双频超声辅助盐溶液透析驱动玉米醇溶蛋白-阿拉伯树胶纳米颗粒的制备方法及应用与流程

双频超声辅助盐溶液透析驱动玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶纳米颗粒的制备方法及应用
技术领域
1.本发明属于功能性食品技术领域，具体涉及双频超声辅助盐溶液透析驱动玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶纳米颗粒的制备方法及应用。


背景技术：

2.为了获得理想的纳米颗粒的功能特性，使用物理、化学或酶处理方法对纳米颗粒中的基质蛋白质进行改性，改变蛋白质的构象和结构，进而改变其理化和功能特性。通常为了改善纳米颗粒的稳定性以及对生物活性化合物的包封和控制释放等功能特性，可以通过使用化学交联剂促进蛋白质与多糖、表面活性剂之间的相互作用。在先前的研究中，yang等可以通过磷酸化提高蛋白质的溶解性和乳化稳定性。(yang s,dai l,mao l,et al.effect of sodium tripolyphosphate incorporation on physical,structural,morphological and stability characteristics of zein and gliadin nanoparticles[j].international journal of biological macromolecules,2019,136:653
‑
660.)但是磷酸化使用的是化学交联剂，不可直接应用在食品领域，为了弥补其不足，可以使用较为温和的盐溶液来调控蛋白质的结构，提高蛋白质的功能特性，获得基于玉米醇溶蛋白的高效递送载体。目前盐溶液通常用于研究水溶性蛋白纳米颗粒，例如ca
2
对豌豆蛋白、大豆蛋白，乳清蛋白，小麦胚芽蛋白形成的纳米颗粒特性的影响，并且也有研究喷雾干燥使用氯化钠作为赋形剂来获得纳米结构脂质载体，或者以氯化钠为基质来负载香料、调节β
‑
乳球蛋白纳米纤维的性能。盐离子与玉米醇溶蛋白的结合可改善其结构稳定性与聚集状态，促进生物活性物质在纳米递送载体中的有效递送。但是关于盐溶液诱导制备玉米醇溶蛋白
‑
多糖/表面活性剂复合纳米颗粒的研究较少，纳米颗粒的颗粒特性、储藏稳定性与负载特性有待提高，并且盐离子被局限在特定的制备方法中使用。


技术实现要素：

[0003]
本发明的目的是基于双频超声辅助透析法使用不同种类与浓度的盐溶液作为透析液来获得粒径较小、分布均匀、具有较好的储藏稳定性以及负载率较高的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，制备的玉米醇溶蛋白纳米颗粒应用于负载姜黄素，拓展超声辅助透析法在玉米醇溶蛋白纳米颗粒自组装的应用。
[0004]
本发明的技术方案如下：
[0005]
双频超声辅助盐溶液透析驱动玉米醇溶蛋白自组装制备纳米颗粒的方法，按照下述步骤进行：
[0006]
(1)将玉米醇溶蛋白、阿拉伯树胶和姜黄素溶解在1,2
‑
丙二醇溶液中，作为原始储备溶液，原始储备溶液使用磁力搅拌器搅拌后，得到玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素的混合溶液；
[0007]
(2)将步骤(1)制备的玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素的混合溶液装入透析袋
中，将透析袋密封好放入物料容器中，并在物料容器中加入的不同浓度的盐溶液或者去离子水，浸没透析袋；
[0008]
(3)把步骤(2)中含有透析袋、盐溶液或者去离子水的物料容器放入超声槽中，保持超声槽内的水温恒定，设置双频超声辅助，超声方式为连续超声；超声结束后取出透析袋，放入容器中，并在容器中加入与步骤(2)体积相等的盐溶液或者去离子水，在室温条件下进行透析，透析结束后，即得到玉米醇溶蛋白复合纳米颗粒。
[0009]
优选的，步骤(1)中所述玉米醇溶蛋白与阿拉伯树胶的质量比为1：1，玉米醇溶蛋白与姜黄素的质量比为5：1；所述玉米醇溶蛋白与1,2
‑
丙二醇溶液的质量体积比为1g：100ml；所述1,2
‑
丙二醇溶液的体积浓度为80％。
[0010]
优选的，步骤(1)中所述搅拌的转速为600rpm，搅拌的时间为3h。
[0011]
优选的，步骤(2)中所述混合溶液与盐溶液或者去离子水的体积比例是1:20(v:v)。
[0012]
优选的，步骤(2)中的透析袋的规格为：长度为45cm，宽度为34mm，截留分子量为8000kd
‑
140000kd。
[0013]
优选的，步骤(2)中所述不同盐溶液的浓度是盐溶液中盐离子的浓度决定的，盐离子浓度范围为2mm
‑
10mm，盐离子包括na

与ca
2
。
[0014]
优选的，所述na

浓度范围为2mm
‑
4mm；所述ca
2
浓度范围为6mm
‑
10mm。
[0015]
优选的，步骤(3)中双频超声频率为20/40khz，表明20khz与40khz的超声同时工作；总超声功率为300w，即每个超声频率的功率各分配150w；所述超声时间为8～10min；所述超声槽中的水温恒定在25℃。
[0016]
优选的，步骤(3)中所述室温条件下进行透析的时间为10
‑
11h。
[0017]
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：
[0018]
1.本发明中ca
2
可以通过静电相互作用结合到带负电的基团上来改变蛋白质和多糖的分子结构，从而在较宽的盐离子浓度范围内能够保持较好的颗粒特性。本发明中制备得到的复合纳米颗粒粒径范围在255nm
‑
269nm，储藏30d后的粒径范围在287nm
‑
297nm，包封效率在85％
‑
88％，具有良好的储藏稳定性与包封率。
[0019]
2.本发明中na

通过静电相互作用、疏水作用以及氢键作用制备了玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素复合纳米颗粒。低浓度的na

通过静电吸引紧密粘附在纳米颗粒表面，促进了颗粒之间的紧密交联，并且拓宽纳米颗粒内部空间，从而获得尺寸小分布均匀、包封率较高的纳米颗粒。本发明中制备得到的复合纳米颗粒粒径范围在249nm
‑
410nm，储藏30d后的粒径范围在314nm
‑
454nm，包封效率在69％
‑
89％，具有较好的储藏稳定性与包封率。
[0020]
3.本发明中的双频超声与盐离子可以共同调控纳米颗粒的颗粒特性与负载特性，二者的协同作用可以制备具有良好颗粒特性的复合纳米颗粒。
附图说明
[0021]
图1是双频超声辅助盐溶液透析驱动玉米醇溶蛋白自组装制备纳米颗粒的包封率图；
[0022]
玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素复合纳米颗粒样品根据添加的ca
2
浓度依次命名为z
‑
g
‑
c
‑
ca
‑
2mm、z
‑
g
‑
c
‑
ca
‑
4mm、z
‑
g
‑
c
‑
ca
‑
6mm、z
‑
g
‑
c
‑
ca
‑
8mm、z
‑
g
‑
c
‑
ca
‑
10mm；样品根
据添加的na

最终浓度依次命名为z
‑
g
‑
c
‑
2na
‑
2mm、z
‑
g
‑
c
‑
2na
‑
4mm、z
‑
g
‑
c
‑
2na
‑
6mm、z
‑
g
‑
c
‑
2na
‑
8mm、z
‑
g
‑
c
‑
2na
‑
10mm；对照的透析液为去离子水命名为z
‑
g
‑
c。
具体实施方式
[0023]
下面结合具体实例以及数据，来进一步对本发明技术方案进行详细的描述。但这些实例并不对本发明的技术方案有限制作用，只是举例说明。
[0024]
实施例1：
[0025]
(1)将1g的玉米醇溶蛋白、1g的阿拉伯树胶和0.2g的姜黄素溶解在100ml的80％1,2
‑
丙二醇溶液(v/v)中，作为原始储备溶液。原始储备溶液使用磁力搅拌器搅拌(600rpm，3h)，得到玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素的混合溶液。
[0026]
(2)量取20ml的玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素的混合溶液，装入经过活化处理长度为45cm，宽为34mm，截留分子量为8000kd
‑
140000kd的透析袋中，将透析袋密封好放入物料容器中，并加入400ml的去离子水。
[0027]
(3)把物料容器放置在超声槽中，设置超声频率为20/40khz，总超声功率为300w(每个频率分配150w)，超声时间为10min，超声方式为连续超声，恒温水浴25℃，取出透析袋，重新加入与步骤(2)体积相等的去离子水在室温条件下进行透析，透析时间为11h。
[0028]
(4)透析结束后，得到玉米醇溶蛋白复合纳米颗粒。一部分样品4℃冰箱冷藏30d后测定粒径、pdi和zeta电位，另取一部分新鲜胶体溶液进行粒径、pdi、zeta电位和包封率。
[0029]
(5)粒径和zeta电位的测定：采用安东帕激光粒度仪测量样品的粒径分布、pdi和电位。将新鲜的玉米醇溶蛋白分散液使用去离子水稀释到合适的浓度并振荡摇匀2min，避免颗粒的多重散射效应。所有测量均在室温(25℃)下分三次进行，用kalliope软件分析结果。
[0030]
(6)包封率的测定：将新鲜的样品5000rpm离心10min，获得含有游离姜黄素的上清液，用80％的1,2
‑
丙二醇溶液(v/v)稀释。使用uv
‑
vis紫外可见分光光度计在426nm测定上清液的吸光度。为了确定上清液中游离姜黄素的含量，对溶解在80％的1,2
‑
丙二醇溶液(v/v)中的姜黄素建立标准曲线。在计算出包封的姜黄素的浓度后，通过以下公式获得纳米颗粒负载的姜黄素的包封率。
[0031][0032]
经上述方法制得去离子水处理的玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素复合纳米颗粒的粒径为288.04
±
9.08nm，pdi为0.15
±
0.05,电位为
‑
19.55
±
1.45mv,储藏30d后的纳米颗粒粒径为364.05
±
5.61nm，pdi为0.21
±
0.05，电位为
‑
24.58
±
0.29mv，包封率为86.21
±
7.88％。
[0033]
实施例2：(na

溶液)
[0034]
本实例盐溶液透析液选择na

，并进行了梯度实验，选取na

的最终浓度范围为2mm(z
‑
g
‑
c
‑
2na
‑
2mm)、4mm(z
‑
g
‑
c
‑
2na
‑
4mm)、6mm(z
‑
g
‑
c
‑
2na
‑
6mm)、8mm(z
‑
g
‑
c
‑
2na
‑
8mm)、10mm(z
‑
g
‑
c
‑
2na
‑
10mm)。
[0035]
(1)将1g的玉米醇溶蛋白、1g的阿拉伯树胶和0.2g的姜黄素溶解在100ml的80％1,2
‑
丙二醇溶液(v/v)中，作为原始储备溶液。原始储备溶液使用磁力搅拌器搅拌(600rpm，
3h)，得到玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素混合溶液。
[0036]
(2)量取20ml的玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素的混合溶液，装入经过活化处理长度为45cm宽为34mm，截留分子量为8000kd
‑
140000kd的透析袋中，将透析袋密封好放入物料容器中，并加入浓度分别为2mm、4mm、6mm、8mm、10mm，体积为400ml的na

溶液。
[0037]
(3)把物料容器放置在超声槽中，设置超声频率为20/40khz，总超声功率为300w(每个频率分配150w)，超声时间为10min，超声方式为连续超声，恒温水浴25℃，取出透析袋，重新加入与步骤(2)体积相等的na

溶液在室温条件下进行透析，透析时间为11h。
[0038]
(4)透析结束后，得到玉米醇溶蛋白复合纳米颗粒。一部分样品4℃冰箱冷藏30d后测定粒径、pdi和zeta电位，另取一部分新鲜胶体溶液进行粒径、pdi、zeta电位和包封率。
[0039]
(5)粒径和zeta电位的测定：采用安东帕激光粒度仪测量样品的粒径分布、pdi和电位。将新鲜的玉米醇溶蛋白分散液使用去离子水稀释到合适的浓度并振荡摇匀2min，避免颗粒的多重散射效应。所有测量均在室温(25℃)下分三次进行，用kalliope软件分析结果。
[0040]
(6)包封率的测定：将新鲜的样品5000rpm离心10min，获得含有游离姜黄素的上清液，用80％丙二醇水溶液(v/v)稀释。使用uv
‑
vis紫外可见分光光度计在426nm测定上清液的吸光度。为了确定上清液中游离姜黄素的含量，对溶解在80％丙二醇水溶液(v/v)中的姜黄素建立标准曲线。在计算出包封的姜黄素的浓度后，通过以下公式获得纳米颗粒负载的姜黄素的包封率。
[0041][0042]
经上述方法制得不同浓度的na

处理的玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素复合纳米颗粒。按照浓度梯度2mm、4mm、6mm、8mm、10mm的粒径分别为277.68
±
12.43nm、249.46
±
14.93nm、289.89
±
3.33nm、367.56
±
66.09nm、410.63
±
6.60nm，pdi分别为0.08
±
0.06、0.17
±
0.09、0.24
±
0.05、0.24
±
0.11、0.24
±
0.05,电位分别为
‑
17.88
±
0.74mv、
‑
13.13
±
1.14mv、
‑
15.82
±
1.12mv、
‑
11.29
±
1.45mv、
‑
10.35
±
0.37mv,储藏30d后浓度梯度2mm、4mm、6mm、8mm、10mm的纳米颗粒粒径分别为315.46
±
18.24nm、316.55
±
4.60nm、314.00
±
16.23nm、432.80
±
14.66nm、454.75
±
85.23nm，pdi分别为0.16
±
0.05、0.18
±
0.08、0.27
±
0.02、0.3
±
0.1、0.65
±
0.05，电位为
‑
21
±
0.96mv、
‑
17.86
±
0.92mv、
‑
14.97
±
0.11mv、
‑
14.87
±
1.57mv、
‑
4.59
±
3.34mv。与实施例1相比较，低浓度的na

处理后粒径明显减小，pdi减小，尺寸分布均匀，并且储藏期间也保持较小的粒径，说明低浓度的na

促进了均匀稳定的纳米颗粒的生成，改善了纳米颗粒的颗粒特性，并且提高了复合纳米颗粒的储藏稳定性。而高浓度的na

则可能促进纳米颗粒的粘连絮凝，导致复合纳米颗粒发生了聚集，并且储藏期间颗粒粒径也有所增加。2mm、4mm、6mm、8mm、10mm的na

处理后的复合纳米颗粒的包封率分别为86.27
±
6.44％、89.92
±
8.15％、82.17
±
6.44％、78.25
±
6.71％、69.258
±
6.89％，na

溶液透析后制备的纳米颗粒的包封率呈现出先增加后降低的趋势，低浓度的na

提高了复合纳米颗粒的负载率。
[0043]
实施例3：(ca
2
溶液)
[0044]
本实例盐溶液透析液选择ca
2
，并进行了梯度实验，选取ca
2
的浓度范围为2mm(z
‑
g
‑
c
‑
ca
‑
2mm)、4mm(z
‑
g
‑
c
‑
ca
‑
4mm)、6mm(z
‑
g
‑
c
‑
ca
‑
6mm)、8mm(z
‑
g
‑
c
‑
ca
‑
8mm)、10mm(z
‑
g
‑
c
‑
ca
‑
10mm)。
[0045]
(1)将1g的玉米醇溶蛋白、1g的阿拉伯树胶和0.2g的姜黄素溶解在100ml的80％1,2
‑
丙二醇溶液(v/v)中，作为原始储备溶液。原始储备溶液使用磁力搅拌器搅拌(600rpm，3h)，得到玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素混合溶液。
[0046]
(2)量取20ml的玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素的混合溶液，装入经过活化处理长度为45cm宽为34mm，截留分子量为8000kd
‑
140000kd的透析袋中，将透析袋密封好放入物料容器中，并加入浓度分别为2mm、4mm、6mm、8mm、10mm，体积为400ml的ca
2
溶液。
[0047]
(3)把物料容器放置在超声槽中，设置超声频率为20/40khz，总超声功率为300w(每个频率分配150w)，超声时间为10min，超声方式为连续超声，恒温水浴25℃，取出透析袋，重新加入与步骤(2)体积相等的ca
2
溶液在室温条件下进行透析，透析时间为11h。
[0048]
(4)透析结束后，得到玉米醇溶蛋白复合纳米颗粒。一部分样品4℃冰箱冷藏30d后测定粒径、pdi和zeta电位，另取一部分新鲜胶体溶液进行粒径、pdi、zeta电位和包封率。
[0049]
(5)粒径和zeta电位的测定：采用安东帕激光粒度仪测量样品的粒径分布、pdi和电位。将新鲜的玉米醇溶蛋白分散液使用去离子水稀释到合适的浓度并振荡摇匀2min，避免颗粒的多重散射效应。所有测量均在室温(25℃)下分三次进行，用kalliope软件分析结果。
[0050]
(6)包封率的测定：将新鲜的样品5000rpm离心10min，获得含有游离姜黄素的上清液，用80％丙二醇水溶液(v/v)稀释。使用uv
‑
vis紫外可见分光光度计在426nm测定上清液的吸光度。为了确定上清液中游离姜黄素的含量，对溶解在80％丙二醇水溶液(v/v)中的姜黄素建立标准曲线。在计算出包封的姜黄素的浓度后，通过以下公式获得纳米颗粒负载的姜黄素的包封率。
[0051][0052]
经上述方法制得不同浓度的ca
2
处理的玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素复合纳米颗粒。按照浓度梯度2mm、4mm、6mm、8mm、10mm的粒径分别为260.27
±
3.61nm、266.92
±
10.43nm、255.12
±
7.79nm、256.42
±
6.66nm、269.14
±
9.79nm，pdi分别为0.13
±
0.1、0.13
±
0.06、0.21
±
0.02、0.15
±
0.06、0.14
±
0.05,电位分别为
‑
21.74
±
2.29mv、
‑
19.79
±
1.94mv、
‑
19.52
±
2.36mv、
‑
20.85
±
5.24mv、
‑
22.36
±
0.63mv，储藏30d后浓度梯度2mm、4mm、6mm、8mm、10mm的纳米颗粒粒径分别为297.42
±
6.97nm、287.51
±
2.54nm、291.24
±
10.87nm、296.56
±
7.42nm、287.71
±
10.61nm，pdi分别为0.13
±
0.01、0.15
±
0.04、0.08
±
0.07、0.08
±
0.05、0.14
±
0.11，电位为
‑
24.83
±
0.37mv、
‑
23.3
±
0.8mv、
‑
23.85
±
1.28mv、
‑
24.05
±
0.59mv、
‑
26.23
±
1.52mv。
[0053]
与实施例1、2相比较，ca
2
在促进纳米颗粒内部之间的交联表现出良好的潜力。在不同浓度的ca
2
水平与超声作用下，玉米醇溶蛋白分子链被部分展开，并暴露出更多的活性位点，这些位点与阿拉伯树胶发生相互作用并与其结合形成紧密而稳定的复合物。在储藏30d后，盐溶液诱导复合纳米颗粒的稳定性强于去离子水处理的纳米颗粒，即使储藏后粒径增加，形成稳定的纳米颗粒仍然在可接受的范围内。2mm、4mm、6mm、8mm、10mm的ca
2
处理后的复合纳米颗粒的包封率分别为85.16
±
6.71％、86.84
±
8.6％、86.16
±
7.34％、88.59
±
8.24％、87.63
±
7.52％。钙离子调控的复合纳米颗粒，钙离子促进纳米颗粒之间互相形成
较为紧密的结构，导致内部的有限容量，在浓度为8mm时包封率为最高。
[0054]
表1为双频超声辅助盐溶液透析制备的玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素复合纳米颗粒新鲜样品的粒径、pdi和zeta电位
[0055][0056]
表2为双频超声辅助盐溶液透析制备的玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素复合纳米颗粒储藏30d后的粒径、pdi和zeta电位
[0057][0058][0059]
双频超声辅助盐溶液透析对玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素复合纳米颗粒的稳定性影响较大。对于新鲜的样品如表1所示，低浓度na

可使纳米颗粒的粒径变小，因为盐离子可以很好的保护静电排斥力，因此蛋白质和多糖分子可形成结构紧密的聚集体。较高浓度的na

存在会屏蔽蛋白质表面的一些负电荷，干扰纳米颗粒的形成，可能在纳米颗粒表面形成较厚的离子涂层。因此纳米颗粒表面上的静电斥力突然下降会导致不同颗粒之间无
法保持稳定性发生交联，纳米颗粒随机聚集。而ca
2
对于玉米醇溶蛋白
‑
阿拉伯树胶
‑
姜黄素复合纳米颗粒，离子浓度增加对于纳米颗粒的粒径始终小于去离子水诱导的纳米颗粒，zeta电位相对恒定，这可以解释为纳米颗粒的电位随ca
2
的增加而接近没有盐离子诱导的样品的电位，钙离子在促进纳米颗粒内部之间的交联表现出良好的潜力。在储藏30d后，盐溶液诱导的复合纳米颗粒的稳定性强于去离子水作为透析液制备的纳米颗粒(除了8mm、10mm浓度的na

)，即使储藏后粒径增加，形成稳定的纳米颗粒仍然在可接受的范围内。
[0060]
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。