肾阳虚型帕金森病大鼠模型及其制备方法与流程

技术特征：
1.一种肾阳虚型帕金森病大鼠模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、动物选取：选取18
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20月龄雄性大鼠若干只，另选同种2
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3月龄雌性大鼠若干只；步骤二、大鼠肾阳虚模型制备：2.1分组：按照随机原则将雄鼠分为肾阳虚组、空白组；2.2模型制备：每天上午将肾阳虚组大鼠进行疲劳性游泳试验；每天下午强迫肾阳虚组大鼠与雌性大鼠进行同笼实验，将1只雄性大鼠与3只动情期雌性大鼠同笼，第二天早晨取出雄鼠；疲劳游泳实验和同笼实验交替轮转，连续进行2
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4周；空白组大鼠正常喂养；2.3大鼠肾阳虚模型评价：通过对肾阳虚组和空白组大鼠进行外形观察和饮食及排便监测，两组进行比较，对大鼠肾阳虚模型进行综合打分评价，达到总分的70％即造模成功，可参与下一步模型的制备；步骤三、大鼠pd模型的建立：3.1分组：将造模成功的肾阳虚大鼠分成三组，分别为pd模型组、肾阳虚对照组和阳性药对照组；3.2模型制备：pd模型组给予每日注射终浓度为0.5mg/ml的鱼藤酮，每次1ml/kg，肾阳虚对照组给予注射等量的空白溶剂，阳性药对照组给予注射终浓度为0.5mg/ml的鱼藤酮外，还补充注射终浓度为2.5mg/ml的左旋多巴，每次1ml/kg；三组均注射7天后停止；步骤四、大鼠pd模型的评价：对造模后的三组实验大鼠分别进行外形观察、行为学检测、血清α
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syn含量检测、黑质和纹状体组织he染色分析、黑质和纹状体组织th阳性免疫组化检测五个方面的评价；除需通过外形观察外，还需要通过其余任意三项检测，即造模成功。2.根据权利要求1所述的一种肾阳虚型帕金森病大鼠模型的制备方法，其特征在于：所述步骤二中对大鼠肾阳虚模型评价时，采用的外形观察指标包括：皮毛光泽度、竖毛现象、是否畏寒怕冷、是否喜欢拥挤在一起、反应灵敏度、自主活动情况、抗激能力、阴囊是否皱缩、大小便频次是否增加；将肾阳虚组与空白组大鼠进行对比，只要出现上述指标之一，则打5分，否则打0分，10个指标累计打分，满分50分。3.根据权利要求1所述的一种肾阳虚型帕金森病大鼠模型的制备方法，其特征在于：所述步骤二中对大鼠肾阳虚模型评价时，采用的饮食及排便监测指标包括：24h饮水量/体重、24h饮食量/体重以及2h粪便含水量；将肾阳虚组与空白组大鼠进行对比，根据各项指标的变化程度进行打分，其中24h饮水量/体重每增加3％记1分，以此类推15分封顶；24饮食量/体重每减少2％记1分，以此类推15分封顶；2h粪便含水量每增加2％记1分，以此类推20分封顶；满分50。4.根据权利要求1所述的一种肾阳虚型帕金森病大鼠模型的制备方法，其特征在于：所述步骤三中模型制备时鱼藤酮的溶剂为二甲基亚砜和生理盐水按体积比7：1制成的混合溶剂。5.根据权利要求1所述的一种肾阳虚型帕金森病大鼠模型的制备方法，其特征在于：所述步骤四中对大鼠pd模型评价时，采用的外形观察指标包括：反应迟缓、运动不灵活、运动不协调、抬头困难、后腿不灵活；将pd模型组与肾阳虚对照组大鼠进行对比，统计每只大鼠出现上述任意症状的项数，出现四项及以上可进行下一步评价，否则不再进行下一步，本项
指标为排除性指标，只由满足本项指标的条件才可进行下一步。6.根据权利要求1所述的一种肾阳虚型帕金森病大鼠模型的制备方法，其特征在于：所述步骤四中对大鼠pd模型评价时，采用的行为学检测方法为水迷宫实验法，具体包括：(1)训练实验：先对实验大鼠进行连续水迷宫训练实验6天，每天2次，每次1min，水温维持在24℃左右，每次由同一个人将大鼠头朝池壁放入水中，随机取东、西、南、北4个方向用不同颜色的卡纸标记，记录大鼠找到水下平台所用时间，记录找到平台且停留20s的时间，如超过时间未找到，将大鼠引导至平台，并停留20s；(2)正式实验：水迷宫实验第7天，将平台撤除，将大鼠从相同位置放入池中，记录3min内大鼠经过原平台位置的次数和在放置平台象限停留时间；(3)评价：对上述记录的两项数据，即经过原平台位置的次数和在第一象限停留时间，进行统计分析，将pd模型组与肾阳虚对照组相比，如果此两项数值均降低，且两组数据差异存在具有统计学意义，则评价通过；阳性药对照组的实验数据作为验证性指标使用；pd模型组和阳性药对照组相比，如果此两项数值均降低，且两组数据差异存在具有统计学意义，则通过验证，否则该评价失败。7.根据权利要求1所述的一种肾阳虚型帕金森病大鼠模型的制备方法，其特征在于：所述步骤四中对大鼠pd模型评价时，血清α
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syn含量检测是采用elisa试剂盒测定三组实验大鼠血清中的α
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syn蛋白含量；然后对实验数据进行统计分析，判断pd模型组与肾阳虚对照组相比，血清α
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syn含量是否升高，如果升高且该数据有统计学意义，则评价通过。8.根据权利要求1所述的一种肾阳虚型帕金森病大鼠模型的制备方法，其特征在于：所述步骤四中对大鼠pd模型评价时，黑质和纹状体组织he染色分析是对实验大鼠的黑质和纹状体组织制作病理切片，然后以肾阳虚对照组作为参照，在显微镜下观察pd模型组大鼠的黑质和纹状体组织神经元形态数量和结构是否异常、胞核胞质分界是否模糊、细胞染色是否加深、有无明显炎症，出现上述三项及以上指征的，评价通过。9.根据权利要求1所述的一种肾阳虚型帕金森病大鼠模型的制备方法，其特征在于：所述步骤四中对大鼠pd模型评价时，黑质和纹状体组织th阳性免疫组化检测是对实验大鼠的黑质和纹状体组织制作病理切片，然后使用eclipse ci
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l拍照显微镜对组织进行成像，成像后使用image
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pro plus 6.0分析软件进行分析处理，并计算出面密度，从而判断各组大鼠的黑质和纹状体组织中th阳性神经元数量变化；以肾阳虚对照组作参考，判断pd模型组大鼠的黑质和纹状体组织中的th面密度是否显著降低，如果显著降低则评价通过。10.根据权利要求1
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9任意一项所述方法制备的肾阳虚型帕金森病大鼠模型。

技术总结
本发明涉及一种肾阳虚型帕金森病大鼠模型及其制备方法，目的是解决现有帕金森大鼠模型症状不稳定，易出现中毒反应，不利于实际应用等技术问题。本发明采用疲劳性游泳试验及同笼实验先建立出一个完全遵循经典中医理论的肾阳虚动物模型，然后通过对该模型进行评价，筛选出合格的肾阳虚大鼠，用于下一步的PD造模。造模后通过外形观察、行为学检测、血清α


技术研发人员：闫川慧 王欢 李东明 窦志芳 陈燕清 贺文彬 张世霞 秦亚莉 侯江淇 韩诚 赵雨薇
受保护的技术使用者：山西中医药大学
技术研发日：2021.07.02
技术公布日：2021/10/11