肾阳虚型帕金森病大鼠模型及其制备方法与流程

1.本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及一种肾阳虚型帕金森病大鼠模型及其制备方法。


背景技术：

2.帕金森病(parkinson’s disease,pd)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病。流行病学调查显示，pd已成为中老年人群中除阿尔茨海默病(alzheimer disease，ad)外最常见的神经系统退行性疾病，工业化国家发病率已接近0.3％。而在我国，pd患者呈逐年増加趋势,目前患病人数已超200万。pd虽然不会直接缩短患者寿命,但其与ad一样，严重影响患者的生存质量。此外，因其病程长、致残率高，给患者和家庭带来沉重的负担及烦恼。
3.pd的发病机制并未完全明晰，西医认为其发病可能与遗传易感性、氧化应激、线粒体缺陷、神经免疫炎症、神经兴奋性毒性、细胞凋亡和异常蛋白的集聚等因素相关。最新研究则发现pd患者肠道中普雷沃氏菌属的比例明显降低，因此也有学者认为pd的发病或与肠道菌群失调有关。
4.中医理论则认为，肾藏精生髓，脑为髓海，主神志思维，司机体运动。髓由肾精及气血所化，充养脑实质，肾虚则精不上承而脑髓空虚、脑窍失养致脑失其用。pd正是这样一种以震颤、肌强直、姿势异常等为主要特征的肢体运动功能障碍的中枢神经系统(cns)性病变。由于pd多发于中老年，高发人群聚集在55岁及以上。从中医角度思考，此年龄段正是人体各脏腑功能减退的阶段，尤以肾中精气发展至由盛至亏渐衰为主要生理特点。
5.尽管对帕金森病的研究已有不少进展，但离彻底治愈还有很长的路要走。因此，更深入的研究pd的发病机制和治疗方法很有必要，而稳定高效的动物模型是深入研究该疾病的前提。
6.现有的pd动物模型主要是利用西药刺激制得，比如有：6～羟基多巴胺(6—ohda)模型、百草枯模型、mptp模型、鱼藤酮模型等。
7.6—ohda模型是目前应用最多的模型之一，该模型动物行为改变持久而稳定，利于观察并可进行量化检测，在生理病理上与pd患者有较多相似之处，但未能模拟出pd的主要临床表现及理特征性改变路易小体。
8.百草枯模型中使用的除草剂百草枯可损伤黑质纹状体多巴胺能神经元，促进神经系统功能退行性改变，但在造模时其暴露方式有别于实际环境因素作用方式，故该模型尚待进一步研究。
9.mptp模型为1—甲基—4—苯基—1，2，3，6—四氢毗啶(mptp)模型，该模型可引发pd症状及多巴胺能神经元损伤，但无路易小体形成。
10.鱼藤酮，是从醉鱼科豆属植物毛鱼藤中提取的化学物质，是一种具有高效、低毒、残留期短的特点的有机杀虫剂，具有很强的脂溶性，能透过血脑屏障，抑制脑细胞内线粒体复合酶i，产生大量氧自由基和释放凋亡诱导因子，引发氧化应激和细胞凋亡，并可产生lewy小体。该模型大鼠还可表现出pd患者的屈曲姿势和运动障碍。
11.然而这些模型都是选用青年大鼠，通过注射化学药物短期、强刺激获得的，只是尽量的模拟帕金森发病后的外在症状，却无法真实反映帕金森发病的内在缘由，因此无法揭露帕金森病的发病机理。此外，大鼠的患病症状不稳定，且容易出现中毒反应，不利于实际应用。因此，一种符合帕金森发病特征、症状稳定、可靠的帕金森病动物模型亟待研究开发。


技术实现要素：

12.本发明的目的是解决现有帕金森大鼠模型症状不稳定，易出现中毒反应，不利于实际应用等技术问题，提供一种符合帕金森发病特征、症状稳定、可靠的帕金森病动物模型制备方法。本发明选用老年大鼠，应用“劳倦过度、房事不节”法，先建立出一个完全遵循经典中医理论的肾阳虚动物模型，然后再辅以西药刺激，从而获得症状稳定、可靠的帕金森病动物模型。
13.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
14.一种肾阳虚型帕金森病大鼠模型的制备方法，包括以下步骤：
15.步骤一、动物选取：选取18
‑
20月龄雄性大鼠若干只，另选同种2
‑
3月龄雌性大鼠若干只；
16.步骤二、大鼠肾阳虚模型制备：
17.2.1分组：按照随机原则将雄鼠分为肾阳虚组、空白组；
18.2.2模型制备：每天上午将肾阳虚组大鼠进行疲劳性游泳试验；每天下午强迫肾阳虚组大鼠与雌性大鼠进行同笼实验，将1只雄性大鼠与3只动情期雌性大鼠同笼，第二天早晨取出雄鼠；疲劳游泳实验和同笼实验交替轮转，连续进行2
‑
4周；空白组大鼠正常喂养；
19.2.3大鼠肾阳虚模型评价：通过对肾阳虚组和空白组大鼠进行外形观察和饮食及排便监测，两组进行比较，对大鼠肾阳虚模型进行综合打分评价，达到总分的70％即造模成功；具体评价方法如下：
20.2.3.1外形观察：观察两组大鼠的皮毛光泽度、竖毛现象、是否畏寒怕冷、是否喜欢拥挤在一起、反应灵敏度、自主活动情况、抗激能力、阴囊是否皱缩、大小便频次是否增加；将肾阳虚组与空白组大鼠进行对比，只要出现上述指标之一，则打5分，否则打0分，并计入表1，10个指标累计打分，满分50分。
21.表1肾阳虚外形观察评价表
[0022][0023]
2.3.2饮食及粪便监测：
[0024]
监测两组实验大鼠的24h饮水量/体重、24h饮食量/体重和2h粪便含水量指标，将肾阳虚组与空白组大鼠进行对比，根据各项指标的变化程度进行打分，其中24h饮水量/体重每增加3％记1分，以此类推15分封顶；24饮食量/体重每减少2％记1分，以此类推15分封顶；2h粪便含水量每增加2％记1分，以此类推20分封顶；满分50，打分结果计入表2。
[0025]
表2饮水、饮食和粪便含水量监测表
[0026][0027]
根据外形观察指标、饮食及粪便监测指标进行打分，总分大于70分，说明肾阳虚模型造模完成，可参与下一步模型的制备。
[0028]
步骤三、大鼠pd模型的建立：
[0029]
3.1分组：将造模成功的肾阳虚大鼠分成三组，分别为pd模型组、肾阳虚对照组和阳性药对照组；
[0030]
3.2模型制备：pd模型组给予每日注射终浓度为0.5mg/ml的鱼藤酮，每次1ml/kg，肾阳虚对照组给予注射等量的空白溶剂，阳性药对照组给予注射终浓度为0.5mg/ml的鱼藤酮外，还补充注射终浓度为2.5mg/ml的左旋多巴，每次1ml/kg；三组均注射7天后停止；
[0031]
优选地，所述步骤三中模型制备时鱼藤酮的溶剂为二甲基亚砜和生理盐水按体积比7：1制成的混合溶剂。
[0032]
步骤四、大鼠pd模型的评价：
[0033]
对造模后的三组实验大鼠分别进行外形观察、行为学检测、血清α
‑
syn含量检测、黑质和纹状体组织he染色分析、黑质和纹状体组织th阳性免疫组化检测五个方面的评价。除需通过外形观察外，还需要通过其余任意三项检测，即造模成功。外形观察和行为学检测实验完成后，进行血清及组织样本采集，以备后三项检测使用。具体评价过程如下：
[0034]
4.1外形观察：
[0035]
本项评价为必须通过项，如果本项评价不通过，则造模失败。如果本项评价通过，则可继续进行其他评价实验。以肾阳虚对照组作为参考，观察pd模型组大鼠是否存在反应迟缓、运动不灵活、运动不协调、抬头困难、后腿不灵活症状；
[0036]
统计每只大鼠出现上述任意症状的项数，出现四项及以上，即可通过本项评价。将结果计入表3。
[0037]
表3pd外形观察评价表
[0038][0039]
4.2行为学检测：
[0040]
水迷宫实验是可以检测大鼠的学习、记忆、认知能力，是观察是否具有帕金森病运
动平衡性障碍的重要依据。具体方法如下：
[0041]
(1)训练实验：先对实验大鼠进行连续水迷宫训练实验6天，每天2次，每次1min，水温维持在24℃左右，每次由同一个人将大鼠头朝池壁放入水中，随机取东、西、南、北4个方向用不同颜色的卡纸标记，记录大鼠找到水下平台所用时间，记录找到平台且停留20s的时间，如超过时间未找到，将大鼠引导至平台，并停留20s；
[0042]
(2)正式实验：水迷宫实验第7天，将平台撤除，将大鼠从相同位置放入池中，记录3min内大鼠经过原平台位置的次数和在放置平台象限停留时间；
[0043]
(3)评价：对上述记录的两项数据，即经过原平台位置的次数和在第一象限停留时间，进行统计分析，pd模型组与肾阳虚对照组相比，如果此两项数值均降低，且两组数据差异存在具有统计学意义，则评价通过。阳性药对照组的实验数据作为验证性指标使用。pd模型组和阳性药对照组相比，如果此两项数值均降低，且两组数据差异存在具有统计学意义，则通过验证，否则该评价失败。
[0044]
外形观察和行为学检测实验完成后，进行血清及组织样本采集，以备后三项检测使用。
[0045]
4.3血清α
‑
syn含量检测
[0046]
pd的主要病理改变是中脑黑质、纹状体多巴胺(dopamine，da)能神经元的变性死亡、丢失及α
‑
syn的异常聚集，因此可以通过检测大鼠血清中α
‑
syn含量来判断是否发生帕金森病。
[0047]
具体检测方法为：
[0048]
麻醉大鼠，静脉取血，血液静置30min，4℃，3500r/min，离心10min，分离上清为血清，4℃保存备用。采用elisa试剂盒测定三组实验大鼠血清中的α
‑
syn蛋白含量；然后对实验数据进行统计分析，判断pd模型组与肾阳虚对照组相比，血清α
‑
syn含量是否升高，如果升高且该数据有统计学意义，则评价通过。阳性药对照组的实验数据作为验证性指标使用。pd模型组和阳性药对照组相比，血清α
‑
syn含量是否升高，如果升高且该数据具有统计学意义，则通过验证，否则该评价失败。
[0049]
4.4黑质和纹状体组织he染色分析
[0050]
pd患者的病理特征表现为脑内黑质、纹状体能神经元选择性丢失以及残存的神经元细胞内出现α
‑
syn的包涵体。α
‑
syn是由140个氨基酸构成的小分子可溶性单体蛋白质，正常情况下主要存在于神经元的突触前末梢，用于突触小泡的运输、再循环和胞吐融合孔的推动作用；但在疾病状态下，α
‑
syn发生错误折叠，形成不溶性富含β
‑
折叠的毒性聚集体，这些聚集体沉积于神经元。
[0051]
分析方法为：对实验大鼠的黑质和纹状体组织制作病理切片，然后以肾阳虚对照组作为参照，在显微镜下观察pd模型组大鼠的黑质和纹状体组织神经元形态数量和结构是否异常、胞核胞质分界是否模糊、细胞染色是否加深、有无明显炎症，出现上述三项及以上指征的，评价通过。阳性药对照组的实验数据作为验证性指标使用。
[0052]
4.5黑质和纹状体组织th阳性免疫组化检测
[0053]
pd发病部位主要在黑质和纹状体。黑质和纹状体中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，th)是多巴胺能神经元的特异性标志物，中脑黑质、纹状体的th阳性数量可代表多巴胺能神经元数量，从而反映是否出现帕金森病状。
[0054]
检测方法为：对实验大鼠的黑质和纹状体组织制作病理切片，使用eclipse ci
‑
l拍照显微镜选取脑组织的目的区域进行200倍成像，成像时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。成像完成后使用image
‑
pro plus 6.0分析软件，进行分析处理，并计算出面密度，从而判断各组大鼠的黑质和纹状体组织中th阳性神经元数量变化。以肾阳虚对照组作参考，判断pd模型组大鼠的黑质和纹状体组织中的th面密度是否显著降低，如果显著降低则评价通过。阳性药对照组的实验数据作为验证性指标使用。
[0055]
本发明还提供一种采用上述方法制备的肾阳虚型帕金森病大鼠模型。
[0056]
本发明的有益效果为：
[0057]
1、本发明提供了一种符合帕金森发病特征、操作简便、症状稳定、真实可靠且能够真实模拟帕金森发病缘由的大鼠模型，为此帕金森类疾病的病理研究、及药物研发提供助力。
[0058]
2、本发明选用老年大鼠，应用“劳倦过度、房事不节”法，通过疲劳性游泳试验及同笼实验先建立出一个完全遵循经典中医理论的肾阳虚动物模型，然后再辅以西药刺激，从而获得症状稳定、可靠的帕金森病动物模型。通过发病机理真实模拟帕金森发病的内在缘由，更真实的重现了肾阳虚症状，为下一步的pd模型建立提供了真实、稳定、可靠的模拟基础，该模拟方法也不容易出现中毒反应，更有利于实际应用。
[0059]
3、本发明引入了评价机制，在肾阳虚模型制备时通过外形观察和饮食及排便监测，对大鼠肾阳虚模型进行综合打分评价，精确筛选出造模成功的肾阳虚大鼠，剔除不成功的大鼠，提高下一步建模的成功率。
[0060]
4、本发明在pd造模后也引入了评价机制，在制备出大鼠pd模型后，分别进行外形观察、行为学检测、血清α
‑
syn含量检测、黑质和纹状体组织he染色分析、黑质和纹状体组织th阳性免疫组化检测五个方面的评价；除需通过外形观察外，还需要通过其余任意三项检测，即造模成功。上述评价指标可精准的对pd模型进行评价，从外形、行为学、血液指标等多方面进行综合评价，准确率高，评价更全面。
附图说明
[0061]
图1为本发明实施例中黑质和纹状体组织he染色分析时各组大鼠黑质、纹状体组织病理切片(he染色)展示图。
[0062]
图2为本发明实施例中黑质和纹状体组织th阳性免疫组化检测时各组大鼠黑质、纹状体组织病理切片(th阳性检验)展示图。
具体实施方式
[0063]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明的实施方式中，为了使读者更好地理解本技术而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本技术各权利要求所要求保护的技术方案。
[0064]
本实施例中的一种肾阳虚型帕金森病大鼠模型的制备方法，包括以下步骤：
[0065]
步骤一、动物选取：选取18
‑
20月龄sd雄性大鼠30只，体重在400g左右，另选同种2
‑
3月龄雌性大鼠45只，体重在400g左右。
[0066]
步骤二、大鼠肾阳虚模型制备：
[0067]
2.1分组：按照随机原则将sd雄鼠分为肾阳虚组、空白组，每组各15只；
[0068]
2.2模型制备：每天上午将肾阳虚组的15只大鼠进行疲劳性游泳试验，即将其放在直径100cm，水深60cm，水温30℃的塑料圆桶内游泳，每次30分钟，直至发现有大鼠无力继续游动，即将下沉时则迅速将其捞出；
[0069]
每天下午强迫肾阳虚组大鼠与雌性大鼠进行同笼实验，将1只雄性大鼠与3只动情期雌性大鼠同笼，第二天早晨取出雄鼠；
[0070]
疲劳游泳实验和同笼实验交替轮转，连续进行2
‑
4周；
[0071]
空白组大鼠正常喂养；
[0072]
2.3大鼠肾阳虚模型评价：由于本模型为分步进行，因此在第一步肾阳虚模型评价中，不能采取采血检测等对大鼠伤害过重的处理方法，只通过对肾阳虚组和空白组大鼠进行外形观察和饮食及排便监测，两组进行比较，对大鼠肾阳虚模型进行综合打分评价，总分大于70分，说明肾阳虚模型造模完成。具体评价方法如下：
[0073]
2.3.1外形观察：观察两组大鼠的皮毛光泽度、竖毛现象、是否畏寒怕冷、是否喜欢拥挤在一起、反应灵敏度、自主活动情况、抗激能力、阴囊是否皱缩、大小便频次是否增加；将肾阳虚组的15只大鼠与空白组大鼠进行对比，一旦出现上述指标之一，则打5分，否则打0分，并计入表1，10个指标累计打分，满分50分。
[0074]
表1肾阳虚外形观察评价表
[0075][0076]
2.3.2饮食及粪便监测：
[0077]
监测两组实验大鼠的24h饮水量/体重、24h饮食量/体重和2h粪便含水量指标，计算15只空白组大鼠三个指标的平均值，将肾阳虚组15只大鼠与空白组大鼠的平均值进行对比，根据各项指标的变化程度进行打分，其中24h饮水量/体重每增加3％记1分，以此类推15分封顶；24饮食量/体重每减少2％记1分，以此类推15分封顶；2h粪便含水量每增加2％记1分，以此类推20分封顶；满分50，对每只肾阳虚组打分结果计入表2。
[0078]
表2饮水、饮食和粪便含水量监测表
[0079][0080]
按照外形观察、饮食及粪便监测对本实施例中15只肾阳虚组大鼠进行综合打分，结果如表3：
[0081]
表3外形观察和饮食及排便监测总分表
[0082][0083]
由表3可知，其中肾阳虚组有12只大鼠总分为大于75分，说明肾阳虚模型造模成功，可以进行下一步药物刺激，另外三只大鼠总分小于75分，不参与下一步造模，肾阳虚型大鼠的造模成功率为80％。
[0084]
步骤三、大鼠pd模型的建立：
[0085]
3.1分组：将造模成功的12只肾阳虚大鼠分成三组，分别为pd模型组、肾阳虚对照组和阳性药对照组，每组各4只；
[0086]
3.2模型制备：pd模型组给予每日注射终浓度为0.5mg/ml的鱼藤酮，每次1ml/kg，鱼藤酮的溶剂为二甲基亚砜和生理盐水按体积比7：1制成的混合溶剂。肾阳虚对照组给予注射等量的空白溶剂即二甲基亚砜和生理盐水按体积比7：1制成的混合溶剂。阳性药对照组给予注射终浓度为0.5mg/ml的鱼藤酮外，还补充注射终浓度为2.5mg/ml的左旋多巴，每次1ml/kg；三组均注射7天后停止；
[0087]
步骤四、大鼠pd模型的评价：
[0088]
以肾阳虚对照组作为参照，对造模后的三组实验大鼠依次进行外形观察、行为学检测、血清α
‑
syn含量检测、黑质和纹状体组织he染色分析、黑质和纹状体组织th阳性免疫组化检测五个方面分别评价。除需通过外形观察外，还需要通过其余任意三项检测，即造模成功。外形观察和行为学检测实验完成后，进行血清及组织样本采集，以备后三项检测使用。具体评价过程如下：
[0089]
4.1外形观察：本项评价为必须通过项，如果本项评价不通过，则造模失败，如果本项评价通过，则可继续进行其余四项评价实验。以肾阳虚对照组作为参考，观察pd模型组大鼠是否存在反应迟缓、运动不灵活、运动不协调、抬头困难、后腿不灵活症状；
[0090]
统计每只大鼠出现上述任意症状的项数，出现四项及以上，即可通过本项评价。将结果计入表4。
[0091]
表4pd外形观察评价表
[0092][0093]
与肾阳虚对照组相比，pd模型组4只大鼠均出现，反应迟缓、运动不灵活、运动不协调、抬头困难、后腿不灵活等其中至少四个症状，而阳性药对照组基本没或者少有上述症状，因此外形观察评价通过，进行下一项评价。
[0094]
4.2行为学检测：
[0095]
水迷宫实验是可以检测大鼠的学习、记忆、认知能力，是观察是否具有帕金森病运动平衡性障碍的重要依据。具体方法如下：
[0096]
(1)训练实验：先对实验大鼠进行连续水迷宫训练实验6天，每天2次，每次1min，水温维持在24℃左右，每次由同一个人将大鼠头朝池壁放入水中，随机取东、西、南、北4个方向用不同颜色的卡纸标记，记录大鼠找到水下平台所用时间，记录找到平台且停留20s的时间，如超过时间未找到，将大鼠引导至平台，并停留20s；
[0097]
(2)正式实验：水迷宫实验第7天，将平台撤除，将大鼠从相同位置放入池中，记录3min内大鼠经过原平台位置的次数和在放置平台象限停留时间；
[0098]
(3)评价：对上述记录的两项数据，即经过原平台位置的次数和在第一象限停留时间，进行统计分析，结果见表5。pd模型组与肾阳虚对照组相比，此两项数值均降低，且两组数据差异均具有统计学意义(p<0.01)。pd模型组大鼠与阳性药对照组相比，此两项数值均降低，且两组数据差异均具有统计学意义(p<0.05)，评价通过。同时，pd模型组和阳性药对照组相比，此两项数值均降低，且两组数据差异均存在具有统计学意义，通过验证。因此行为学检测评价通过，进行下一项评价。
[0099]
表5三组大鼠经过原平台的次数和在第一象限停留时间表
[0100][0101]
4.3血清α
‑
syn含量检测
[0102]
pd的主要病理改变是中脑黑质、纹状体多巴胺(dopamine，da)能神经元的变性死亡、丢失及α
‑
syn的异常聚集，因此可以通过检测大鼠血清中α
‑
syn含量来判断是否发生帕金森病。
[0103]
具体检测方法为：
[0104]
麻醉大鼠，静脉取血，血液静置30min，4℃，3500r/min，离心10min，分离上清为血清，4℃保存备用。采用elisa试剂盒测定三组实验大鼠血清中的α
‑
syn蛋白含量；然后对实验数据进行统计分析，判断pd模型组与肾阳虚对照组相比，血清α
‑
syn含量是否升高，如果升高且该数据有统计学意义，则评价通过。阳性药对照组的实验数据作为验证性指标使用，
结果见表6。pd模型组和阳性药对照组相比，血清α
‑
syn含量是否升高，如果升高且该数据具有统计学意义，则通过验证。实验结果：
[0105]
表6三组大鼠血清α
‑
syn含量
[0106][0107]
由表6可知，与肾阳虚对照组相比，pd模型组血清α
‑
syn含量显著升高(p<0.01)，且有统计学意义；与阳性药对照组相比，pd模型组血清α
‑
syn含量显著升高(p<0.05)，且有统计学意义。因此，血清α
‑
syn含量评价通过。
[0108]
4.4黑质和纹状体组织he染色分析
[0109]
pd患者的病理特征表现为脑内黑质、纹状体能神经元选择性丢失以及残存的神经元细胞内出现α
‑
syn的包涵体。α
‑
syn是由140个氨基酸构成的小分子可溶性单体蛋白质，正常情况下主要存在于神经元的突触前末梢，用于突触小泡的运输、再循环和胞吐融合孔的推动作用；但在疾病状态下，α
‑
syn发生错误折叠，形成不溶性富含β
‑
折叠的毒性聚集体，这些聚集体沉积于神经元。
[0110]
分析方法为：对实验大鼠的黑质和纹状体组织制作病理切片，然后以肾阳虚对照组作为参照，在显微镜下观察pd模型组大鼠的黑质和纹状体组织是否存在神经元数量减少、神经元皱缩、细胞染色加深、胞核胞质分界不清、神经元胞质空泡化等症状，出现上述三项及以上指征的，该项评价通过。
[0111]
实验结果：
[0112]
由图1可知，肾阳虚对照组大鼠黑质神经元数量丰富、神经元形态结构正常、胞核胞质分界清晰、核仁明显，未见明显炎症。纹状体神经元数量丰富、排列规则。与肾阳虚对照组相比，pd模型组大鼠黑质中可见少量神经元皱缩，细胞染色加深，胞核胞质分界不清，少量神经元胞质空泡化，纹状体中局部可见单个神经元皱缩，细胞染色加深，胞核胞质分界不清，五项指征均出现，评价通过。
[0113]
与pd模型组相比，阳性药对照组神经元数量丰富、排列规则，神经元形态结构正常、胞核胞质分界清晰、核仁明显，验证通过。
[0114]
本实施例中对造模后的三组实验大鼠依次进行外形观察、行为学检测、血清α
‑
syn含量检测、黑质和纹状体组织he染色分析，其中外形观察评价通过，行为学检测、血清α
‑
syn含量检测、黑质和纹状体组织he染色分析三项评价也通过，说明本次实验的4只大鼠均出现了帕金森样表现，本次造模实验成功，不需要进行第五项黑质和纹状体组织th阳性免疫组化检测，本次造模成功率为80％。
[0115]
在另一个实施例中，在步骤四大鼠pd模型的评价时，先对造模后的三组实验大鼠依次进行外形观察，外形观察评价通过后，依次进行行为学检测、血清α
‑
syn含量检测、黑质和纹状体组织he染色分析，其中行为学检测未通过，其余两项通过，则下一步需要对黑质和纹状体组织th阳性免疫组化检测，具体检测过程如下：
[0116]
4.5黑质和纹状体组织th阳性免疫组化检测
[0117]
pd发病部位主要在黑质和纹状体。黑质和纹状体中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，th)是多巴胺能神经元的特异性标志物，中脑黑质、纹状体的th阳性数量可代表多巴胺能神经元数量，从而反映是否出现帕金森病状。
[0118]
检测方法为：待测样本经4％多聚甲醛固定，固定状态良好后，严格按照病理实验检测sop程序进行修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片最后镜检合格的样片。使用eclipse ci
‑
l拍照显微镜选取脑组织的目的区域进行200倍成像，成像时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。成像结果如图2所示，成像完成后使用image
‑
pro plus 6.0分析软件，进行分析处理，并计算出面密度，从而判断各组大鼠的th阳性神经元数量变化。实验结果：
[0119]
表7三组大鼠黑质、纹状体th免疫组化检测结果
[0120][0121]
由表7可知：大鼠黑质、纹状体th免疫组化检测结果显示，与肾阳虚对照组相比，pd模型组的两个组织中的th面密度明显降低，且具有显著性差异p<0.05。与阳性药对照组相比，肾阳虚对照组的pd模型组的两个组织中的th面密度明显降低，且具有显著性差异p<0.05，所以在这两个组织中，pd模型组大鼠的th阳性神经元数量明显减少。
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因此，本实施例制备的模型经过外形观察、行为学检测、血清α
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syn含量检测、黑质和纹状体组织he染色分析、黑质和纹状体组织th阳性免疫组化检测这五项评价后，除外形观察通过外，本次实验还有三项指标评价通过，说明本次造模实验成功。