中，组分a及组分b通过旋钮入孔(knobs
‑
into
‑
holes)的相互作用保持在一起。在一些实施例中，组分a及组分b包括旋钮入孔突变及通过二硫键的共价连接。在一些实施例中，组分a包括突变y349c及t366w，以及组分b包括突变d356c、t366s、l368a及y407v(“旋钮入孔”突变)。在此等组分链
中的突变及改变的位置由卡巴特(kabat)编号惯例(约翰逊，g及吴，tt，(2001)nucleic acids res，28(1)，214
‑
18)定义。
[0169]
在一些实施例中，融合蛋白包括组分a及一免疫球蛋白的一结构域。在一些实施例中，免疫球蛋白结构域是一fc结构域。
[0170]
在一些实施例中，融合蛋白包括组分b及一免疫球蛋白的一结构域。在一些实施例中，免疫球蛋白结构域是一fc结构域。
[0171]
在一些实施例中，组分b及组分c是共价地连接。在一些实施例中，n所述共价连接是经由二硫键。
[0172]
在一些实施例中，组分b及组分c非为共价地连接。
[0173]
在一些实施例中，组分a及组分d是共价地连接。在一些实施例中，所述共价连接是经由二硫键。
[0174]
在一些实施例中，组分a及组分d非为共价地连接。
[0175]
在一些实施例中，融合蛋白与一免疫细胞上的一受体或配体结合。
[0176]
在一些实施例中，所述受体是一fc受体。
[0177]
亦提供一种药物组合物，所述药物组合物包括一药学上可接受的载体及前述实施例中任一者的融合蛋白。
[0178]
亦提供一种治疗一患者的一增殖性疾病的方法，所述方法包括向有需要此种治疗的一患者施予一治疗有效量的前述实施例中任一者的融合蛋白。在一些实施例中，所述增殖性疾病是癌症。在进一步的实施例中，癌症是实体瘤。在更进一步的实施例中，癌症是所述癌症是胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，all)、急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia，aml)、多发性骨髓瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、或任何实体或液体肿瘤类型。
[0179]
本发明提供可用于治疗增殖性疾病，例如癌症的新颖融合蛋白。在表达针对组分y的一受体或配体及针对组分x’的一受体或配体的细胞上，本发明的融合蛋白可阻断一种或两种所述受体或配体。因此，在共表达针对组分y的一受体或配体及针对组分x’的一受体或配体的细胞上，本发明的融合蛋白可导致肿瘤细胞的死亡、固定及清除。此外，在表达针对组分z3或组分z3’
的一受体或配体的细胞上，例如在一自然杀手(natural killer，nk)细胞上，本发明的融合蛋白可触发所述受体或配体，且可导致细胞的活化。因此，本发明的融合蛋白可通过跨越两个相邻的细胞来介导其活性。此外，本发明的融合蛋白可结合在所述细胞上的三种或更多种不同的分子。在一些实施例中，所述融合蛋白可通过引起某些细胞的抑制或减少，或某些细胞的激活或增加来治疗一疾病，例如癌症。
[0180]
组分a：
[0181]
组分a包括组分y、组分z2及组分z3。
[0182]
组分y：
[0183]
在一些实施例中，组分y包括一配体结构域、一受体结构域、一scfv结构域或一脂质运载蛋白结构域。在进一步的实施例中，组分y包括pd
‑
1、tigit、cd96、cd112r、cd113、cd155、cd111、cd112、mhc
‑
i多肽相关的序列a(mica)、nkg2a(cd94)、micb、ulbp1
‑
5、tim
‑
3、cd226、necl2、crtam、cd80、ctla
‑
4、kir2dl1/2/3或cd48的至少一部分。
[0184]
组分y的一示例性序列包括或由以下组成：
[0185]
gwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagq
[0186]
(seq id no：1)人类pd
‑
1胞外域，登录号nm_005018.3。
[0187]
组分y的一示例性序列包括或由以下组成：
[0188]
gwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfhvvwhrespsgqtdtlaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtyvcgvislapkiqikeslraelrvterraevptahpspsprpagq
[0189]
(seq id no：2)高亲和力人类pd
‑
1胞外域。
[0190]
组分y的一示例性序列包括或由以下组成：
[0191]
mmtgtiettgnisaekggsiilqchlssttaqvtqvnweqqdqllaicnadlgwhispsfkdrvapgpglgltlqsltvndtgeyfciyhtypdgtytgriflevlessvaehgarfqip
[0192]
(seq id no：3)人类tigit胞外域，登录号nm_173799.4。
[0193]
组分y的一示例性序列包括或由以下组成：
[0194]
vwektvnteenvyatlgsdvnltcqtqtvgffvqmqwskvtnkidliavyhpqygfycaygrpceslvtftetpengskwtlhlrnmscsvsgryecmlvlypegiqtkiynlliqthvtadewnsnhtieieinqtleipcfqnssskisseftyawsvensstdswvllskgikedngtqetlisqnhlisnstllkdrvklgtdyrlhlspvqifddgrkfschirvgpnkilrssttvkvfakpeipvivennstdvlverrftcllknvfpkanitwfidgsflhdekegiyitneerkgkdgflelksvltrvhsnkpaqsdnltiwcmalspvpgnkvwnissekitfllgseisstdpplsvtestldtqpspassvsparypatssvtlvdvsalrpnttpqpsnssmttrgfnypwtssgtdtkksvsripsetyssspsgagstlhdnvftstarafsevpttangstktnhvhitgivvnkpkdgm
[0195]
(seq id no：4)人类cd96胞外域，登录号nm_198196.2。
[0196]
组分y的一示例性序列包括或由以下组成：
[0197]
mghrtlvlpwvlltlcvtagtpevwvqvrmeatelssftircgflgsgsislvtvswggpngaggttlavlhpergirqwaparqarwetqssislilegsgasspcanttfcckfasfpegsweacgslppssdpglsapptpapilrad
[0198]
(seq id no：5)人类cd112r胞外域，登录号nm_024070.3。
[0199]
组分y的一示例性序列包括或由以下组成：
[0200]
eevlwhtsvpfaenmslecvypsmgiltqvewfkigtqqdsiaifspthgmvirkpyaervyflnstmasnnmtlffrnaseddvgyyscslytypqgtwqkviqvvqsdsfeaavpsnshivsepgknvtltcqpqmtwpvqavrwekiqprqidlltycnlvhgrnftskfprqivsncshgrwsvivipdvtvsdsglyrcylqasagenetfvmrltvaegktdnqytlfva
[0201]
(seq id no：6)cd226胞外域，登录号nm_006566.3。
[0202]
组分y的一示例性序列包括或由以下组成：
[0203]
qnlftkdvtviegevatiscqvnksddsviqllnpnrqtiyfrdfrplkdsrfqllnfssselkvsltnvsisdegryfcqlytdppqesyttitvlvpprnlmidiqkdtavegeeievnctamaskpattirwfkgntelkgkseveewsdmytvtsqlmlkvhkeddgvpvicqvehpavtgnlqtqrylevqykpqvhiqmtyplqgltregdaleltceaigkpqpvmvtwvrvddempqhavlsgpnlfinnlnktdngtyrceasnivgkahsdymlyvydppttippptttttttttttttiltiitdsrageegsiravdh
[0204]
(seq id no：6)人类necl2胞外域，登录号nm_014333.3。
[0205]
组分y的一示例性序列包括或由以下组成：
[0206]
piivephvtavwgknvslkclievnetitqiswekihgkssqtvavhhpqygfsvqgeyqgrvlfknyslndatitlhnigfsdsgkyickavtfplgnaqssttvtvlveptvslikgpdslidggnetvaaiciaatgkpvahidwegdlgemestttsfpnetatiisqyklfptrfargrritcvvkhpalekdirysfildiqyapevsvtgydgnwfvgrkgvnlkcnadanpppfksvwsrldgqwpdgllasdntlhfvhpltfnysgvyickvtnslgqrsdqkviyisdppttttlqptiqwhpstadiedlatepkklpfplstlatikdd
[0207]
(seq id no：8)人类cd113胞外域，登录号nm_015480.3。
[0208]
组分y的一示例性序列包括或由以下组成：
[0209]
aephslrynltvlswdgsvqsgfltevhldgqpflrcdrqkcrakpqgqwaedvlgnktwdretrdltgngkdlrmtlahikdqkeglhslqeirvceihednstrssqhfyydgelflsqnletkewtmpqssraqtlamnvrnflkedamktkthyhamhadclqelrrylksgvvlrrtvppmvnvtrseasegnitvtcrasgfypwnitlswrqdgvslshdtqqwgdvlpdgngtyqtwvatricqgeeqrftcymehsgnhsthpvpsgkvlvlqshw
[0210]
(seq id no：9)人类mica(mhc
‑
1多肽相关的序列a)胞外域，登录号nm_000247.3。
[0211]
前导序列：
[0212]
前导序列的一示例性序列包括或由以下组成：
[0213]
mkwvtfisllflfssays
[0214]
(seq id no：10)人类白蛋白前导序列。
[0215]
铰链：
[0216]
铰链的一示例性序列包括或由以下组成：
[0217]
epkssdkthtcppcpapellgg
[0218]
(seq id no：11)人类igg铰链。
[0219]
组分z2：
[0220]
组分z2的一示例性序列包括或由以下组成：
[0221]
psvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkalpapiektiskak
[0222]
(seq id no：12)igg1。
[0223]
组分z3：
[0224]
组分z3的一示例性序列包括或由以下组成：
[0225]
gqprepqvctlppsrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvlhealhshytqkslslspgk
[0226]
(seq id no：13)igg1。
[0227]
组分a的一示例性序列包括或由以下组成：
[0228]
人类pd
‑1‑
hfca：
[0229][0230]
(seq id no：14)
[0231]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0232]
‑
人类pd
‑
1胞外域；y结构域
[0233]
粗体
‑
igg1铰链区
[0234]
‑
igg1z2结构域
[0235]
‑
igg1z3结构域
[0236]
组分a的另一示例性序列包括或由以下组成：
[0237]
高亲和力人类pd
‑1‑
hfca：
[0238][0239][0240]
(seq id no：15)
[0241]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0242]
‑
高亲和力人类pd
‑
1胞外域；y结构域
[0243]
粗体
‑
igg1铰链区
[0244]
‑
igg1z2结构域
[0245]
‑
igg1z3结构域
[0246]
组分a的另一示例性序列包括或由以下组成：
[0247]
人类cd112r
‑
hfca：
[0248][0249]
(seq id no：16)
[0250]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0251]
‑
人类cd112r胞外域；y结构域
[0252]
粗体
‑
igg1铰链区
[0253]
‑
igg1z2结构域
[0254]
‑
igg1z3结构域
[0255]
组分a的另一示例性序列包括或由以下组成：
[0256]
人类tigit
‑
hfca：
[0257][0258]
(seq id no：17)
[0259]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0260]
‑
高亲和力人类tigit胞外域；y结构域
[0261]
粗体
‑
igg1铰链区
[0262]
‑
igg1z2结构域
[0263]
‑
igg1z3结构域
[0264]
组分a的另一示例性序列包括或由以下组成：
[0265]
人类cd96
‑
hfca：
[0266][0267][0268]
(seq id no：18)
[0269]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0270]
‑
人类cd96胞外域；y结构域
[0271]
粗体
‑
igg1铰链区
[0272]
‑
igg1z2结构域
[0273]
‑
igg1z3结构域
[0274]
组分a的另一示例性序列包括或由以下组成：
[0275]
人类cd226
‑
hfca：
[0276]
[0277][0278]
(seq id no：19)
[0279]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0280]
‑
人类cd226胞外域；y结构域
[0281]
粗体
‑
igg1铰链区
[0282]
‑
igg1z2结构域
[0283]
‑
igg1z3结构域
[0284]
组分a的另一示例性序列包括或由以下组成：
[0285]
人类necl2
‑
hfca：
[0286][0287]
(seq id no：20)
[0288]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0289]
‑
人类necl2胞外域；y结构域
[0290]
粗体
‑
igg1铰链区
[0291]
‑
igg1z2结构域
[0292]
‑
igg1z3结构域
[0293]
组分a的另一示例性序列包括或由以下组成：
[0294]
人类cd113
‑
hfca：
[0295][0296]
(seq id no：21)
[0297]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0298]
‑
人类cd113胞外域；y结构域
[0299]
粗体
‑
igg1铰链区
[0300]
‑
igg1z2结构域
[0301]
‑
igg1z3结构域
[0302]
组分a的另一示例性序列包括或由以下组成：
[0303]
人类mica
‑
hfca(mhc
‑
i多肽相关的序列a)：
[0304][0305]
(seq id no：22)
[0306]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0307]
‑
人类mica胞外域；y结构域
[0308]
粗体
‑
igg1铰链区
[0309]
‑
igg1z2结构域
[0310]
‑
igg1z3结构域
[0311]
人类fca：
[0312][0313][0314]
(seq id no：23)
[0315]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0316]
粗体
‑
igg1铰链区
[0317]
‑
igg1z2结构域
[0318]
‑
igg1z3结构域
[0319]
组分b：
[0320]
组分b包括x’、组分z2’
及组分z3’
。在一些实施例中，组分x’包括一病毒衍生的肽、一配体衍生的肽、一受体衍生的肽，或一hts选择的肽。在一些实施例中，组分x’包括pd
‑
1、
tigit、cd96、cd112r、cd113、cd155、cd111、cd112、mhc
‑
1多肽相关的序列a(mica)、nkg2a(cd94)、micb、ulbp1
‑
5、tim
‑
3、cd226、necl2、crtam、cd80、ctla
‑
4、kir2dl1/2/3或cd48的至少一部分。
[0321]
组分x’：
[0322]
组分x’的一示例性序列包括或由以下组成：
[0323]
wpppgtgdvvvqaptqvpgflgdsvtlpcylqvpnmevthvsqltwarhgesgsmavfhqtqgpsyseskrlefvaarlgaelrnaslrmfglrvedegnytclfvtfpqgsrsvdiwlrvlakpqntaevqkvqltgepvpmarcvstggrppaqitwhsdlggmpntsqvpgflsgtvtvtslwilvpssqvdgknvtckvehesfekpqlltvnltvyyppevsisgydnnwylgqneatltcdarsnpeptgynwsttmgplppfavaqgaqllirpvdkpinttlicnvtnalgarqaeltvqvkegppsehsgmsrn
[0324]
(seq id no：24)人类cd155(脊髓灰质炎病毒受体，polio virus receptor，pvr)胞外域，登录号nm_006505.5。
[0325]
组分x’的一示例性序列包括或由以下组成：
[0326]
mmtgtiettgnisaekggsiilqchlssttaqvtqvnweqqdqllaicnadlgwhispsfkdrvapgpglgltlqsltvndtgeyfciyhtypdgtytgriflevlessvaehgarfqip
[0327]
(seq id no：25)人类tigit(具有ig及itim结构域的t细胞免疫受体)，登录号nm_173799.4。
[0328]
组分x’的一示例性序列包括或由以下组成：
[0329]
ledgykvevgknaylpcsytlptsgtlvpmcwgkgfcpwsqctnellrtdernvtyqkssryqlkgdlnkgdvsliiknvtlddhgtyccriqfpglmndkklelkldikaakvtpaqtahgdsttasprtltterngsetqtlvtlhnnngtkistwadeikdsgetir
[0330]
(seq id no：26)小鼠tim
‑
3胞外域，登录号nm_134250.2。小鼠tim
‑
3与人类泌乳素
‑
9(galactin
‑
9)具有良好的结合。
[0331]
组分x’的一示例性序列包括或由以下组成：
[0332]
piivephvtavwgknvslkclievnetitqiswekihgkssqtvavhhpqygfsvqgeyqgrvlfknyslndatitlhnigfsdsgkyickavtfplgnaqssttvtvlveptvslikgpdslidggnetvaaiciaatgkpvahidwegdlgemestttsfpnetatiisqyklfptrfargrritcvvkhpalekdirysfildiqyapevsvtgydgnwfvgrkgvnlkcnadanpppfksvwsrldgqwpdgllasdntlhfvhpltfnysgvyickvtnslgqrsdqkviyisdppttttlqptiqwhpstadiedlatepkklpfplstlatikdd
[0333]
(seq id no：27)人类cd113胞外域，登录号nm_015480.3。
[0334]
前导序列：
[0335]
前导序列的一示例性序列包括或由以下组成：
[0336]
mkwvtfisllflfssays
[0337]
(seq id no：10)人类白蛋白前导序列。
[0338]
铰链：
[0339]
铰链的一示例性序列包括或由以下组成：
[0340]
epkssdkthtcppcpapellgg
[0341]
(seq id no：11)人类igg铰链。
[0342]
组分z2：
[0343]
组分z2的一示例性序列包括或由以下组成：
[0344]
psvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkalpapiektiskak
[0345]
(seq id no：12)igg1。
[0346]
组分z3：
[0347]
组分z3的一示例性序列包括或由以下组成：
[0348]
gqprepqvctlpsrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvlhealhshytqkslslspgk
[0349]
(seq id no：13)igg1。
[0350]
组分b的一示例性序列包括或由以下组成：
[0351]
人类cd155
‑
hfcb：
[0352][0353]
(seq id no：32)
[0354]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0355]
‑
人类cd155(脊髓灰质炎病毒受体，polio virus receptor，pvr)胞外域；x’结构域
[0356]
粗体
‑
igg1铰链区
[0357]
‑
igg1z
’2结构域
[0358]
‑
igg1z
’3结构域
[0359]
组分b的一示例性序列包括或由以下组成：
[0360]
人类tigit
‑
hfcb：
[0361][0362]
(seq id no：33)
[0363]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0364]
‑
人类tigit(具有ig及itim结构域的t细胞免疫受体)胞外结构域；x’结构域
[0365]
粗体
‑
igg1铰链区
[0366]
‑
igg1z
’2结构域
[0367]
‑
igg1z
’3结构域
[0368]
组分b的一示例性序列包括或由以下组成：
[0369]
小鼠tim
‑3‑
hfcb：
[0370][0371][0372]
(seq id no：34)
[0373]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0374]
‑
小鼠tim
‑
3胞外域；x’结构域
[0375]
粗体
‑
igg1铰链区
[0376]
‑
igg1z
’2结构域
[0377]
‑
igg1z
’3结构域
[0378]
组分b的另一示例性序列包括或由以下组成：
[0379]
人类cd113
‑
hfcb：
[0380][0381]
(seq id no：35)
[0382]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0383]
‑
人类cd113胞外域；x’结构域
[0384]
粗体
‑
igg1铰链区
[0385]
‑
igg1z
’2结构域
[0386]
‑
igg1z
’3结构域
[0387]
人类fcb：
[0388][0389]
(seq id no：36)
[0390]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0391]
粗体
‑
igg1铰链区
[0392]
‑
igg1z
’2结构域
[0393]
‑
igg1z
’3结构域
[0394]
组分b包括组分z1’
：
[0395]
在一些实施例中，组分b进一步包括组分z1’
。因此，在一些实施例中，组分b包括组分x’、组分z1’
、组分z2’
及组分z3’
。
[0396]
在一些实施例中，组分x’包括一病毒衍生的肽、一配体衍生的肽、一受体衍生的肽，或一hts选择的肽。在一些实施例中，组分x’包括pd
‑
1、tigit、cd96、cd112r、cd113、cd155、cd111、cd112、mhc
‑
1多肽相关的序列a(mica)、nkg2a(cd94)、micb、ulbp1
‑
5、tim
‑
3、cd226、necl2、crtam、cd80、ctla
‑
4、kir2dl1/2/3或cd48的至少一部分。在进一步的实施例中，组分x’包括cd155、tigit、tim
‑
3或cd113的至少一部分。
[0397]
组分x’：
[0398]
组分x’的一示例性序列包括或由以下组成：
[0399]
lgaswhrpdkcclgyqkrplpqvllsswyptsqlcskpgvifltkrgrqvcadkskdwvkklmqqlpvtar
[0400]
(seq id no：37)vmipii，登录号yp_001129362。
[0401]
组分x’的一示例性序列包括或由以下组成：
[0402]
lgaswhrpdkcclgyqkrplp
[0403]
(seq id no：38)v1
[0404]
组分x’的一示例性序列包括或由以下组成：
[0405]
lgaswhrpdkcalgyqkrplp
[0406]
(seq id no：39)v1δ
[0407]
组分x’的一示例性序列包括或由以下组成：
[0408]
lgaswhrpdacalgyqkrplp
[0409]
(seq id no：40)v1δmut
[0410]
组分x’的一示例性序列包括或由以下组成：
[0411]
lgaswhrpdkcclgyqkrplpqvllsswyptsql
[0412]
(seq id no：41)vp1
[0413]
组分x’的一示例性序列包括或由以下组成：
[0414]
lgaswhrpdkcalgyqkrplpqvllsswyptsql
[0415]
(seq id no：42)vp1δ
[0416]
组分x’的一示例性序列包括或由以下组成：
[0417]
lgaswhrpdacalgyqkrplpqvllsswyptsql
[0418]
(seq id no：43)vp1δmut
[0419]
前导序列：
[0420]
前导序列的一示例性序列包括或由以下组成：
[0421]
mkwvtfisllflfssays
[0422]
(seq id no：10)人类白蛋白前导序列。
[0423]
组分z1’
[0424]
组分z1’
的一示例性序列包括或由以下组成：
[0425]
ssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpevtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvx
[0426]
(seq id no：45)
[0427]
铰链：
[0428]
铰链的一示例性序列包括或由以下组成：
[0429]
epkssdkthtcppcpapellgg
[0430]
(seq id no：11)人类igg铰链。
[0431]
组分z2’
[0432]
组分z2’
一示例性序列包括或由以下组成：
[0433]
psvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkalpapiektiskak
[0434]
(seq id no：12)
[0435]
组分z3’
[0436]
组分z3’
的一示例性序列包括或由以下组成：
[0437]
gqprepqvytlppsrceltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvlhealhshytqkslslspgk
[0438]
(seq id no：48)
[0439]
组分b的一示例性序列包括或由以下组成：
[0440]
vmipii
‑
ch
’‑
hfcb：
[0441][0442][0443]
(seq id no：49)
[0444]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0445]
‑
vmipii
[0446]
‑
在v1、v1δ及v1δmut之间的氨基酸差异
[0447]
‑
ch’[0448]
粗体
‑
igg1铰链区
[0449]
‑
igg1z
’2结构域
[0450]
‑
igg1z
’3结构域
[0451]
组分b的一示例性序列包括或由以下组成：
[0452]
v1
‑
ch
’‑
hfcb：
[0453][0454]
(seq id no：50)
[0455]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0456]
‑
v1(v1是vmipii的前21个氨基酸)
[0457]
‑
在v1、v1δ及v1δmut之间的氨基酸差异
[0458]
‑
ch’[0459]
粗体
‑
igg1铰链区
[0460]
‑
igg1z
’2结构域
[0461]
‑
igg1z
’3结构域
[0462]
组分b的一示例性序列包括或由以下组成：
[0463]
v1δ
‑
ch
’‑
hfcb：
[0464][0465]
(seq id no：51)
[0466]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0467]
‑
v1δ(v1δ是v1在氨基酸11处发生c至a的突变，增加两个v1肽的二聚化)
[0468]
‑
在v1、v1δ及v1δmut之间的氨基酸差异
[0469]
‑
ch’[0470]
粗体
‑
igg1铰链区
[0471]
‑
igg1z
’2结构域
[0472]
‑
igg1z
’3结构域
[0473]
组分b的一示例性序列包括或由以下组成：
[0474]
v1δmut
‑
ch
’‑
hfcb
[0475][0476]
(seq id no：52)
[0477]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0478]
‑
v1δmut(v1δmut在氨基酸11处具有与v1相同的c至a突变，但在氨基酸9处添加k至a突变，以防止受体结合)
[0479]
‑
在v1、v1δ及v1δmut之间的氨基酸差异
[0480]
‑
ch’[0481]
粗体
‑
igg1铰链区
[0482]
‑
igg1z
’2结构域
[0483]
‑
igg1z
’3结构域
[0484]
组分b的一示例性序列包括或由以下组成：
[0485]
vp1
‑
ch
’‑
hfcb：
[0486]
[0487][0488]
(seq id no：53)
[0489]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0490]
‑
vp1(vp1是vmipii的前34个氨基酸)
[0491]
‑
在v1、v1δ及v1δmut之间的氨基酸差异
[0492]
‑
ch’[0493]
粗体
‑
igg1铰链区
[0494]
‑
igg1z
’2结构域
[0495]
‑
igg1z
’3结构域
[0496]
组分b的一示例性序列包括或由以下组成：
[0497]
vp1δ
‑
ch
’‑
hfcb：
[0498][0499]
(seq id no：54)
[0500]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0501]
‑
vp1δ
[0502]
‑
在v1、v1δ及v1δmut之间的氨基酸差异
[0503]
‑
ch’[0504]
粗体
‑
igg1铰链区
[0505]
‑
igg1z
’2结构域
[0506]
‑
igg1z
’3结构域
[0507]
vp1δmut
‑
ch
’‑
hfcb：
[0508][0509]
(seq id no：55)
[0510]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0511]
‑
vp1δmut
[0512]
‑
在v1、v1δ及v1δmut之间的氨基酸差异
[0513]
‑
ch’[0514]
粗体
‑
igg1铰链区
[0515]
‑
igg1z
’2结构域
[0516]
‑
igg1z
’3结构域
[0517]
组分c
[0518]
在一些实施例中，融合蛋白进一步包括组分c，其中组分c包括组分x及组分c
l’。
[0519]
组分x：
[0520]
组分x的一示例性序列包括或由以下组成：
[0521]
lgaswhrpdkcclgyqkrplpqvllsswyptsqlcskpgvifltkrgrqvcadkskdwvkklmqqlpvtar
[0522]
(seq id no：37)vmipii，登录号yp_001129362。
[0523]
组分x的一示例性序列包括或由以下组成：
[0524]
lgaswhrpdkcclgyqkrplp
[0525]
(seq id no：38)v1
[0526]
组分x的一示例性序列包括或由以下组成：
[0527]
lgaswhrpdkcalgyqkrplp
[0528]
(seq id no：39)v1δ
[0529]
组分x的一示例性序列包括或由以下组成：
[0530]
lgaswhrpdacalgyqkrplp
[0531]
(seq id no：40)v1δmut
[0532]
组分x的一示例性序列包括或由以下组成：
[0533]
lgaswhrpdkcclgyqkrplpqvllsswyptsql
[0534]
(seq id no：41)vp1
[0535]
组分x的一示例性序列包括或由以下组成：
[0536]
lgaswhrpdkcalgyqkrplpqvllsswyptsql
[0537]
(seq id no：42)vp1δ
[0538]
组分x的一示例性序列包括或由以下组成：
[0539]
lgaswhrpdacalgyqkrplpqvllsswyptsql
[0540]
(seq id no：43)vp1δmut
[0541]
在一些实施例中，组分x及组分x’是相同的。在进一步的实施例中，组分x及组分x’是不同的。
[0542]
前导序列：
[0543]
前导序列的一示例性序列包括或由以下组成：
[0544]
mkwvtfisllflfssays
[0545]
(seq id no：10)人类白蛋白前导序列。
[0546]
组分c
l’：
[0547]
组分c
l’的一示例性序列包括或由以下组成：
[0548]
krtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0549]
(seq id no：64)
[0550]
组分c的一示例性序列包括或由以下组成：
[0551]
vmipii
‑
cl’：
[0552][0553][0554]
(seq id no：57)
[0555]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0556]
‑
vmipii
[0557]
‑
在v1、v1δ及v1δmut之间的氨基酸差异
[0558]
‑
cl’[0559]
组分c的一示例性序列包括或由以下组成：
[0560]
v1
‑
cl’：
[0584]
组分c的一示例性序列包括或由以下组成：
[0585]
vp1
‑
cl’：
[0586][0587][0588]
(seq id no：61)
[0589]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0590]
‑
vp1
[0591]
‑
在v1、v1δ及v1δmut之间的氨基酸差异
[0592]
‑
cl’[0593]
组分c的一示例性序列包括或由以下组成：
[0594]
vp1δ
‑
cl’：
[0595][0596]
(seq id no：62)
[0597]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0598]
‑
vp1δ
[0599]
‑
在v1、v1δ及v1δmut之间的氨基酸差异
[0600]
‑
cl’[0601]
组分c的一示例性序列包括或由以下组成：
[0602]
vp1δmut
‑
cl’：
[0603][0604][0605]
(seq id no：63)
[0606]
斜体
‑
人类白蛋白前导序列
[0607]
‑
vp1δmut
[0608]
‑
在v1、v1δ及v1δmut之间的氨基酸差异
[0609]
‑
cl’[0610]
组分d
[0611]
在一些实施例中，融合蛋白进一步包括组分d，其中组分d包括组分q及组分c
l
。在一些实施例中，组分q包括pd
‑
1、tigit、cd96、cd112r、cd113、cd155、cd111、cd112、mhc
‑
i多肽相关的序列a(mica)、nkg2a(cd94)、micb、ulbp1
‑
5、tim
‑
3、cd226、necl2、crtam、cd80、ctla
‑
4、kir2dl1/2/3，或cd48的至少一部分。
[0612]
组分q的一示例性序列包括或由seq id no：1、2、3、4、5、6、7、8或9组成。在一些实施例中，组分q及组分y是相同的。在进一步的实施例中，组分q及组分y是不同的。
[0613]
组分c
l
：
[0614]
组分c
l
的一示例性序列包括或由以下组成：
[0615]
krtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0616]
(seq id no：64)
[0617]
融合蛋白的配置：
[0618]
在本发明的融合蛋白的一些实施例中，当通过本文别处所描述的重组方法制备时，组分a的组分的编码序列直接或通过一连接子框架内融合在一起。如本文中所使用，术语“直接地”是指两者之间无一肽连接子的两种组分的融合(即，在一表达构建体中，编码组分y、组分z2及组分z3的密码子是连续的)。如本文中所使用，“框架内融合”是指融合编码序列的表达产生包括所有的多肽组分的融合蛋白，例如，在一些实施例中，组分a包括框架中的组分y、组分z2及组分z3的所有多肽组分。
[0619]
在本发明的融合蛋白的一些实施例中，当通过本文别处所描述的重组方法制备时，组分b的组分的编码序列直接或通过一连接子框架内融合在一起。在组分b的表达构建体的一些实施例中，编码组分x’、组分z2及组分z3’
的密码子是连续的。在进一步的实施例中，在组分b的表达构建体中，编码组分x’、组分z1’
、组分z2及组分z3’
的密码子是连续的。在一些实施例中，组分b在框架内包括组分x’、组分z2及组分z3’
的所有多肽组分。在进一步的实施例中，组分b在框架内包括组分x’、组分z1’
、组分z2’
及组分z3’
的所有多肽组分。
[0620]
在本发明的融合蛋白的一些实施例中，当通过本文别处所描述的重组方法制备时，组分c的组分的编码序列直接或通过一连接子在框架内融合在一起。在组分c的表达构建体的一些实施例中，编码组分x及组分c
l’的密码子是连续的。在一些实施例中，组分c在框架内包括组分x及组分c
l’的所有多肽组分。
[0621]
在一些实施例中，任何组分a及任何组分b可相互混合及匹配。在本发明的融合蛋白的一些示例性实施例中，组分a及组分b如表1所示。在一些实施例中，来自表1的组分a及组分b可彼此混合及匹配，且与额外的组分a及组分b选择。所述附加选项亦可相互混合及匹配。组分a或组分b的额外选择可包括pd
‑
1、tigit、cd96、cd112r、cd113、cd155、cd111、cd112、mhc
‑
i多肽相关的序列a(mica)、nkg2a(cd94)、micb、ulbp1
‑
5、tim
‑
3、cd226、necl2、crtam、cd80、ctla
‑
4、kir2dl1/2/3或cd48的至少一部分。
[0622]
在一些实施例中，融合蛋白包括组分a及hfcb。在一些实施例中，融合蛋白包括组分b及hfca。
[0623]
在一些示例性实施例中，融合蛋白的一组分阻断一抑制性受体，融合蛋白的另外
两种组分各自触发不同的活化受体。在一优选的实施例中，此三种受体共同位于同一免疫效应细胞，例如，nk细胞的表面上，且融合蛋白的三种相互作用，包括抑制性受体阻断及激活性受体触发的一组合，用于相互加强，所有三者协同驱动nk细胞的激活。
[0624]
在其他的示例性实施例中，融合蛋白的两种组分各自阻断不同的抑制性受体，且融合蛋白的另一种组分触发一活化受体。在一优选的实施例中，此三种受体共同位于同一免疫效应细胞，例如，nk细胞的表面上，且融合蛋白的三种相互作用，包括抑制性受体阻断及激活性受体触发的一组合，用于相互加强，所有三者协同驱动nk细胞的激活。
[0625]
在其他的示例性实施例中，融合蛋白的三种组分各自触发一激活受体。在一优选的实施例中，此三种受体共同位于同一免疫效应细胞，例如nk细胞的表面上，且融合蛋白的三种相互作用，皆由激活受体触发组成，用于在功能上相互增强，所有三者协同驱动nk细胞的激活。
[0626]
针对nk细胞，上述实施例中的活化受体可为驱动nk细胞活化并促进抗体依赖性细胞毒性(antibody
‑
dependent cellular cytotoxicity，adcc)及抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)的fcγriiia受体。
[0627]
表1
‑
示例性组分a及组分b
[0628][0629][0630]
在一些示例性实施例中，融合蛋白包括组分b及组分c。在一些实施例中，任何组分b及任何组分c可相互混合及匹配。在一些实施例中，组分b组分c如表2所示。在一些实施例中，表2的各行显示一融合蛋白中的组分b及组分c的配对。
[0631]
表2
[0632]
组分b组分cvmipii
‑
ch
’‑
hfcb(seq id no：49)vmipii
‑
cl’(seq id no：57)v1
‑
ch
’‑
hfcb(seq id no：50)v1
‑
cl’(seq id no：58)
v1δ
‑
ch
’‑
hfcb(seq id no：51)v1δ
‑
cl’(seq id no：59)v1δmut
‑
ch
’‑
hfcb(seq id no：52)v1δmut
‑
cl’(seq id no：60)vp1
‑
ch
’‑
hfcb(seq id no：53)vp1
‑
cl’(seq id no：61)vp1δ
‑
ch
’‑
hfcb(seq id no：54)vp1δ
‑
cl’(seq id no：62)vp1δmut
‑
ch
’‑
hfcb(seq id no：55)vp1δmut
‑
cl’(seq id no：63)
[0633]
在一些实施例中，组分a及组分b通过二硫键稳定的旋钮入孔的相互作用(knobs
‑
into
‑
holes interactions，kih
s
‑
s
)结合在一起。在一些实施例中，组分a包括突变y349c及t366w(例如seq id no：29)，且组分b包括突变d356c、t366s、l368a及y407v(例如seq id no：30)(“旋钮入孔(knobs
‑
into
‑
holes)”突变)，实现组分a及组分b的强制二聚化。z1、z2及z3组分分别基于人类igg1的ch1、ch2及ch3结构域的多肽氨基酸骨架。此等组分链中的突变及改变的位置由卡巴特(kabat)编号惯例(约翰逊，g及吴，tt，(2001)nucleic acids res，28(1)，214
‑
18)定义，且基于野生型人类igg1序列。
[0634]
野生型人类igg1(ch1、ch2及ch3结构域)(从氨基酸编号118开始)：
[0635][0636]
(seq id no：28)
[0637]
‑
igg1z1结构域
[0638]
粗体
‑
igg1铰链区
[0639]
‑
igg1z2结构域
[0640]
‑
igg1z3结构域
[0641]
在一些实施例中，组分a包括或由以下序列(y349c及t366w)组成：
[0642][0643]
[0644]
(seq id no：29)
[0645]
‑
igg1z1结构域(seq id no：67)(参见例如图1a)
[0646]
粗体
‑
igg1铰链区(seq id no：68)
[0647]
s*
‑
相较于野生型，此突变被添加至铰链区，以消除可能与另一半胱氨酸异常结合的未配对半胱氨酸(cysteine，c)
[0648]
‑
igg1z2结构域(seq id no：69)
[0649]
‑
添加突变以降低c1q结合(参见例如图1a)
[0650]
‑
igg1z3结构域(seq id no：44)
[0651]
‑
添加突变以增加fcrn结合(参见例如图1a)
[0652]
在一些实施例中，组分b包括或由以下序列(d356c、t366s、l368a及y407v)组成：
[0653][0654]
(seq id no：30)
[0655]
‑
igg1z1’
结构域
[0656]
表1及表2中所示的组分旨在示例性而非限制性的。
[0657]
在一些示例性实施例中，融合蛋白的一组分阻断肿瘤细胞上有助于所述肿瘤细胞的致瘤性及/或转移潜能的一受体；融合蛋白的一第二组分阻断所述肿瘤细胞上的一检查点抑制剂；融合蛋白的一第三组分触发一免疫效应细胞上的一激活受体。不希望受理论束缚，融合蛋白用于在分子上桥接一免疫效应细胞及一靶肿瘤细胞，且融合蛋白的第二组分及第三组分通过在一免疫效应细胞上阻断及触发一检查点抑制剂的组合来相互加强，例如，nk细胞上的激活受体，共同协同驱动所述免疫效应细胞的激活。
[0658]
在一优选的实施例中，融合蛋白的所述第一组分阻断趋化因子受体，例如，cxcr4及/或cxcr7(通过融合蛋白中的vmipii肽或v1肽或其衍生物的结合)，且此阻断用于固定肿瘤细胞并干扰其迁移、侵袭、转移及其他的致瘤特性；融合蛋白的所述第二组分阻断所述肿瘤细胞上的一检查点抑制剂，例如，pd
‑
l1及/或pd
‑
l2(通过融合蛋白中pd1或其衍生物的结合)，且此阻断用于干扰抑制一肿瘤导向的免疫效应细胞，例如，nk细胞；融合蛋白的所述第三组分触发同一免疫效应细胞上的一激活受体，例如fc
γ
riiia受体(通过fc
γ
或其衍生物在融合蛋白中的结合)，其驱动nk细胞活化并促进adcc及adcp。所述实施例的一有利特征是相同的融合蛋白，亦协同调节除nk细胞之外的具有一净抗肿瘤作用的其他免疫细胞(参见图
5)。
[0659]
在一些示例性实施例中，融合蛋白的一组分阻断一肿瘤或其他细胞上的一检查点抑制剂，而另外两种组分各自触发一免疫效应细胞上的不同激活受体。当检查点抑制剂位于一肿瘤细胞上时，融合蛋白实际上作为分子桥接一免疫效应细胞及一靶肿瘤细胞的作用。此外，融合蛋白的三种相互作用，即检查点抑制通路阻断及激活受体触发的组合，在功能上相互增强，所有此三种相互作用共同驱动所述免疫效应细胞，例如nk细胞的激活。在一优选的实施例中，融合蛋白所阻断的检查点抑制剂是由pd
‑
l1、pd
‑
l2、cd113、cd112、cd155或cd111组成，融合蛋白共同触发的两种激活受体是在nk细胞上的fc
γ
riiia受体及4
‑
1bb(参见图6)。
[0660]
在一些示例性实施例中，融合蛋白的一组分阻断一肿瘤或其他细胞上的一检查点抑制剂；融合蛋白的一第二组分阻断一免疫效应细胞上的相同或不同的检查点抑制剂的一共抑制受体；融合蛋白的一第三组分触发一免疫效应细胞上的一激活受体。当检查点抑制剂位于一肿瘤细胞上时，融合蛋白实际上作为一分子桥接免疫效应细胞及一靶肿瘤细胞的作用，且融合蛋白的三者相互作用，即检查点抑制通路阻断及激活受体触发的组合，用于在功能上相互增强，所有三者皆协同驱动所述免疫效应细胞，例如，nk细胞的激活。在一优选的实施例中，通过融合蛋白的第一组分所阻断的检查点抑制剂是由pd
‑
l1、pd
‑
l2、cd113、cd112、cd155或cd111组成；通过融合蛋白所阻断的nk细胞上的共抑制受体是由pd
‑
1、tigit、cd96或cd112r组成；且通过融合蛋白所触发的激活受体是fc
γ
riiia受体，与nk细胞相同(参见图7)。
[0661]
在一些示例性实施例中，融合蛋白的一组分阻断一肿瘤相关的m1型巨噬细胞上的“别吃我(don't eat me)”抑制性受体，从而释放其抗肿瘤吞噬及其他活性；融合蛋白的另外两种组分各自触发所述肿瘤相关的巨噬细胞上的一不同激活受体。融合蛋白的三种相互作用，即阻断一巨噬细胞抑制途径及触发巨噬细胞上单独的激活受体的组合，用于功能上相互增强，此三种相互作用共同驱动肿瘤相关的巨噬细胞的激活并促进其抗肿瘤功能。在一优选的实施例中，通过融合蛋白的第一组分所阻断的“别吃我”受体是sirpα；通过融合蛋白所触发的激活受体是在同一巨噬细胞上的cd40及fc
γ
riiia受体(参见图8，左图)。
[0662]
一肿瘤相关的m1型巨噬细胞上的“别吃我(don't eat me)”抑制性受体，从而释放其抗肿瘤吞噬及其他活性；融合蛋白的一第二组分阻断所述巨噬细胞上的一独特抑制受体；融合蛋白的一第三组分触发所述肿瘤相关巨噬细胞上的激活受体。融合蛋白的三种相互作用，结合阻断两种巨噬细胞抑制途径和触发巨噬细胞上的激活受体，用于功能上相互增强，所有此三种相互作用共同驱动肿瘤相关的巨噬细胞的激活及/或抗肿瘤效应子功能。在一优选的实施例中，通过融合蛋白的第一组分所阻断的“别吃我”受体是sirpα；通过融合蛋白的第二组分所阻断的抑制受体是pd
‑
1；通过融合蛋白所触发的激活受体是fc
γ
riiia受体(参见图8，右图)。
[0663]
本发明的融合蛋白的优选实施例包括一细胞因子或其一部分或其衍生物，其可并入组分a、组分b、组分c及/或组分d中。其包括彼等熟悉本领域的人广泛已知的细胞因子，其分为许多不同的类别，例如，白介素、肿瘤坏死因子、干扰素、集落刺激因子等；已被赋予各种功能，具有一系列激活特性或抑制特性，例如适应性免疫、促炎信号、抗炎信号、干细胞调节及分化、趋化性、吞噬作用、细胞毒性及抗病毒作用；并与一系列免疫及非免疫细胞靶标
相关，例如b细胞、t细胞、nk细胞、巨噬细胞/单核细胞、树突细胞、骨髓基质细胞、干细胞、成纤维细胞、内皮细胞及上皮细胞。优选的实施例包括与适应性免疫相关的细胞因子(例如，il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
15、il
‑
21、gm
‑
csf)；促炎信号传导[例如，il
‑
1家族(il
‑
1、il
‑
18、il
‑
33、il
‑
36)；il
‑
6家族(il
‑
6、il
‑
11、il
‑
31、cntf、ct
‑
1、lif、opn、osm)；tnfα家族(tnfα、tnfβ、baff、april)；il
‑
17家族(il
‑
17a
‑
f、il
‑
25)；第i型ifn家族(ifnα、ifnβ、ifnκ、limitin)；第ii型ifn家族(ifnγ)；第iii型ifn家族(ifnλ1/il
‑
29)、ifnλ2/il
‑
28a、ifnλ3/il
‑
28b)]；以及抗炎信号[il
‑
12家族(il
‑
12、il
‑
23、il
‑
27、il
‑
35)；以及il
‑
10家族(il
‑
10、il
‑
19、il
‑
20、il
‑
22、il
‑
24、il
‑
26、il
‑
28、il
‑
29)]。参见透纳；马克d.等人：“细胞因子及趋化因子：处于细胞信号传导及炎症疾病的十字路口”，biochimica et biophysica acta 1843(2014)2563
‑
2582。
[0664]
vmip
‑
ii：
[0665]
在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括vmip
‑
ii或其变体。病毒巨噬细胞炎症蛋白
‑
ii(vmip
‑
ii)是一趋化因子，其可与cc及cxc趋化因子受体相互作用，包括ccr5及cxcr4趋化因子受体。ccr5及cxcr4是人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus 1，hiv
‑
1)进入细胞所需的主要辅助受体。cxcr4亦可被发现于癌细胞上，例如，肿瘤细胞。vmip
‑
ii，一种通过人类疱疹病毒8(human herpesvirus 8；hhv
‑
8)所编码的趋化因子(摩尔，ps等人，science，274：1739
‑
1744，1996)显示与cc及cxc趋化因子受体的多种相互作用，以及抑制hiv
‑
1通过ccr3、ccr5及cxcr4所介导而进入。参见美国专利公开第2003/0220482号，其全部内容通过引用并入本文中。vmip
‑
ii亦与cxcr7结合，cxcr7如同cxcr4，与肿瘤发生有关。v1(vmip
‑
ii的氨基酸(aa)1
‑
21)及其相关的dv1(d氨基酸异构体)对cxcr4及cxcr7展现拮抗活性，但对ccr5则无拮抗活性。
[0666]
vmip抑制天然配体cxcl12的结合。在一些实施例中，δ表示在第12个氨基酸处的突变，所述突变导致b组分及c组分的两个肽之间的二聚化。在一些实施例中，δmut表示在第10个氨基酸的突变，所述突变阻止肽的结合，作为一阴性对照。
[0667]
pd
‑
1：
[0668]
在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括pd
‑
1或其变体。pd
‑
1(程序性细胞死亡蛋白1，programmed cell death protein)，亦称为cd279，是位于细胞表面的一蛋白质，其扮演调节免疫系统对细胞的反应的角色。pd
‑
1通过抑制t细胞炎症活动来下调免疫系统，以及促进自身耐受。不希望受理论束缚，pd
‑
1通过至少两种机制扮演一免疫检查点的角色。pd
‑
1促进淋巴结中的抗原特异性t细胞的凋亡。pd
‑
1亦可降低调节性t细胞的凋亡。pd
‑
1结合配体pd
‑
l1及pd
‑
l2，pd
‑
l1及pd
‑
l2是b7家族的成员。pd
‑
l1及pd
‑
l2在一些肿瘤细胞的表面上表达。在肿瘤细胞上所表达的pd
‑
l1与效应子t细胞及nk细胞上的pd
‑
1结合并抑制其功能。因此，在肿瘤细胞上所表达的pd
‑
l1会抑制效应子t细胞的抗肿瘤活性。
[0669]
在一些实施例中，本发明的融合蛋白的pd
‑
1变体是高亲和力pd
‑
1。天然pd
‑
1对其配体pd
‑
l1及pd
‑
l2的亲和力相对较低。pd
‑
1胞外域的更高亲和力变体将用作其配体的更强竞争性拮抗剂。人类pd
‑
1及pd
‑
l1之间的pd
‑
1接触残基发生突变，之后评估结合。本文所述的高亲和力pd
‑
1具有10个突变氨基酸，导致对pd
‑
l1的亲和力增强超过10，000倍。针对更多的详细信息，请参见毛特等人，pnas，112(47)：6506
‑
6514，2015。
[0670]
cd112r：
[0671]
在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd112r或其变体。cd112r在t细胞及nk细胞上表达，并抑制激活反应。cd112广泛地表达在抗原呈现细胞及肿瘤细胞上，是cd112r的配体。cd112r与cd226，一共抑制受体竞争结合cd112。不希望受理论束缚，破坏cd112r
‑
cd112相互作用可增加t细胞反应。人类cd112r包含单一细胞外igv结构域。本文所述的cd112r融合蛋白变体是由连接至人类igg1的铰链、ch2及ch3结构域的人类cd112r的整个胞外域所组成。cd112r及其变体可与其配体cd112结合，并作为天然cd112r在nk细胞及t细胞上的一竞争性拮抗剂，从而阻止抑制性信号传导。
[0672]
cd113：
[0673]
在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd113或其变体。cd113，亦称为脊髓灰质炎病毒受体相关3(poliovirus receptor
‑
related 3，pvrl3)或连接蛋白
‑
3(nectin
‑
3)，是免疫球蛋白超家族的一成员，构成粘附连接的一部分。cd113已显示与mllt4、pard3及ptprm相互作用，但不限于此。此外，cd113与tigit、cd111、cd112、cd155及其自身结合。本文所述的cd113融合蛋白变体是由连接至人igg1的铰链、ch2及ch3结构域的天然人类cd113的整个胞外结构域所组成。含有cd113的融合蛋白可作为nk细胞及t细胞上的天然tigit的竞争性拮抗剂，防止抑制性信号传导。或者，cd113融合蛋白可与cd112、cd155及/或cd111结合，并分别阻止其与抑制性受体cd112r、tigit及cd96的结合，从而恢复nk细胞及t细胞的细胞毒性及细胞因子的产生。
[0674]
mica：
[0675]
在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括mhc
‑
i类多肽相关的序列a(mhc class i polypeptide
‑
related sequence a，mica)或其变体。mica是一细胞表面糖蛋白，所述细胞表面糖蛋白是由位于mhc基因座内的mica基因所编码。mica不与β2
‑
微球蛋白相关，亦不如同传统的mhc
‑
i类分子与肽结合。不希望受理论束缚，mica可作为nkg2d受体的一应激诱导配体(stress
‑
induced ligand)。mica被在其细胞表面上表达nkg2d的nk细胞、γδt细胞及cd8 αβt细胞广泛地识别。t细胞及nk细胞对表达mica的肿瘤细胞的效应子细胞溶解反应是由于nkg2d
‑
mica结合而启动的。在一些实施例中，mica变体是由连接至人类iggl的铰链、ch2及ch3结构域的整个mica胞外域所组成。mica在nk细胞及细胞毒性t细胞上触发nkg2d信号是抗肿瘤活性的一重要介质。
[0676]
cd155：
[0677]
在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd155或其变体。cd155是免疫球蛋白超家族中的第i型跨膜糖蛋白。在人类中，cd155是由脊髓灰质炎病毒受体(poliovirus receptor，pvr)基因所编码。cd155参与在上皮细胞之间的细胞间粘附连接的建立。cd155的外部结构域介导细胞与细胞外基质分子玻连蛋白(vitronectin)的结合，而其细胞内结构域与动力蛋白轻链tctex
‑
1/dynlt1相互作用。此外，cd155与nk细胞抑制性受体tigit及cd96结合，限制nk细胞的细胞毒性，以及激活受体cd226(dnam
‑
1)。包含cd155胞外域的融合蛋白可与nk及t细胞上的tigit或cd96结合，并作为由肿瘤细胞或抗原呈现细胞(antigen presenting cell，apc)所表达的内源性cd155的一竞争性拮抗剂。含有cd155的融合蛋白亦可与共刺激受体cd226结合，并诱导nk细胞介导的肿瘤靶的裂解。
[0678]
tigit：
[0679]
在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括tigit或其变体。在一些实施例
中，tigit是小鼠tigit。在进一步的实施例中，tigit是人类tigit。在一些实施例中，tigit变体包括与人类iggl的铰链、ch2及ch3结构域连接的完整的tigit胞外igv样结构域。
[0680]
tigit，亦称为具有ig及itim结构域的t细胞免疫受体，是一种存在于某些t细胞及nk细胞上的免疫受体。tigit亦称为wucam或vstm3。tigit以高亲和力与树突状细胞(dendritic cell，dc)及巨噬细胞等细胞上的cd155(pvr)结合，并以较低的亲和力与cd112(pvrl2)结合。tigit是一检查点抑制剂，且在来自患有癌症，例如黑色素瘤的个体的肿瘤抗原特异性(ta特异性(antigen
‑
specific))cd8 t细胞及cd8 肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，til)上过表达。不希望受理论束缚，tigit的阻断可导致肿瘤抗原特异性cd8 t细胞及til cd8 t细胞的细胞增殖、细胞因子的产生及脱颗粒的增加。含有tigit的融合蛋白可能与其受体cd155(pvr)及cd112(pvrl2)结合，并阻止其与nk细胞上的tigit相互作用。破坏tigit与其配体在癌细胞上的相互作用将恢复nk细胞的细胞毒活性及细胞因子的产生。
[0681]
tim
‑
3：
[0682]
在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括tim
‑
3或其变体。t细胞免疫球蛋白及含粘蛋白结构域
‑
3(t
‑
cell immunoglobulin and mucin
‑
domain containing
‑
3，tim
‑
3)，亦称为甲型肝炎病毒细胞受体2(hepatitis a virus cellular receptor 2，havcr2)，是一蛋白质，所述蛋白质在人类中是由havcr2基因所编码。havcr2是在产生ifnγ的cd4 th1及cd8 tc1细胞上所表达的一细胞表面分子。在th17细胞、调节性t细胞及先天免疫细胞(树突细胞、nk细胞、单核细胞)中亦检测到tim
‑
3表达。tim
‑
3是一免疫检查点，并介导t细胞耗竭。不希望受理论束缚，tim
‑
3在数种癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，til)中上调，包括但不限于肺癌、胃癌、头颈癌、神经鞘瘤、黑色素瘤及滤泡b细胞非霍奇金淋巴瘤。在一些实施例中，tim
‑
3变体包括与人类iggl的铰链、ch2及ch3结构域连接的整个tim
‑
3胞外域，包括n端的igv样结构域。含有tim
‑
3的融合蛋白可与其天然配体半乳糖凝集素
‑
9(galectin
‑
9)、西康
‑
1(ceacam
‑
1)及磷脂酰丝氨酸结合，并阻止其与nk细胞、t细胞及apc上上所表达的内源性tim
‑
3相互作用，逆转t细胞耗竭，并恢复nk细胞毒性及细胞因子的产生。
[0683]
肿瘤细胞受体靶(tumor cell receptor target)：
[0684]
在一些实施例中，融合蛋白或其一或多种组分与一瘤细胞受体靶(tumor cell receptor target)结合。在一些实施例中，所述融合蛋白或其一或多种组分阻止一配体与一肿瘤细胞受体靶的结合。在一些实施例中，所述肿瘤细胞受体靶包括，但不限于，趋化因子受体、缺口受体(notch receptors)、免疫检查点抑制剂，及肿瘤脉管系统配体及受体。在一些实施例中，趋化因子受体包括cxcr4、ccr10或ccr7。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂包括pd
‑
l1或pd
‑
l2。在一些实施例中，肿瘤脉管系统靶包括ανβ3、ανβ5、cd13(氨肽酶n)、一ngf基序肽的靶或tie2(血管生成素
‑
2的受体(receptor for angiopoietin
‑
2))。
[0685]
免疫细胞受体靶点：
[0686]
在一些实施例中，免疫细胞受体靶是cd40。在一些实施例中，融合蛋白或其一或多种组分包括激动剂cd40 scfv。在进一步的实施例中，免疫细胞受体靶是sirpα。在一些实施例中，融合蛋白或其一或多种组分包括拮抗剂sirpα肽。在一些实施例中，免疫细胞受体靶是4
‑
1bb。在一些实施例中，融合蛋白或其一或多种组分包括激动剂4
‑
1bb scfv或激动剂4
‑
1bb肽。
[0687]
在一些实施例中，免疫细胞受体靶是cd96。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd96或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd96的拮抗剂或激动剂。
[0688]
在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd226或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd226的拮抗剂或激动剂。
[0689]
在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括tim
‑
3或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括tim
‑
3的拮抗剂或激动剂。
[0690]
在一些实施例中，免疫细胞受体靶是cd111。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd111或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd111的拮抗剂或激动剂。
[0691]
在一些实施例中，免疫细胞受体靶是cd112。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd112或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd112的拮抗剂或激动剂。
[0692]
在一些实施例中，免疫细胞受体靶是cd113。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd113或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd113的拮抗剂或激动剂。
[0693]
在一些实施例中，免疫细胞受体靶是cd115。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd115或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd115的拮抗剂或激动剂。
[0694]
在一些实施例中，免疫细胞受体靶是tigit。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括tigit或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括tigit的拮抗剂或激动剂。
[0695]
在一些实施例中，免疫细胞受体靶是kir2dl1/2/或3或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括kir2dl1/2/或3或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括kir2dl1/2/或3的拮抗剂或激动剂。
[0696]
在一些实施例中，免疫细胞受体靶是hla
‑
c。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括hla
‑
c的拮抗剂或激动剂。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括hla
‑
c的拮抗剂或激动剂。
[0697]
在一些实施例中，免疫细胞受体靶是nkg2a(cd94)或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括nkg2a(cd94)或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括nkg2a(cd94)或其变体的拮抗剂或激动剂。
[0698]
在一些实施例中，免疫细胞受体靶是hla
‑
e。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括hla
‑
e的拮抗剂或激动剂。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括hla
‑
e的拮抗剂或激动剂。
[0699]
在一些实施例中，免疫细胞受体靶是2b4或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括2b4或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括2b4或其变体的拮抗剂或激动剂。
[0700]
在一些实施例中，免疫细胞受体靶是cd48或其变体。在一些实施例中，本发明的融
合蛋白的组分可包括cd48的拮抗剂或激动剂。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括cd48或其变体的拮抗剂或激动剂。
[0701]
在一些实施例中，免疫细胞受体靶是nkg2d或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括nkg2d或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括nkg2d或其变体的拮抗剂或激动剂。
[0702]
在一些实施例中，免疫细胞受体靶是mica/b或ulbp1或其变体。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括mica/b或ulbp1的拮抗剂或激动剂。在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可包括mica/b或ulbp1或其变体的拮抗剂或激动剂。
[0703]
在前述实施例的任一者中，免疫细胞是nk细胞、t细胞、树突细胞(dendritic cell，dc)、抗原呈现细胞(antigen
‑
presenting cell，apc)、巨噬细胞，或肿瘤相关的巨噬细胞(m1)。
[0704]
免疫细胞受体或配体：
[0705]
在一些实施例中，融合蛋白或其一或多种组分结合一免疫细胞受体或配体。在一些实施例中，与免疫细胞受体或配体的结合导致nk细胞活化(细胞因子产生(ifnγ及tnf)、抗体依赖性细胞毒性(antibody
‑
dependent cellular cytotoxicity，adcc)及抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody
‑
dependent cellular phagocytosis，adcp))。在一些实施例中，受体是一fc受体。在一些实施例中，与fc受体的结合导致nk细胞活化(adcc及adcp)。在一些实施例中，fc受体是fc
γ
、fc
∈
、fc
α
、fc
μ
或fc
δ
受体。在一些实施例中，免疫细胞受体或配体是tnf超家族的一成员或其受体、tnf
‑
l超家族的一成员或其受体、转铁蛋白或其受体、人类血清白蛋白或其受体，或脂质运载蛋白结构家族的一成员或其受体。
[0706]
连接子(lilnker)
[0707]
在一些实施例中，本发明的融合蛋白的组分可任选地通过一肽连接子进行连接。连接子的残基可选自天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸及修饰的氨基酸。连接子通常将第一组分的羧基末端连接至第二组分的氨基末端。连接子可改变在融合蛋白的两个结构组分之间的距离，以及改变此区域的灵活性。连接子可包含任何数量的氨基酸。因此，连接子可包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60个或更多个氨基酸。在一些实施例中，连接子可由3至60个氨基酸残基、3至40个氨基酸残基、3至30个氨基酸残基、3至24个氨基酸残基、3至18个氨基酸残基、或3至15个氨基酸残基。连接子可包括例如2、3、4、5个或更多个氨基酸残基的重复子序列(sub
‑
sequence)，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个子序列的重复。
[0708]
连接子可为天然存在的序列或设计的序列。可用于本发明的融合蛋白的肽连接子包括，但不限于，甘氨酸连接子、富含甘氨酸的连接子、丝氨酸
‑
甘氨酸连接子等。富含甘氨酸的连接子包括至少约50％的甘氨酸，且优选地至少约60％的甘氨酸。在一实施例中，连接子包括氨基酸序列gly
‑
ser，或其重复。见，例如休斯顿等人，methods in enzymology，203：46
‑
88(1991)。在另一实施例中，连接子包括氨基酸序列gly
‑
lys或其重复。参见，例如，维特勒等人，protein eng，6：989(1993)。在另一实施例中，连接子包括氨基酸序列gly
‑
gly
‑
ser或其重复。在另一实施例中，连接子包括氨基酸序列gly
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser(seq id no：29)或其重复。在某些特定的实施例中，连接子包括氨基酸序列gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser(seq id no：30)。在某些实施例中，连接子包含2至12个重复的gly
‑
gly
‑
ser或gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser或gly
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser(seq id no：29)。肽连接子的实例参见美国专利第6,541,219号。在一实施例中，连接子可包括序列gdplvtaasvlefggsgggsegggsegggsegggsdi(seq id no：31)。
[0709]
连接子可用于分离融合蛋白的两种组分，以实现组分的正确折叠，以减少潜在的空间问题，及/或有助于最佳的受体结合。本领域技术人员熟悉肽连接子的设计及选择。例如，参见罗宾逊等人，1998，proc.natl.acad.sci.usa95：5929
‑
5934。自动化程序亦可用于肽连接子设计(例如克拉斯托等人，2000，protein engineering 13：309
‑
312)。
[0710]
可选的其他元素：
[0711]
除了组分a、组分b、组分c及/或组分d之外，融合蛋白任选地亦可包括额外的元件。此种额外的元件可包括，但不限于：起始甲硫氨酸、信号肽、抗原多肽、三聚化结构域、一更高阶的多聚化结构域，以及一纯化标志(purification tag)，例如his
‑
6。一示例性纯化标签是ashhhhhhm(seq id no：46)。在一实施例中，本发明的融合蛋白包括一任选的三聚化结构域。
[0712]
本发明的融合蛋白任选地包括一信号肽。如本领域技术人员所理解的，信号肽可根据用户的需要、表达系统和其他因素而变化。信号肽是本领域众所周知的，且可使用任何所需的信号肽，包括由本领域技术人员已知的公开可取得的信号肽识别软件所识别/预测的彼等。
[0713]
在一些实施例中，本发明的融合蛋白包括允许组分之间的灵活性的铰链区。参见洛伯纳等人(2016)immunol.reviews 270：113
‑
131。在一些实施例中，组分y及组分z2通过一铰链连接，所述铰链例如一igg铰链。在一些实施例中，组分z1’
及组分z2’
通过一铰链连接，所述铰链例如一igg铰链。
[0714]
在一些实施例中，n
‑
连接聚糖与组分a及/或组分b上的asn连接。在一些实施例中，n
‑
连接聚糖与组分a及/或组分b上的asn297连接。不希望受理论束缚，其可能会促进fcr结合，且可能促进融合蛋白的结构完整性及热稳定性。参见阿诺德等人(2007)annu rev immunol 25：21
‑
50。
[0715]
在一些实施例中，组分a及/或组分b包括k至a的突变。在一些实施例中，组分a及/或组分b包括k322a突变。不希望受理论束缚，其可减少clq结合及补体介导的裂解。参见伊杜索吉等人(2000)j.immunol 164：4178
‑
4184。
[0716]
在一些实施例中，组分a及组分b包括旋钮入孔(knobs
‑
into
‑
holes)突变。在一些实施例中，组分a包括突变y349c及t366w，且组分b包括突变d356c、t366s、l368a及y407v(“旋钮入孔”突变)。不希望受理论束缚，其可促进异二聚化而非同二聚化。见摩劝等人(1998)nature biotech.16：677
‑
681。
[0717]
在一些实施例中，组分a及/或组分b包括增加与新生的fc受体(neonatal fc receptor，fcrn)的结合的突变。在一些实施例中，组分a及/或组分b包括突变m428l及n434s。不希望受理论束缚，其可增加与各种细胞上的新生的fc受体(neonatal fc receptor，fcrn)的结合，延长血清的半衰期。参见郭及艾维森(2011)mabs 3：422
‑
430。
[0718]
三聚结构域：
[0719]
三聚结构域是本领域众所周知的。适合作为本发明的融合蛋白中的一异源三聚化
结构域的三聚化结构域的非限制性实例包括：gcn4亮氨酸拉链(zipper)(哈伯里等人，1993，“在gcn4亮氨酸拉链突变体中，在两链、三链及四链卷曲螺旋之间的转换，“science 262(5138)：1401
‑
7)；来自肺表面活性蛋白的35个氨基酸序列(霍普等人，1994，“胶原蛋白的三螺旋形成的成核位点处的平行的三链α螺旋束”febs letters 344(2
‑
3)：191
‑
5)；来自胶原蛋白的简短重复的七肽序列(麦卡林登等人，200，“α
‑
螺旋的卷曲螺旋寡聚化结构域在胶原蛋白超家族中几乎无处不在”，j biol chem.278(43)：42200
‑
7.epub 2003八月14)；以及噬菌体t4纤维蛋白“折叠子(foldon)”(参见，例如，米罗什尼科夫等人，1998，“基于噬菌体t4粘附素的工程三聚纤维蛋白”，protein eng.11(4)：329
‑
32)。示例性三聚化结构域亦公开于美国专利第6,911,205号及第8,147,843号以及美国专利公开的公开案第2010/0136032号。一示例性的三聚化序列是具有以下序列的t4“折叠子(foldon)”：gyipeaprdgqayvrkrgewvllstfl(seq id no：47)。另一示例性三聚化结构域来自血小板反应蛋白
‑
1(thrombospondin
‑
1)，且具有序列：vttlqdsirkvteenkelanelrr(seq id no：56)。
[0720]
修饰：
[0721]
本发明包括本文所述的融合蛋白的变体。虽然通常希望变体显示出增强的与一给定的分子结合的能力，但在一些实施例中，相较于本发明的其他融合蛋白，变体可被设计为活性略微降低，例如在此种情况下，人们会有意地欲减弱活动。此外，可生成具有改变的多聚化特性的变体或衍生物。
[0722]
优选地，本发明的融合蛋白的变体或衍生物维持氨基酸序列的疏水性/亲水性。
[0723]
在额外的实施例中，本发明的融合蛋白是seq id no：14、15、16、17、18、19、20、21、22、32、33、34、35、49、50、51、52、53、54、55、65、66、67、68、69、70或71。在一实施例中，如本领域所理解的彼等术语，本发明的融合蛋白的变体将具有与seq id no：14、15、16、17、18、19、20、21、22、32、33、34、35、49、50、51、52、53、54、55、65、66、67、68、69、70或71至少80％或更高的序列的同一性或同源性，更优选与seq id no：14、15、16、17、18、19、20、21、22、32、33、34、35、49、50、51、52、53、54、55、65、66、67、68、69、70或71具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％的序列同一性。
[0724]
本发明亦提供本发明的融合蛋白的化学修饰。此种修饰的非限制性实例可包括但不限于羧基末端的脂族酯或酰胺或含有羧基侧链的残基的脂族酯或酰胺、含羟基残基的o
‑
酰基衍生物，以及氨基
‑
末端氨基酸或含有氨基的残基，例如赖氨酸或精氨酸。
[0725]
本发明的融合蛋白的其他衍生物包括掺入非天然的氨基酸残基，或磷酸化的氨基酸残基，例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基。其他潜在的修饰包括磺化、生物素化，或添加其他的部分，特别是彼等分子形状类似于磷酸基团的部分。
[0726]
衍生物亦包括通过糖基化修饰的多肽。此等可通过在各种替代的真核宿主表达系统中的合成及加工的过程中，或在进一步加工步骤的过程中修饰糖基化模式来制备。产生糖基化修饰的方法包括将融合蛋白暴露于源自通常进行此种加工的细胞的糖基化酶，例如哺乳动物糖基化酶。或者，去糖基化酶可用于去除在真核表达系统的生产过程中附着的碳水化合物。此外，亦可修饰编码序列，以便添加糖基化位点或删除或禁用糖基化位点。此外，倘若不需要糖基化，则可在原核宿主表达系统中产生蛋白质。
[0727]
本发明的融合蛋白的变体及/或衍生物可通过化学合成或通过使用定点诱变来制备(吉尔曼等人，gene 8：81(1979)；罗伯茨等人，nature 328：731(1987))或因尼斯(ed.)，
1990，pcr protocols：a guide to methods and applications，academic press，纽约，ny)或聚合酶链反应方法(polymerase chain reaction,pcr；斋木等人，science 239：487(1988))，如同多尔蒂等人所举例说明，nucleic acids res.19：2471(1991))来修饰编码完整受体的核酸。
[0728]
在额外的实施例中，本发明的融合蛋白可进一步包括一或多个额外添加的多肽结构域，以促进蛋白质纯化、增加重组蛋白的表达或增加重组蛋白的溶解度。此种纯化/表达/溶解促进结构域包括，但不限于，金属螯合肽，例如允许在固定的金属上纯化的组氨酸
‑
色氨酸模块(波拉斯，1992，protein expr purif 3
‑
0.26328 1)、允许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白质a结构域，以及在flags延伸/亲及纯化系统(immunex公司，西雅图，华盛顿)中使用的结构域。在纯化结构域与组分a及组分b的融合之间包括一可裂解的连接子序列，例如因子xa或肠激酶(invitrogen，圣地亚哥，ca)，有助于促进纯化。
[0729]
融合表达载体包括分别融合谷胱甘肽s转移酶(glutathione s transferase,gst)、麦芽糖b结合蛋白或蛋白质a的pgex(pharmacia，皮斯卡塔韦，nj)、pmal(new england biolabs，比佛利山，ma)及prits(pharmacia，皮斯卡塔韦，nj)，连接至目标重组蛋白。亦可使用ebv、bkv及其他附加型表达载体(episomal expression vector)(invitrogen)。此外，亦可使用逆转录病毒及慢病毒表达载体。此外，可调用为在生物体内高水平表达重组蛋白而设计的多种体内表达系统中的任何一者来产生本文所指定的融合蛋白。
[0730]
如上所述，本发明的融合蛋白可在其n
‑
末端含有一异源信号序列。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，融合蛋白的表达及/或分泌可通过使用一异源信号序列而增加。信号序列通常以疏水性氨基酸核心为特征，其通常在一或多个裂解(cleavage)事例的分泌过程中，从成熟的蛋白质上裂解。此种信号肽含有加工位点，当成熟的蛋白质通过分泌途径时，此等加工位点允许将信号序列从成熟蛋白质上裂解下来。因此，本发明涉及所描述的具有一信号序列的多肽，以及信号序列已经被蛋白水解裂解的多肽(即裂解的产物)。
[0731]
为了增强稳定性及/或反应性，亦可修饰本发明的融合蛋白，以在由天然等位基因变异产生的氨基酸序列中掺入一或多种多态性。此外，可替换或添加d
‑
氨基酸、非天然氨基酸或非氨基酸类似物，以产生在本发明的范围内的修饰融合蛋白。
[0732]
本发明的氨基酸序列可通过在一合适的表达系统中表达编码相同的核苷酸序列来产生。
[0733]
此外，或替代地，融合蛋白本身可使用化学方法合成，以全部或部分合成所需氨基酸序列。例如，多肽可通过固相技术合成，从树脂上裂解，并通过制备型高效液相色谱而纯化(例如，克赖顿(1983)蛋白质：结构及分子原理，wh弗里曼公司，纽约n.y.)。合成多肽的组合物可通过氨基酸分析或测序(例如，埃德曼降解程序(edman degradation procedure))来确认。此外，本发明的融合蛋白或其任何部分的氨基酸序列可在直接合成期间改变及/或使用化学方法与来自其他的亚基或其任何部分的序列组合，以产生变体多肽。
[0734]
用于检测本发明的任何融合蛋白的任何同源物、衍生物或变体的生物活性的分析法是本领域众所周知的。
[0735]
活性及效用
[0736]
在一实施例中，本发明的融合蛋白减少或防止肿瘤细胞迁移、浸润邻近组织，及/或转移至远处部位，实际上固定所述细胞。在另一实施例中，本发明的融合蛋白降低或防止
肿瘤细胞逃避吞噬细胞，例如巨噬细胞的吞噬作用，同时亦促进肿瘤细胞的凋亡及/或免疫破坏。在其他的实施例中，本发明的融合蛋白降低或防止肿瘤细胞逃避一吞噬细胞的吞噬作用，同时促进邻近肿瘤细胞的凋亡。因此，本发明的融合蛋白通过多种机制中的任一者促进肿瘤细胞破坏。
[0737]
pd
‑
1配体或受体在广泛的肿瘤细胞上表达，例如一实体瘤细胞。因此，在一实施例中，本发明提供一种通过将一治疗有效量的本发明的融合蛋白施用于被诊断患有一增殖性疾病的受试者来治疗一增殖性疾病的方法。
[0738]
根据本发明的融合蛋白可施用于患有一细胞增殖性疾病，例如癌症、及恶性及良性肿瘤的个体(例如哺乳动物，包括动物及人类)。在本发明的一具体实施例中，被治疗的个体是人类。
[0739]
融合蛋白被认为对多种类型的肿瘤有效，包括但不限于：卵巢癌；宫颈癌；乳腺癌；前列腺癌；睾丸癌、肺癌、肾癌；结直肠癌；皮肤癌；脑癌；白血病，包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴性白血病及慢性淋巴性白血病。
[0740]
更具体地，可通过本发明的化合物、组合物及方法治疗的癌症包括，但不限于，如下：
[0741]
心脏癌，包括，例如肉瘤，例如，血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤，及脂肪肉瘤；粘液瘤；横纹肌瘤；纤维瘤；脂肪瘤及畸胎瘤；
[0742]
肺癌，包括，例如，支气管癌，例如，鳞状细胞癌、未分化小细胞癌、未分化大细胞癌，及腺癌；肺泡及细支气管癌；支气管腺瘤；肉瘤；淋巴瘤；软骨瘤错构瘤；及间皮瘤；
[0743]
胃肠癌，包括，例如，食道癌，例如，鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤和淋巴瘤；胃癌，例如，恶性肿瘤、淋巴瘤及平滑肌肉瘤；胰腺癌，例如，导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤，及vip瘤(vipoma)；小肠癌，例如，腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤(kaposi’s sarcoma)、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤及纤维瘤；大肠癌，例如，腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤及平滑肌瘤；
[0744]
泌尿生殖道癌，包括，例如，肾癌，例如腺癌、威尔姆氏瘤(wilm’s tumor)(肾母细胞瘤)、淋巴瘤及白血病；膀胱癌及尿道癌，例如，鳞状细胞癌、移行细胞癌及腺癌；前列腺癌，例如，腺癌及肉瘤；睾丸癌，例如，精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样肿瘤，及脂肪瘤；
[0745]
肝癌，包括，例如，肝癌，例如，肝细胞癌；胆管癌；肝母细胞瘤；血管肉瘤；肝细胞腺瘤；及血管瘤；
[0746]
骨癌，包括，例如，成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤(ewing’s sarcoma)、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(osteochrondroma)(骨软骨性外生骨肉瘤)(osteocartilaginous exostoses)、外软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨样骨瘤及巨细胞瘤；
[0747]
神经系统癌，包括，例如，颅骨癌，例如，骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄瘤，及变形性骨炎(osteitis deformans)；脑膜癌，例如，脑膜瘤、脑膜肉瘤(meningiosarcoma)，及神经胶瘤病；脑癌，例如，星形细胞瘤、成神经管细胞瘤(medulloblastoma)、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤(松果体瘤)、多形性胶质母细胞瘤、寡树突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤，及先天性肿瘤；以及脊髓癌，例如神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶
质瘤，及肉瘤；
[0748]
妇科癌，包括，例如，子宫癌，例如，子宫内膜癌；宫颈癌，例如，宫颈癌，及癌前宫颈发育不良；卵巢癌，例如，卵巢癌，包括浆液性囊腺癌(serous cystadenocarcinoma)、粘液性囊腺癌、未分类的恶性肿瘤、颗粒膜细胞瘤(granulosa thecal cell tumor)、塞
‑
莱细胞瘤(sertoli leydig cell tumor)、无性细胞瘤，及恶性畸胎瘤；外阴癌，例如，鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤，及黑色素瘤；阴道癌，例如，透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄形肉瘤(botryoid sarcoma)，及胚胎性横纹肌肉瘤(embryonal rhabdomyosarcoma)；及输卵管癌症，例如恶性肿瘤；
[0749]
血液癌，包括，例如，血液的癌症，例如，急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增殖性疾病、多发性骨髓瘤，及骨髓增生不良综合征(myelodysplastic syndrome)、霍奇金淋巴瘤(hodgkin’s lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non
‑
hodgkin’s lymphoma)(恶性淋巴瘤)以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤(angioimmunoblastic t
‑
cell lymphoma,aitl)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,cll)、急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、单核细胞白血病、骨髓母细胞性白血病(myeloblastic leukemia)、骨髓细胞白血病(myelocytic leukemia)、骨髓粒细胞白血病(myeloid granulocytic leukemia)、骨髓单核球白血病(myelomonocytic leukemia)；奈格利白血病(naegeli leukemia)；浆细胞白血病；浆细胞白血病；前骨髓性白血病(promyelocytic leukemia)；里德细胞白血病(rieder cell leukemia)；席林白血病(schilling's leukemia)；干细胞白血病；白血球缺乏性白血病(subleukemic leukemia)；急性早幼粒细胞白血病；成人t细胞白血病；白血球缺乏性白血病(aleukemic leukemia)；白细胞白血病(aleukocythemic leukemia)；嗜碱性白血病；胚细胞白血病(blast cell leukemia)；牛白血病(bovine leukemia)；慢性骨髓性白血病(chronic myelocytic leukemia)；皮肤白血病；胚细胞性白血病(embryonal leukemia)；未分化细胞白血病(undifferentiated cell leukemia)；嗜酸性粒细胞白血病；格罗斯白血病(gross’leukemia)；毛细胞白血病(hairy
‑
cell leukemia)；血母细胞性白血病(hemoblastic leukemia)；血母细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)；组织细胞白血病；干细胞白血病；急性单核细胞白血病；白血球减少性白血病(leukopenic leukemia)；淋巴白血病(lymphatic leukemia)、淋巴母细胞性白血病(lymphoblastic leukemia)、淋巴细胞性白血病(lymphocytic leukemia)、淋巴源性白血病(lymphogenous leukemia)、淋巴样白血病(lymphoid leukemia)、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病及微粒细胞白血病；
[0750]
皮肤癌，包括，例如，恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤(kaposi’s sarcoma)、痣发育不良痣(moles dysplastic nevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕疙瘩(keloids)、牛皮癣；以及
[0751]
肾上腺癌，包括，例如，神经母细胞瘤。
[0752]
此种癌症的更具体实例包括肾脏癌(kidney cancer)或肾癌(renal cancer)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌及肺鳞癌、鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腹膜癌、
肝细胞癌、胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)，包括胃肠癌、胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors,gist)，胰腺癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、囊状瘤、腺母细胞瘤、肝细胞瘤、血液系统恶性肿瘤，包括非霍奇金淋巴瘤(non
‑
hodgkins lymphoma,nhl)、多发性骨髓瘤及急性血液系统恶性肿瘤、子宫内膜或子宫癌、子宫内膜异位症、纤维肉瘤、唾液腺癌腺癌，外阴癌(vulval cancer)、甲状腺癌、食道癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌(penile carcinoma)、鼻咽癌、喉癌、卡波西肉瘤(kaposi’s sarcoma)、黑色素瘤、皮肤癌、神经鞘瘤、寡树突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、甲状腺癌、威尔姆氏瘤(wilm’stumor)，以及b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(non
‑
hodgkin'slymphoma,nhl)；小淋巴细胞(mall lymphocytic,sl)nhl；中级/滤泡性nhl(intermediate grade/follicular nhl)；中级弥漫性nhl(intermediate grade diffuse nhl)；高级免疫母细胞nhl；高级淋巴母细胞nhl(high grade immunoblastic nhl)；高级小非裂解细胞nhl(high grade small non
‑
cleaved cell nhl)；大块病nhl(bulky disease nhl)；套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；aids相关的淋巴瘤；以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(waldenstrom macroglobulinemia)；慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,cll)；急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia；all)；急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia；aml)；毛细胞毛细胞白血病(hairy
‑
cell leukemia)；慢性骨髓母细胞性白血病(chronic myeloblastic leukemia)；及移植后淋巴组织增生性疾病(post
‑
transplant lymphoproliferative disorder,ptld)，以及与晶状体病(phakomatoses)、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)及梅格斯综合征(meigs’syndrome)相关的异常血管增殖。如本文中所使用，“肿瘤”是指所有的肿瘤细胞生长及增殖，无论是恶性的或良性的，以及所有癌前及癌变细胞及组织。
[0753]
癌症可能是实体瘤，可为或可非为转移性的。癌症亦可以一弥漫性组织的形式发生，例如在白血病中。因此，如本文所提供的术语“肿瘤细胞”包括受上述任何一种疾病折磨的细胞。
[0754]
在一优选的实施例中，所述癌症是实体瘤。在优选的实施例中，所述癌症是胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、黑色素瘤及胶质母细胞瘤中的一者。
[0755]
在另一实施例中，癌症是血液学癌症。在优选的实施例中，血液癌症是急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，all)及急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia，aml)中的一者。
[0756]
药物组合物及给药方案：
[0757]
本发明的组合物的给药通常是肠胃外的、通过皮下、静脉内、肌肉内或腹膜内注射，或通过输注或通过任何其他可接受的全身性方法。在一优选的实施例中，给药是通过皮下注射。在另一优选的实施例中，给药是通过静脉输注，其通常可在约1至5个小时的时间过程中进行。此外，存在多种口服给药方法用于治疗性蛋白质的给药，此等方法可应用于本发明的治疗性融合蛋白质。
[0758]
通常，治疗剂量从一低水平向上滴定，以优化安全性及有效性。通常，每日剂量将落在每公斤体重约0.01至20毫克蛋白质的范围内。通常，剂量范围为每公斤体重约0.1至5毫克蛋白质。可对融合蛋白进行各种修饰或衍生物，例如，添加聚乙二醇链(peg化)
(pegylation)以影响其等药物动力学(pharmacokinetic)及/或药物效应动力学(pharmacodynamic)特性。
[0759]
为了通过肠胃外给药以外的方式给药融合蛋白，其可需要用一材料包覆蛋白质，或与蛋白质共同给药的一材料，防止其失活。例如，蛋白质可在不完全的佐剂中给药，与酶抑制剂共同给药或在脂质体中给药。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸酯(diisopropylfluorophosphate,dep)及三糖醇(trasylol)。脂质体包括水包油包水的cgf乳剂以及常规的脂质体(斯特雷然等人，1984，j.neuroimmunol.7：27)。
[0760]
尽管本发明的组合物可以简单的溶液的形式给药，但其更典型地与其他材料，例如载体，优选地药学上可接受的载体组合使用。有用的药学上可接受的载体可为适合于将本发明的组合物递送给患者的任何相容的、无毒的物质。载体中可包括无菌水、酒精、脂肪、蜡及惰性固体。药学上可接受的佐剂(缓冲剂、分散剂)亦可掺入药物组合物中。通常，可用于肠胃外给药的组合物是众所周知的。例如，雷明顿制药科学(remington's pharmaceutical science)，第17版。(麦克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿，1990)。或者，本发明的组合物可通过可植入的药物递送系统引入一患者体内(厄克特等人，1984，ann.rev.pharmacol.toxicol.24：199)。
[0761]
治疗制剂可以许多常规的剂型给药。制剂通常包括至少一活性组分，以及一或多种药学上可接受的载体。制剂可包括适合于口服、直肠、鼻腔或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内及皮内)给药的彼等。
[0762]
制剂可方便地以单位剂型存在，且可通过药学领域中众所周知的任何方法来制备。参见，例如，吉尔曼等人(版本)(1990)，治疗的药理基础，第8版，pergamon press；以及雷明顿制药科学(remington's pharmaceutical science)，同上，宾夕法尼亚州伊斯顿；安飞士等人(版本)(1993)药物剂型：肠外用药；德克尔，n.y.，利伯曼等人(版本)(1990)药物剂型：片剂，德克尔，n.y.；以及利伯曼等人(版本)(1990)，药物剂型：分散系统，德克尔，n.y.
[0763]
在额外的实施例中，本发明考虑通过基因治疗方法施予所述融合蛋白，例如，施予编码感兴趣的一融合蛋白的一分离的核酸。本发明的融合蛋白的蛋白质建构构体(protein building block)(例如，组分a及组分b)在编码蛋白质的核酸序列及由此产生的蛋白质氨基酸序列方面皆已得到充分表征。通过重组dna方法对此种分离的核酸进行工程改造是在本领域技术人员的能力范围内。为了在特定的细胞背景中最大化重组蛋白产量的目的，密码子优化(codon optimization)亦在本领域技术人员的能力范围内。编码融合蛋白的一分离的核酸的施予包括在表述“施用一治疗有效量的本发明的融合蛋白”中。基因治疗方法是本领域众所周知的。参见，例如，wo96/07321，其公开使用基因治疗方法来产生细胞内抗体。基因治疗方法亦已在人类患者中成功证明。参见，例如鲍姆加特纳等人，1998，circulation 97：12，1114
‑
1123，以及最近的菲什，2007，“一种治疗自身免疫性疾病的基因治疗方法”，immun.res.18：15
‑
26；以及美国专利第7,378,089号，二者皆通过引用并入本文中。另参见班布里奇等人，2008，“基因疗法对勒伯的(leber’s)先天性黑蒙症的视功能的影响”，n engl med 358：2231
‑
2239；以及马奎尔等人，2008，“勒伯的(leber’s)先天性黑蒙症的基因转移的安全性及有效性”，nengl j med 358：2240
‑
8。将编码融合蛋白的核酸(可任选地包含在一载体中)引入一患者细胞的主要方法有两种：体内(in vivo)及离体(ex vivo)。针对
hydrochloride)、美法仑(melphalan)、诺比钦(novembichin)、苯乙酮(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、三环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亚硝基脲(uracil mustard)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲佐菌素(chlorozotocin)、福替莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷尼莫司汀(ranimustine)；抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、红霉素(authramycin)、氮杂丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、仙人掌霉素(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、卡比辛(carabicin)、香霉素(caminomycin)、亲碳素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、去托霉素(detorubicin)、6
‑
重氮
‑5‑
氧代
‑
l
‑
正亮氨酸(6
‑
diazo
‑5‑
oxo
‑
l
‑
norleucine)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依柔比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞洛霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培普霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎拉霉素(quelamycin)、罗柔比星(rodorubicin)、链霉黑素(streptonigrin)、链脲佐菌素(streptozocin)、结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、齐诺他汀(zinostatin)、唑霉素(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤(methotrexate)及5
‑
氟尿嘧啶(5
‑
fluorouracil5
‑
fu)；叶酸类似物，例如地蝶呤(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶呤(pteropterin)、曲美沙酯(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6
‑
巯基嘌呤(6
‑
mercaptopurine)、硫胺嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如阿西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6
‑
氮杂尿苷(6
‑
azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿苷(doxifluridine)、依西他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5
‑
fu；雄激素，例如卡甾酮(calusterone)、丙酸屈莫他酮(dromostanolone propionate)、表甾烷醇(epitiostanol)、美皮司坦(mepitiostane)、睾酮内酯(testolactone)；抗肾上腺素，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如弗洛林酸(frolinic acid)；乙酰丙酮(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；贝司他韦(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达沙酯(edatraxate)；去脂胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；二嗪酮(diaziquone)；乙二胺(elformithine)；醋酸椭圆(elliptinium acetate)；乙醇酸(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯硝胺(lonidamine)；米托瓜松(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹达莫(mopidamol)；硝酸盐(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2
‑
乙基酰肼(2
‑
ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；psk.r
tm
；雷佐生(razoxane)；西佐非朗(sizofiran)；螺锗(spirogermanium)；萘酸(tenuazonic acid)；三嗪酮(triaziquone)；2,2’,2
”‑
三氯三乙胺；氨基甲酸酯(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露糖碱(mannomustine)；米糖醇(mitobronitol)；核糖醇(mitolactol)；匹布罗曼(pipobroman)；加胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“ara
‑
c”)；环
磷酰胺(cyclophosphamide)；噻替哌(thiotepa)；紫杉烷类(taxane)，例如紫杉醇(taxol.r
tm
，bristol
‑
myers squibb oncology,普林斯顿，n.j.)及多西他赛(docetaxel)(taxotere.r
tm
，rhone
‑
poulenc rorer，安东尼，法国)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6
‑
硫鸟嘌呤(6
‑
thioguanine)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，例如顺铂(cisplatin)及卡铂(cisplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(vp
‑
16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素c(mitomycin c)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；温诺平(vinorelbine)；温诺平(navelbine)；诺凡酮(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；cpt
‑
11；拓扑异构酶抑制剂(topoisomerase inhibitor)rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylomithine,dmfo)；视黄酸(retinoic acid)；埃斯霉素(esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)；及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0768]
其他化疗剂亦包括用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香化酶抑制4(5)
‑
咪唑(aromatase inhibiting 4(5)
‑
imidazoles)、4
‑
羟基他莫昔芬(4
‑
hydroxytamoxifen)、三昔芬(trioxifene)、酮昔芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮(onapristone)，及托瑞米芬(toremifene)(法瑞斯顿)(fareston)；抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁他胺(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)，及戈舍瑞林(goserelin)等；以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0769]
可与本发明的融合蛋白组合使用的其他肿瘤细胞毒性剂本身是融合蛋白。肿瘤细胞毒性融合蛋白的例子是ctla
‑4‑
fasl及fn14
‑
trail，其作为顺式环回蛋白(cis loop
‑
back protein)，可通过在肿瘤细胞表面产生自凋亡信号环来发挥作用。参见美国专利第7,569,663号，第8,329,657号及第8,039,437号，各个皆通过引用整体并入。反过来，彼等包括trail组分的顺式环回蛋白可与能够使肿瘤细胞对trail敏感并克服trail耐药性的化疗药物联合给药，例如蛋白酶体抑制剂及组蛋白脱乙酰酶(histone deacetylase,hdac)抑制剂、放线菌酮(cycloheximide)、伊马替尼甲磺酸盐(imatinib mesylate)及其他蛋白质酪氨酸激酶抑制剂(protein tyrosine kinase inhibitors)、17
‑
烯丙氨基
‑
17
‑
脱甲氧基格尔德霉素(17
‑
allylamino
‑
17
‑
demethoxygeldanamycin)、三氧化二砷(arsenic trioxide)及凋亡蛋白质的x连锁抑制剂小分子拮抗剂(x
‑
linked inhibitors of apoptosis protein small molecule antagonists)，以及任何此等的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0770]
关于癌症治疗方法的其他信息在美国专利7,285,522号中提供，其全部内容通过引用方式并入。
[0771]
通过以下非限制性实施例说明本发明的实施。本发明不应被解释为仅限于本文所述的组合物及方法，而应被解释为亦包括其他的组合物及方法。本领域技术人员将知道其他的组合物及方法可用于执行本文中所述的程序。
[0772]
除非另有说明，否则本发明的实施采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术，此等皆在技术人员的能力范围内。此种技术在文
献中得到充分解释，例如“分子克隆：实验室手册”，第四版(桑布鲁克，2012)；“寡核苷酸合成”(给特，1984)，“动物细胞培养”(弗里斯尼，2010)；“酶学方法”“实验免疫学手册”(威尔，1997)，“哺乳动物细胞的基因转移载体”(米勒及卡洛斯，1987)；“分子生物学中的简短规约”(奥苏贝尔，2002)，“聚合酶链反应：原理、应用及故障排除”，(巴巴尔，2011)；“当前的免疫学规约”(科利根，2002)。此等技术适用于生产本发明的多核苷酸及多肽，因此，可在制造及实践本发明时加以考虑。特定实施例的特别有用的技术将在以下部分中讨论。
[0773]
实验的实例
[0774]
下面结合实验例对本发明作进一步详细说明。提供此等示例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不旨在进行限制。因此，本发明决不应被解释为限于以下的实例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何及所有的变化。
[0775]
无需进一步说明，相信本领域普通技术人员可利用前述说明及以下说明性实例来制备及利用本发明的化合物并实施要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出本发明的优选实施例，且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
[0776]
实例1
‑
融合蛋白结合
[0777]
融合蛋白构建体及表达
[0778]
此等融合蛋白的表达质粒构建体是使用从头合成(de novo)的基因片段(赛默飞世尔科技)(thermofisher scientific)产生的，用于各个所需的配体/受体组分，连接至a或b链的铰链、ch2及ch3结构域的合成基因片段(即，z2、z3、z2’
或z3’
域)。通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,pcr)将各组分拼接在一起，使用末端含有限制性位点的引物克隆至表达质粒pcep4中，pcep4是一ebv附加型表达载体(最初在泰科钦斯基(tykocinski)实验室开发)，可在染色体外以在高拷贝数进行复制。在基因合成时，dna片段经过密码子优化以在中国仓鼠卵巢悬浮(chinese hamster ovary suspension)(cho
‑
s)细胞中表达。使用transit
‑
pro试剂(mirus)，将a链构建体及b链构建体瞬时共转染至expicho
‑
s摇瓶培养物中，在37℃下培养24小时，之后在32℃下培养8至10天，从而产生融合蛋白总天数。通过与蛋白a琼脂糖树脂在6℃下混合过夜，从条件培养上清液中纯化蛋白质，之后收集并用非变性中性ph洗脱缓冲液(pierce)洗脱。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,sds
‑
page)验证各个融合蛋白的尺寸及完整性。
[0779]
融合蛋白结合研究
[0780]
通过pcr生成表达人类cd155、具有免疫球蛋白及itim结构域的t细胞免疫受体(t cell immunoreceptor with immunoglobulin and itim domains,tigit)、cd112及cd16(fc
γ
riiia)的全长cdna的配体构建体，并将其克隆至表达质粒pcdna3.1 (赛默飞世尔科技)(thermofisher scientific)中。使用lipofectamine 3000(赛默飞世尔)(thermo fisher)及通过添加g418所选择的稳定转染子，将各个表达构建体转染至cho
‑
s细胞中。在使用合适的荧光染料偶联的抗配体抗体(黑线)或合适的荧光染料偶联的同种型对照抗体(灰线及实心)进行免疫染色之后，通过流式细胞术检测配体表达。使用fcsalyzer软件分析数据。针对融合蛋白结合研究，将融合蛋白添加至未转染的cho
‑
s细胞作为对照(灰线及实心)或表达相应配体的cho
‑
s转染子(transfectant)中，并在6℃下培养1小时，之后洗涤，并使用cy5偶联的抗人类igg、fc
γ
特异性抗体(黑线)并通过流式细胞术分析。参见图18至20。
针对cd16结合研究，将含有tigit或cd155的融合蛋白与作为对照(灰线及实心)的未转染的cho
‑
s细胞或表达cd16的cho
‑
s转染子一起培养，并通过分别识别tigit或cd155的apc偶联抗体或pe偶联抗体进行免疫染色以进行检测(黑线)。参见图21。
[0781]
实例2
‑
融合蛋白结合分析及迁移分析
[0782]
蛋白质凝胶分析
[0783]
在12％sds
‑
page凝胶上分离并还原的(reduced,r)或非还原的(non
‑
reduced,nr)融合蛋白，并在pageblue蛋白染色溶液(赛默飞世尔科技)(thermofisher scientific)中染色12小时。参见图22。
[0784]
免疫印迹分析
[0785]
之后通过pierce bca蛋白质分析试剂盒(赛默飞世尔)(thermo fisher)对融合蛋白进行定量，并加载至12％sds
‑
page凝胶上。将蛋白质电转移至immobilon
‑
p膜(emd millipore，billerica，ma)上，并在奥德赛(odyssey)阻断缓冲液(licor，林肯，ne)中与(a)对抗pd1的ab及(b)对抗igg轻链一抗的ab一起培养12小时。相应的二抗以1：10,000稀释度(santa cruz)使用。使用奥德赛(odyssey)红外成像系统(li
‑
cor biosciences，型号#9120)扫描免疫印迹。参见图23。
[0786]
融合蛋白结合研究
[0787]
cxcr4/7及pd1 黑色素瘤细胞株，(a)yummer1.7细胞或(b)b16，与指定的融合蛋白在6℃下培养1小时，之后洗涤，并使用cy5偶联的抗人类igg，fcγ特异性抗体进行免疫染色，并通过流式细胞术分析(黑实线)，未与融合蛋白一起培养的对照样品(实心灰线)如图24所示。
[0788]
transwell分析
[0789]
transwell插件插入24孔配套板(corning，目录号#353504)。将细胞悬液以25,000个细胞/腔室的速度接种在顶部入侵室(invasion chamber)中。将含有100ng/ml的cxcl12的dme作为化学引诱剂，添加至各个底部孔中。样品在37℃下培养24小时，以允许细胞迁移。使用棉签去除插件顶端表面上的非侵入细胞，并使用2％结晶紫对迁移至支撑件的下表面的细胞进行染色。参见图25。
[0790]
实例3
‑
三点触控
‑
101(tritouch
‑
101)诱导黑色素瘤消退
[0791]
tritouch
‑
101 pd1hfca*vmipiich
‑
hfcb*cl(fp)在体内诱导抑制肿瘤生长，b16f10黑色素瘤皮下模型用于证明pd1hfca*vmipiich
‑
hfcb*cl(fp)诱导黑色素瘤消退。简而言之，bl16小鼠在皮下1
×
105b16f10个细胞后第13、14、15、16及21天，使用100μl(10ug/ml)fp(小鼠r、2l及2r)或pbs(小鼠x或l)处理5次。检测肿瘤尺寸(图26a)。图26b中描绘来自各个治疗组的1只小鼠的代表性图像(x顶部及2r底部)。此等显示tritouch
‑
101诱导黑色素瘤消退的体内数据，与显示此融合蛋白在迁移分析中抑制黑色素瘤细胞的先前数据一致(图25)。
[0792]
实例4
‑
nk调节tritouch蛋白质种类
[0793]
通过添加多功能融合蛋白来增强adcc(图27)。skov
‑
3卵巢细胞株以3000个细胞/孔接种在96孔板中，使其粘附并使用celltracker red cmtpx试剂标记。之后使用绿色荧光caspase
‑
3试剂标记skov
‑
3细胞。将cd16.nk
‑
92细胞株(v158变体)以5：1的e：t与各种融合蛋白25mg/ml或不含蛋白质添加至孔中，并使用incucyte活细胞分析系统进行分析，检测荧
光双阳性(红 绿)细胞的数量。所示结果描述20小时时间点(图27)。
[0794]
其他的实施例
[0795]
在本文中对变量的任何定义中的元素列表的叙述包括将所述变量定义为任何单一元素或所列元素的组合(或子组合)。本文中对于实施例的叙述包括作为任何单一实施例或与任何其他的实施例或其部分组合的实施例。
[0796]
在此引用的各项专利、专利申请及出版物的公开内容皆通过引用整体并入本文中。虽然本发明已参考特定实施例公开，但很明显，本领域的其他技术人员可设计出本发明的其他实施例及变型而不脱离本发明的真实精神及范围。所附权利要求旨在解释为包括所有此种实施例及等效变体。