一种包含天女木兰提取物的组合物和助眠产品的制作方法

1.本发明涉及植物提取物技术领域，尤其涉及一种包含天女木兰提取物的组合物和助眠产品。


背景技术：

2.随着生活压力的加大，人们的睡眠质量已得不到保证，已经严重影响到正常工作和学习。
3.目前，治疗失眠的方法主要有药物治疗和非药物治疗。药物治疗失眠是最有效的方法，但药物治疗还存在着药物依赖性、撤药反应等副作用。
4.非药物治疗主要有芳香疗法等，芳香疗法采用的药用成分主要为植物提取物。采用植物提取物的芳香疗法虽然治疗效果不如药物治疗效果快，但优势在于植物提取物纯天然，安全性高，几乎无药物依赖性、撤药反应等副作用。
5.天女木兰提取物具有抑菌、增白、抗皱等功效，常用于日化领域。目前还未发现天女木兰提取物在助眠领域中的应用。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种包含天女木兰提取物的组合物和助眠产品，该组合物中天女木兰提取物与组合物中其它组分相互配合，可以有效缩短睡眠潜伏期、延长睡眠时间、提高大脑海马区神经元数量、5ht
‑
1a蛋白和gabaar
ɑ
1蛋白的表达量以及gabaar
ɑ
1蛋白的mrna水平，助眠效果显著。
7.其具体技术方案如下：
8.本发明提供了一种组合物，包括：天女木兰提取物、岩兰草精油、乳香精油、真实薰衣草精油、甜马郁兰精油和欧洲赤松精油。
9.本发明提供的组合物具有助眠效果，且效果显著。本发明组合物中天女木兰提取物可以协同岩兰草精油、乳香精油、真实薰衣草精油、甜马郁兰精油和欧洲赤松精油增强助眠效果。
10.所述天女木兰提取物为天女木兰醇提取物、天女木兰水提物和天女木兰水蒸气蒸馏提取物中的一种或两种以上。
11.优选地，所述天女木兰醇提取物、天女木兰水提物和天女木兰水蒸气蒸馏提取物均为天女木兰精油。
12.精油是从植物的花、叶、茎、根或果实中萃取的挥发性芳香油脂性液体，具有渗透性强和生物活性多样等特点，不同种类的精油有不同的功效。精油因其本身的天然特性和分子小、易进入人体达到特定效果的优点。因此，本发明所述天女木兰提取物优选为天女木兰精油。
13.本发明中，所述天女木兰提取物的原料取自天女木兰的叶、根、花、果实和茎中的一种或两种以上，优选取自天女木兰叶。因此，本发明中所述天女木兰精油优选为天女木兰
叶精油。
14.本发明中，天女木兰精油的制备方法优选为：
15.取天女木兰粉碎至10
‑
20目，装在3
‑
5个串联水蒸气蒸馏反应釜中，分散均匀，加上网罩，通入水蒸气，打开冷凝器，反应1
‑
2h，收集提取物，分离油和水，得到天女木兰精油。
16.本发明中，岩兰草精油具有抗抑郁、抗氧化、镇定助眠等作用；
17.乳香精油具有抗氧化、抗抑郁等作用；
18.真实薰衣草精油具有抗菌、抗牛皮藓、抗氧化、抗抑郁、抗焦虑等作用；
19.甜马郁兰精油具有抗氧化、护肝、保护心脏、抗菌和抗真菌、抗肿瘤、抗溃疡、抗胆碱酯酶抑制等作用；
20.欧洲赤松精油具有抗菌、抗氧化等作用。
21.本发明采用戊巴比妥钠诱导睡眠时间试验，通过精油芳香疗法来检测精油对戊巴比妥钠睡眠实验小鼠的睡眠潜伏期和睡眠时间的影响。睡眠潜伏期即腹腔注射戊巴比妥钠后至翻正反射消失的时间，以pcpa模型组、空白对照组的数值为基准，各组别睡眠潜伏期缩短的幅度大小可以反映出精油助眠疗效好坏，睡眠时间也能较直观地表现出精油的疗效好坏。结果显示，相比于岩兰草精油、乳香精油、真实薰衣草精油、甜马郁兰精油和欧洲赤松精油组成的组合物，本发明提供的包含天女木兰提取物的组合物延长可以戊巴比妥钠诱导的睡眠时间，缩短睡眠潜伏时间。
22.进一步地，本发明采用尼氏染色检测实验小鼠神经元的数目。结果显示，相比于岩兰草精油、乳香精油、真实薰衣草精油、甜马郁兰精油和欧洲赤松精油组成的组合物，本发明提供的包含天女木兰提取物的组合物可以提高小鼠海马体区的正常神经元数量。
23.5ht
‑
1a即5
‑
羟色胺1a受体(5
‑
hydroxytryptamine receptor 1a)，该受体在大脑皮质、海马区和下丘脑的神经元中表达，参与睡眠、性行为、焦虑和情绪的调节。5ht
‑
1a受体是一种自受体，其特征是在突触前神经元中表达，限制神经末梢5ht的释放。而pcpa诱导失眠的原理为阻滞突触前5ht
‑
1a自动受体，耗尽5ht。gaba即γ－氨基丁酸(γ
‑
aminobutyric acid)，是中枢神经系统(cns)中主要的抑制性神经递质，在睡眠中起着重要作用，是许多临床治疗失眠药物的重要靶点之一。而相关研究指出，镇静药物是通过gabaa受体的正向调节而增强
‑
氨基丁酸(gaba)反应，即gaba受体，如gabaar
ɑ
1可以一定程度上反映出药物舒眠安眠作用的强弱。
24.进一步地，本发明采用石蜡切片免疫组化试验检测小鼠大脑组织中5ht
‑
1a蛋白和gabaar
ɑ
1蛋白的表达情况。结果显示，相比于岩兰草精油、乳香精油、真实薰衣草精油、甜马郁兰精油和欧洲赤松精油组成的组合物，本发明提供的包含天女木兰提取物的组合物可以显著提高大脑组织中5ht
‑
1a蛋白和gabaar
ɑ
1蛋白的表达。
25.进一步地，本发明采用实时荧光定量pcr试验检测小鼠大脑组织中gabaar
ɑ
1蛋白mrna的表达情况。结果显示，相比于岩兰草精油、乳香精油、真实薰衣草精油、甜马郁兰精油和欧洲赤松精油组成的组合物，本发明提供的包含天女木兰提取物的组合物可以显著提高大脑组织中gabaar
ɑ
1蛋白的mrna水平。
26.本发明中，所述天女木兰提取物、所述岩兰草精油、所述乳香精油、所述真实薰衣草精油、所述甜马郁兰精油和所述欧洲赤松精油的体积比为(4～8)：(1～4)：(2～6)：(2～5)：(1～4)：(2～5)，优选为6：2：4：3：2：3、8:4:6:5:4:5或4:1:2:2:1:2。
27.本发明还提供了一种组合物的制备方法，包括以下步骤：将天女木兰提取物、所述岩兰草精油、所述乳香精油、所述真实薰衣草精油、所述甜马郁兰精油和所述欧洲赤松精油混合而成。
28.本发明还提供了上述组合物或上述制备方法制得的组合物在制备助眠产品中的应用。
29.本发明还提供了一种助眠产品，包括上述组合物或上述制备方法制得的组合物。
30.本发明中，所述助眠产品的给药方式为闻吸、涂抹或香薰，优选为闻吸。
31.本发明中，所述助眠产品中组合物的有效剂量为625～2500μl/天/kg，优选为2500μl/天/kg。
32.本发明中，所述组合物在助眠产品中的质量含量为0.001％～10％。
33.本发明中，所述助眠产品为日化产品。所述日化产品优选为化妆品、护肤品或洗护用品，具体为爽肤水、乳液、精华、面霜、精油、洗发水和护发素、香薰、蜡烛等。
34.从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：
35.本发明提供了一种组合物，该组合物中天女木兰提取物可以协同岩兰草精油、乳香精油、真实薰衣草精油、甜马郁兰精油和欧洲赤松精油，进一步缩短戊巴比妥钠诱导睡眠实验中小鼠的睡眠潜伏期，延长睡眠时间；提高小鼠大脑海马区神经元数量；提高大脑各区域5ht
‑
1a蛋白和gabaar
ɑ
1蛋白和mrna水平。该组合物助眠效果显著。
附图说明
36.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
37.图1为本发明实施例提供的各组小鼠睡眠潜伏期的测试结果图；
38.图2为本发明实施例提供的各组小鼠睡眠时间的测试结果图；
39.图3为本发明实施例提供的各组小鼠海马区切片尼氏染色神经元显微镜图(标尺为50μm)；
40.图4为本发明实施例提供的各组小鼠海马体区正常神经元数目统计图；
41.图5为本发明实施例提供的各组小鼠大脑皮层免疫组化切片中5ht
‑
1a蛋白表达显微镜图(标尺为50μm)；
42.图6为本发明实施例提供的各组小鼠大脑皮层免疫组化切片中5ht
‑
1a蛋白表达柱状图；
43.图7本发明实施例提供的各组小鼠海马区免疫组化切片中gabaar
ɑ
1蛋白表达显微镜图(标尺为50μm)；
44.图8为本发明实施例提供的各组小鼠海马区免疫组化切片中gabaar
ɑ
1蛋白表达柱状图；
45.图9为本发明实施例提供的各组小鼠脑组织中的gabaar
ɑ
1的mrna的相对表达量的柱状图。
具体实施方式
46.为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
47.本发明实施例中，岩兰草精油购自宁波有希贸易有限公司、乳香精油购自雅琪实业(上海)有限公司、真实薰衣草精油购自重庆正元商贸有限公司、甜马郁兰精油和欧洲赤松精油购自雅琪实业(上海)有限公司。
48.实施例1
49.本实施例为天女木兰叶精油的制备
50.本实施例采用专利cn 105708760 a天女木兰提取液作为抑菌剂的用途中实施例1的制备方法制备天女木兰叶精油，具体制备步骤如下：取天女木兰叶粉碎至20目，装在4个串联水蒸气蒸馏反应釜中，分散均匀，加上网罩，通入水蒸气，打开冷凝器，反应1h，收集提取物，分离油和水，得到天女木兰叶提取精油。
51.实施例2
52.本实施例采用氯苯丙氨酸(pcpa)建立小鼠失眠模型
[0053]5‑
6周龄雄性km小鼠(30
±
5g)适应性饲养一周后开始造模。对氯苯丙氨酸pcpa混悬液现配现用，600mg pcpa粉末溶于20ml含1％tween80的生理盐水中，配制浓度为30mg/ml。除空白对照组外，其余组按小鼠体重0.1ml/10g用量进行腹腔注射，空白对照组给予腹腔注射同体积的含1％的tween的生理盐水进行腹腔注射，连续注射2日。在最后一次腹腔注pcpa结束后26
‑
30h，小鼠出现行为学变化(白天活动不停，兴奋性增加，易激怒，昼夜节律消失，饮水量、进食量均增加，睡眠时间明显减少)，表明失眠模型造模成功。
[0054]
实施例3
[0055]
本实施例为精油组合物的制备
[0056]
将实施例1制得的天女木兰叶精油、岩兰草精油、乳香精油、真实薰衣草精油、甜马郁兰精油和欧洲赤松精油分别以8:4:6:5:4:5、6:2:4:3:2:3和4:1:2:2:1:2的质量比进行混合，得到精油组合物，分别记为测试组合物1、测试组合物2和测试组合物3。
[0057]
将岩兰草精油、乳香精油、真实薰衣草精油、甜马郁兰精油和欧洲赤松精油以2:4:3:2:3的质量比进行混合，得到精油组合物，记为对照组合物。
[0058]
实施例4
[0059]
本实施例对包含天女木兰叶精油的组合物的助眠效果进行验证
[0060]
1、采用戊巴比妥钠睡眠时间试验检测精油组合物对睡眠小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间的影响
[0061]
测试实施例3精油组合物对巴比妥类药物诱导睡眠时长的影响，催眠药物一般能延长戊巴比妥钠诱导的睡眠时间。记录入睡时间和睡眠时间，比较各组精油嗅闻组与pcpa模型对照组之间的差异，检验差异显著性，睡眠时间延长，*p<0.05，表示该组方精油具有显著的催眠作用，**p<0.01表示该组方精油具有极显著的催眠作用。
[0062]
1.1空白组小鼠未建立pcpa失眠模型，将pcpa失眠小鼠随机分为4组，实验组动物分别嗅闻相同浓度的实施例3制得的测试组合物，记为实验组1、实验组2和实验组3，小鼠吸
入体积为2500μl/天/kg；精油对照组嗅闻实施例3制得的对照组合物，小鼠吸入体积为2500μl/天/kg；空白组和pcpa模型组小鼠吸入含1％tween80的生理盐水，体积均为2500μl/kg/天。每组中每只小鼠每天嗅闻30分钟。地西泮阳性对照组小鼠在注射pcpa前30min时注射地西泮溶液，使用剂量为2mg/kg；
[0063]
1.2嗅闻30min结束后注射，用1ml规格的一次性无菌注射器，按小鼠体重0.1ml/10g，给所有组别小鼠腹腔注射戊巴比妥钠。
[0064]
1.3小鼠腹腔注射操作：事先以注射针筒吸取欲注射的剂量。抓取小鼠，头部朝下腹部朝上，注射针头以30度角插入腹中线右侧。试着回抽针筒，如有血液或液体回流，表示不适当，需重新插入。缓缓将药剂推入。
[0065]
1.4记录注射时刻(t.r)。注射后小鼠单独放入一个饲养箱内，指标评价：翻正反射消失标准：是指小鼠背部向下保持30s以上，并且1min内不再出现翻正反射为止。记录翻正反射消失的持续时间(翻正反射消失时间至翻正反射重复出现时间)和翻正反射消失的潜伏期。如果怀疑翻正反射是否真正恢复，于第一次翻正后立即重新背位放置，如在1min之内又自动翻过来则前一次的时间即为恢复时间，否则以第二次翻过来的时间为准。
[0066]
1.4.1入睡潜伏期：为腹腔注射戊巴比妥钠后至翻正反射消失的时间。记录30min内每只小鼠翻正反射消失的时刻，表示小鼠入睡(t.s)。实验结果如图1和表1所示。
[0067]
1.4.2睡眠时间：即翻正反射消失至觉醒的时间。记录每只小鼠翻正反射恢复的时刻，表示小鼠睡醒(t.w)。计算出每只小鼠睡眠潜伏期(sleep latency)和睡眠时间(total sleep time)，sleep latency＝t.s
‑
t.r，total sleep time＝t.w
‑
t.s。实验结果如图2和表2所示。
[0068]
从表1可以看出，实验组1～3提供的含天女木兰叶精油的精油组合物均具有显著的缩短小鼠睡眠潜伏期，其中实验组2效果最佳，因此，本发明采用实验组2与其它各组进行比对，并进行后续实验。
[0069]
图1为本实施例提供的各组小鼠睡眠潜伏期的测试结果图(与模型组相比，*p<0.05，表示显著，**p<0.01表示极显著)。从图1可以看出，相比于pcpa模型组，实验组、空白组、对照组和地西泮组小鼠睡眠潜伏期均有所缩短，其中地西泮组、实验组和空白组显著减小。相比于对照组(岩兰草精油 乳香精油 真实薰衣草精油 甜马郁兰精油 欧洲赤松精油),实验组(天女木兰提取物 岩兰草精油 乳香精油 真实薰衣草精油 甜马郁兰精油 欧洲赤松精油)小鼠的睡眠潜伏期更短。
[0070]
从表2可以看出，实验组1～3提供的含天女木兰叶精油的精油组合物均具有显著的延长小鼠睡眠时间，其中实验组2效果最佳，因此，本发明采用实验组2与其它各组进行比对，并进行后续实验。
[0071]
图2为本发明实施例提供的各组小鼠睡眠时间的测试结果图(与模型组相比，*p<0.05，表示显著，**p<0.01表示极显著)。从图2可以看出，相比于pcpa模型组，实验组2、对照组和地西泮组小鼠的睡眠时间都有了不同程度的延长；对照组(岩兰草精油 乳香精油 真实薰衣草精油 甜马郁兰精油 欧洲赤松精油)和实验组2(天女木兰提取物 岩兰草精油 乳香精油 真实薰衣草精油 甜马郁兰精油 欧洲赤松精油)对于小鼠的睡眠时间延长程度差别不大。
[0072]
表1
[0073] 实验组1实验组2实验组3睡眠潜伏期233.83
±
10.92200.75
±
8.98230.68
±
11.23
[0074]
表2
[0075] 实验组1实验组2实验组3睡眠时间1288.12
±
12.231325.75
±
9.041302.23
±
10.12
[0076]
2、尼氏染色检测各组小鼠神经元数量
[0077]
2.1石蜡切片烤片：将恒温干燥箱的温度设置为60℃，烤片15min；
[0078]
2.2二甲苯脱蜡：组织切片依次放入二甲苯i和二甲苯ii中，各20min；
[0079]
2.3梯度酒精至水：按照从高到低的浓度，将切片依次放入100％乙醇i和100％乙醇ii，各10min；再放入95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇和70％乙醇，各5min；
[0080]
2.4自来水清洗1次(2min/次)；双蒸水清洗2次(2min/次)；
[0081]
2.5甲苯胺蓝染液：10min；
[0082]
2.6染色结束后，进行水洗终止染色：自来水清洗1次(2min/次)；双蒸水清洗2次(2min/次)；
[0083]
2.7酒精脱水：依次放入70％乙醇、95％乙醇和100％乙醇，各5min；
[0084]
2.8二甲苯透明：15min；
[0085]
2.9显微镜镜检，图像采集分析。
[0086]
图3为本实施例各组小鼠脑组织海马区切片尼氏染色神经元显微镜图；
[0087]
图4为本实施例各组小鼠海马区正常神经元数目统计图。从图3～4可以看出，相比于pcpa模型组，实验组2和对照组小鼠的海马区神经元数目不同程度增加；相比于对照组，实验组2小鼠的海马体区的神经元数目明显增加。实验组2(天女木兰提取物 岩兰草精油 乳香精油 真实薰衣草精油 甜马郁兰精油 欧洲赤松精油)效果更优于对照组(岩兰草精油 乳香精油 真实薰衣草精油 甜马郁兰精油 欧洲赤松精油)。
[0088]
3、石蜡切片免疫组化检测各组小鼠大脑组织中5ht
‑
1a蛋白和gabaar
ɑ
1蛋白的表达情况
[0089]
3.1石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ15min
‑
二甲苯ⅱ15min
‑
二甲苯iii 15min
‑
无水乙醇ⅰ5min
‑
无水乙醇ⅱ5min
‑
85％酒精5min
‑
75％酒精5min
‑
蒸馏水洗。
[0090]
3.2抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(ph6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于pbs(ph 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
[0091]
3.3阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
[0092]
3.4血清封闭:在组化圈内滴加3％bsa均匀覆盖组织，室温封闭30min。(一抗是ft羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用bsa封闭)
[0093]
3.5加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加pbs按一定比例配好的一抗(5ht1areceptor antibody，af5453,稀释比ihc 1:50
‑
1:200；anti
‑
gabaa receptor alpha 1rabbit pab，gb11716,稀释比ihc 1:600
‑
1:1500)，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
[0094]
3.6加二抗：玻片置于pbs(ph 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片
稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(hrp标记的山羊抗兔igg，gb23303,稀释比ihc 1:200
‑
1:500)覆盖组织，室温孵育50min。
[0095]
3.7dab显色：玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
[0096]
3.8复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。
[0097]
3.9脱水封片：将切片依次放入75％酒精5min
‑
85％酒精5min
‑‑
无水乙醇15min
‑
无水乙醇ⅱ5min
‑
二甲苯ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
[0098]
3.10显微镜镜检，图像采集分析。
[0099]
图5为本实施例各组小鼠大脑组织大脑皮层中5ht
‑
1a蛋白表达显微镜图。图6为本实施例各组小鼠大脑组织大脑皮层中5ht
‑
1a蛋白表达柱状图。从图5和图6可知，相比于空白组小鼠，pcpa模型组小鼠大脑皮层区中的5ht
‑
1a蛋白表达明显降低；相比于pcpa模型组，实验组2小鼠大脑皮层的5ht
‑
1a蛋白表达量显著提高，效果优于对照组及空白组。图7为本实施例各组小鼠大脑组织海马区中gabaar
ɑ
1蛋白表达显微镜图。图8为本实施例各组小鼠大脑组织海马区中gabaar
ɑ
1蛋白表达柱状图(与模型组相比，*p<0.05，表示显著，**p<0.01表示极显著)。从图7和图8可以看出，相比于空白组，pcpa模型组小鼠大脑组织海马区的gabaar
ɑ
1蛋白表达显著降低；实验组2小鼠海马体区的gabaar
ɑ
1蛋白表达量略高于对照组，效果更优。
[0100]
4、荧光定量pcr检测各组小鼠表达gabaar
ɑ
1的基因mrna的表达量
[0101]
3.1总rna抽提(枪头和离心管均经过湿热灭菌，无rna酶)
[0102]
3.1.1取匀浆管，加入1ml的trizol reagent，置冰上预冷。
[0103]
3.1.2取100mg组织，加入到匀浆管中。
[0104]
3.1.3匀浆仪充分研磨直至无可见组织块。
[0105]
3.1.4 12000rpm离心10min取上清。
[0106]
3.1.5加入250μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。
[0107]
3.1.6 4℃下12000rpm离心10min。
[0108]
3.1.7将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。
[0109]
3.1.8
‑
20℃放置15min。
[0110]
3.1.9 4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为rna。
[0111]
3.1.10吸除液体，加入75％乙醇1.5ml洗涤沉淀。
[0112]
3.1.11 4℃下12000rpm离心5min。
[0113]
3.1.12将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。
[0114]
3.1.13加入15μl无rna酶的水溶解rna。
[0115]
3.1.14 55℃孵育5min。
[0116]
3.1.15使用nanodrop 2000检测rna浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl待测rna溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。
[0117]
3.1.16将浓度过高的rna进行适当比例的稀释，使其终浓度为200ng/μl.
[0118]
3.2反转录(枪头和pcr均经过湿热灭菌，无rna酶)
[0119]
3.2.1取一pcr管，加入含2μg rna的溶液。
[0120]
3.2.2加入1μl oligo(dt)18。
[0121]
3.2.3用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。
[0122]
3.2.4于pcr仪上65℃保温5min，迅速置冰上冷却。
[0123]
3.2.5依次加入4μl 5
×
reaction buffer，2μl 10mm dntp mix，1μl ribolock rnaase抑制剂(20u/μl))和1μl revertai m
‑
mulv逆转录酶(200u/μl)，用枪抽吸混匀。
[0124]
3.2.6于pcr仪上42℃保温60min，结束后70℃保温5min灭活反转录酶。
[0125]
3.3定量pcr
[0126]
3.3.1取0.2ml pcr管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。
[0127][0128]
3.3.2 pcr扩增
[0129]
预变性
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
95℃，10min
[0130]
循环(40次)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
95℃，15s
→
60℃，60s
[0131]
熔解曲线
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60℃
→
95℃，每15s升温0.3℃
[0132]
3.4结果处理
[0133]
δδct法：
[0134]
a＝ct(目的基因，待测样本)
‑
ct(内标基因，待测样本)
[0135]
b＝ct(目的基因，对照样本)
‑
ct(内标基因，对照样本)
[0136]
k＝a
‑
b
[0137]
表达倍数＝2
‑
k
[0138]
图9为本发明实施例各组小鼠脑组织中gabaar
ɑ
1mrna相对表达量的柱状图(与模型组相比，*p<0.05，表示显著，**p<0.01表示极显著)。从图9可以看出，pcpa模型组的gabaar
ɑ
1mrna相对表达量均低于其他组别，且实验组2(天女木兰提取物 岩兰草精油 乳香精油 真实薰衣草精油 甜马郁兰精油 欧洲赤松精油)的gabaar
ɑ
1mrna相对表达量显著优于pcpa模型组及对照组(岩兰草精油 乳香精油 真实薰衣草精油 甜马郁兰精油 欧洲赤松精油)。
[0139]
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。