靶向CD22的嵌合抗原受体及其制法和应用的制作方法

id no:2所示。(注：car-t22.13)
15.在另一优选例中，所述v
l
的氨基酸序列如seq id no:3所示，v
h
的氨基酸序列如seq id no:4所示。(注：car-t22.14)
16.在另一优选例中，所述连接肽的氨基酸序列如seq id no:16所示。
17.在另一优选例中，所述抗原结合结构域结合于cd22，较佳地为人cd22。
18.在另一优选例中，所述抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区来源于人源化或来自于人的抗体。
19.在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的结构如下式iii所示：
20.l-v
l-v
h-h-tm-c-cd3ζ
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(iii)
21.其中，
22.l为任选的引导序列(leader sequence，即信号肽signal peptide)；
23.h为绞链区；
24.tm为跨膜结构域；
25.c为共刺激信号分子；
26.cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列；
27.v
h
、v
l
和
“-”
分别如上所述。
28.在另一优选例中，所述的l为选自下组的蛋白的信号肽：cd8、cd28、gm-csf、cd4、cd137、或其组合。
29.在另一优选例中，所述的l为cd8来源的信号肽。
30.在另一优选例中，l的氨基酸序列如seq id no:9所示。
31.在另一优选例中，所述的h为选自下组的蛋白的铰链区：cd8、cd28、cd137、或其组合。
32.在另一优选例中，所述的h为cd8α来源的铰链区。
33.在另一优选例中，h的氨基酸序列如seq id no:10所示。
34.在另一优选例中，所述的tm为选自下组的蛋白的跨膜区：cd28、cd3 epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、或其组合。
35.在另一优选例中，所述的tm为cd8α来源的跨膜区。
36.在另一优选例中，tm的序列如seq id no:11所示。
37.在另一优选例中，所述的c为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2、或其组合。
38.在另一优选例中，所述的c为4-1bb或cd28来源的共刺激信号分子，较佳地为4-1bb来源的共刺激信号分子。
39.在另一优选例中，c的氨基酸序列如seq id no:12所示。
40.在另一优选例中，cd3ζ的氨基酸序列如seq id no:13所示。
41.在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no.14或15所示。
42.在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体(car)。
43.在另一优选例中，所述核酸分子为分离的。
44.在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。
45.在另一优选例中，所述的载体选自下组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(aav)、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
46.在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体。
47.在另一优选例中，所述载体为病毒颗粒的形式。
48.在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
49.在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。
50.在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子或表达本发明第一方面所述的car。
51.在另一优选例中，所述宿主细胞为分离的细胞。
52.在另一优选例中，所述宿主细胞为基因工程化的细胞。
53.在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
54.在另一优选例中，所述宿主细胞为t细胞或nk细胞，较佳地为t细胞。
55.在另一优选例中，所述宿主细胞为car-t细胞或car-nk细胞，较佳地为car-t细胞。
56.在本发明的第五方面，提供了一种制备工程化的免疫细胞的方法，所述的免疫细胞表达本发明第一方面所述的car，所述方法包括以下步骤：
57.(a)提供待改造的免疫细胞；和
58.(b)将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体转导入所述免疫细胞内，从而获得所述工程化的免疫细胞。
59.在另一优选例中，所述工程化的免疫细胞为car-t细胞或car-nk细胞。
60.在另一优选例中，在步骤(a)中，还包括在含有0.1-10％(较佳地0.5％-5％，更佳地0.8％-2％)人血白蛋白的gt-551无血清培养基中培养所述待改造的免疫细胞，其中人血白蛋白的含量以培养基总重量计。
61.在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。
62.在本发明的第六方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
63.在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。
64.在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。
65.在另一优选例中，所述制剂中所述car-t细胞的浓度为1
×
10
3-1
×
108个细胞/ml，较佳地1
×
10
4-1
×
107个细胞/ml。
66.在本发明的第七方面，提供了一种本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的宿主细
胞、或本发明第六方面所述的制剂的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
67.在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。
68.在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、或其组合。
69.在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。
70.在另一优选例中，所述的肿瘤为cd22阳性肿瘤，较佳地为cd22阳性b细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、或浆细胞白血病。
71.在本发明的第八方面，提供了一种用于制备本发明第四方面所述的宿主细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第二方面所述的核酸分子、或本发明第三方面所述的载体。
72.在本发明的第九方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、或本发明第六方面所述的制剂。
73.在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。
74.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
75.图1显示了靶向cd22嵌合型抗原受体结构示意图。car的结构包括前导序列、抗原识别序列、连接区、跨膜区、共刺激因子信号区和cd3zeta信号传导区。
76.图2显示了靶向cd22嵌合型抗原受体工程化t细胞转染效率的检测。经过重组人cd22蛋白fc段染色方法检测培养至第6天时在流式细胞仪上分析cart-cd22s细胞中car基因编码蛋白在t细胞膜表面的表达水平。
77.图3显示了t细胞膜表面cd137的表达水平(图3a)和培养上清中ifnγ的分泌水平(图3b)。具体地，依次取1
×
105个培养到第6天的cart-cd22s细胞，分别与cd22阳性的k562-cd22 c7，k562-cd22 a4,h929-cd22 e12，raji肿瘤细胞系，以及cd22阴性的k562肿瘤细胞系或不添加肿瘤细胞，在200μl gt-551培养基中按照1:1比例培养18h后分别检测t细胞膜表面cd137的表达水平和培养上清中ifn-γ的分泌水平。
78.图4显示了cart-cd22s诱导肿瘤细胞毒性的检测。具体地，分别取1
×
104个cd22阴性(k562)或cd22阳性的(k562-cd22 a4,h929-cd22 e12,raji)肿瘤细胞系，在100μl gt-551培养基中按照图示比例与相应的cart细胞分别共培养8h后，吸取50μl培养基上清，加入50μl显色底物混合物，通过30分钟偶联的酶反应，检测肿瘤细胞被car-t细胞识别杀伤后，裂解时释放出的乳酸脱氢酶(ldh)的量，生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。此图显示了cart-cd22s诱导肿瘤细胞毒性的百分比。
79.图5显示了cart-cd22s诱导肿瘤细胞晚期凋亡过程中cd107a释放水平的检测。具体地，取2
×
105个cd22阴性(k562)或cd22阳性(k562-cd22 a4,h929-cd22 e12,raji)肿瘤细胞系和1
×
105个car-t细胞，在200μl gt-551培养基中按照体积比1:1比例培养5h后，检测car-t细胞被cd22阳性的肿瘤细胞激活后t细胞脱颗粒相关膜蛋白cd107a的表达水平变化。
80.图6为cart-cd22s对比例筛选结果图。图6a显示靶向cd22嵌合型抗原受体工程化t细胞转染效率的检测。采用protein l染色方法鉴定培养到第6天的cart-cd22s细胞中car基因编码蛋白在t细胞膜表面的表达水平。依次取1*105培养到第6天的cart-cd22s细胞，分别与cd22阳性的k562-cd22 肿瘤细胞系，天然表达cd22的肿瘤细胞系raji，以及cd22阴性的k562肿瘤细胞系或不添加肿瘤细胞，在200μl gt-551培养基中按照1:1比例培养18h后分别检测t细胞膜表面cd137的表达水平(图6b)和培养上清中ifnγ的分泌水平(图6c)。
具体实施方式
81.本发明人经过广泛而深入地研究，进行了大量的筛选，首次获得了能够有效靶向cd22抗原的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的细胞外抗原结合结构域包括seq id no:1所示的抗体重链可变区和seq id no:2所示的抗体轻链可变区；或者seq id no:3所示的抗体重链可变区和seq id no:4所示的抗体轻链可变区。本发明还制备了含有所述嵌合抗原受体的car-t细胞。实验结果表明，本发明提供的嵌合抗原受体及其car-t细胞显示出了极高的对肿瘤细胞的杀伤能力，cd107a释放水平表达增加，并且特异性好，可以很好地诱导cd22阳性肿瘤细胞凋亡。在此基础上，完成了本发明。
82.具体地，本发明筛选的抗体包括car-t22.3，car-t22.5，car-t22.7，car-t22.8，car-t22.9，car-t22.10，car-t22.11，car-t22.12，car-t22.13，car-t22.14，car-t22.15，car-t22.16，car-t22.17。其中car-t22.3和car-t22.5是已发表的car-t序列，作为筛选的阳性对照。筛选的结果显示car-t22.13，car-t22.14和car-t22.5所得到的car-t体外功能相近，进一步将这3个car-t进行了实验研究，完成了这些嵌合型抗原受体在原代t细胞中的表达水平、体外活化能力及肿瘤细胞杀伤效能等层面的分析与鉴定。研究表明，本发明的嵌合抗原受体靶向cd22阳性细胞，可以用于治疗cd22阳性b细胞白血病，包括一些抗cd19car-t治疗后急性b细胞白血病复发的cd19阴性cd22阳性的患者。
83.具体地，本发明鉴定了不同car结构在病毒感染后细胞膜表面表达时间和表达强度的相关性，进而鉴定出不同car结构蛋白表达难易程度的差异，这一发现提示不同car结构在相同感染条件下car蛋白在膜表面的表达水平和cart体内活性持久性存在差异。经过大量的筛选，获得了本发明结构的car(car-t22.13，car-t22.14)。结果表明，本发明中的car结构编码蛋白都可以充分表达和膜定位。并且诱导肿瘤细胞晚期凋亡能力强，有更好的cd137活化水平和cd107a释放水平，杀伤效果更好。
84.本发明还对靶向cd22抗原car结构修饰t细胞的制备工艺作了改进，主要是选用补加1％人血白蛋白的gt-551无血清培养基在体外培养淋巴细胞。
85.术语
86.为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本技术中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了
其它定义。
87.术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
88.术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
89.术语“抗体”(ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(h)链和两条轻(l)链，或其抗原结合部分。每条h链包含重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域ch1、ch2和ch3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域cl。vh和vl区可以进一步细分为称为互补决定区(cdr)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(fr)的区域。每个vh和vl包含三个cdr和四个fr，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
90.cd22
91.cd22为i型跨膜蛋白，是唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素家族的重要成员，具有调控b细胞激活作用的细胞表面粘附分子，有助于b细胞对抗原反应敏感性的控制，普遍存在于正常b细胞和b细胞恶性肿瘤中，又被称为bl-cam，b3，leu-14，lyb-8等。人类cd22基因位于19号染色体长臂(19q13.1)，有至少15个外显子，外显子4-10编码单链ig域，外显子11-15编码跨膜域和胞内域。cd22有cd22α和cd22β两种亚型，胞外域分别有5个和7igg域。
92.cd22最初表达于晚期前b细胞的胞质内，后转移至细胞表面，在前b细胞及未成熟b细胞有少量表达，在分化成熟的免疫球蛋白(immunoglobulin，ig)m 和igd b细胞高表达。约有60-80％的b细胞恶性肿瘤表达cd22，cd22相对特异地表达于b细胞表面，且在靶向cd19 cart治疗失败复发时仍有较高水平的表达。大量试验证明靶向cd22的单克隆抗体治疗白血病有很大的效果。因此已成为调节b细胞免疫及b细胞恶性肿瘤免疫治疗的靶点。
93.尽管抗cd19 car-t的疗效突出，但对于部分b细胞cd19抗原表达缺失的白血病患者却无效；部分患者因为抗cd19 car-t治疗后，cd19抗原表达降低甚至丢失，导致治疗效果不佳，容易复发，而仍有cd22的持续表达。cd22表达于大多数b细胞性急性淋巴细胞白血病患者,包括一些抗cd19 car-t治疗后cd19阴性的患者中。fry等开展了一项针对cd22抗原car-t治疗的临床试验,在接受≥1
×
106抗cd22 car-t细胞治疗后,73％(11/15)的患者获得了完全缓解。ramakrishna等认为,通过提高肿瘤细胞cd22抗原表达量,可提高抗cd22 car-t治疗cd22低表达的b细胞性白血病/淋巴瘤的疗效,但其进一步的疗效,有待动物实验及临床试验的验证。
94.近期，免疫疗法，特别是过继性t细胞疗法，在治疗针对血液系统的恶性肿瘤临床试验中显示了强大的疗效和光明前景。t细胞可以被基因修饰来表达嵌合抗原受体(car)，它包括抗原识别部分和t细胞激活区。car利用单克隆抗体的抗原结合性质能重定向t细胞的特异性和反应性并且以一种非mhc限制的方式靶向靶标。这种非mhc限制抗原识别使表达car的t细胞不需要抗原加工就能识别抗原，因此避免了肿瘤逃逸的一种主要机制。除此之外，car也不会和内源性tcr的α链，β链产生二聚体。
95.嵌合抗原受体(car)
96.本发明的嵌合抗原受体(car)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
97.在car的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在car的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”或“连接肽”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
98.在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的car的胞外结构域包括靶向cd22的抗原结合结构域。本发明的car当在t细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1bb信号传导结构域、和cd3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
99.如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的fab片段，fab’片段，f(ab’)2片段，或单一fv片段。fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，fv抗体还包含vh和vl结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scfv(single-chain variable fragment)。scfv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scfv包含特异性识别cd22的抗体。
100.对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，car可被设计以包括融合至car的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与car中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
101.本发明的car中的胞内结构域包括4-1bb的信号传导结构域和cd3ζ的信号传导结构域。
102.优选的，本发明的car的结构包括前导序列、抗原识别序列(抗原结合结构域)、连接区、跨膜区、共刺激因子信号区和cd3zeta信号传导区(ζ链部分)，连接顺序如下：
103.[cd8 ls]-[vl-linker-vh]-[hinge-cd8tm]-[4-1bb]-[cd3zeta]
[0104]
具体地，在本发明中选用序列如下：
[0105]
(1)前导序列为cd8抗原的前导序列：
[0106]
malpvtalllplalllhaarp(seq id no:9)
[0107]
(2)car22.5抗原识别序列：
[0108]
vh
[0109]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafsiydmswvrqvpgkglewvsyissgggttyypdtvkgrf
tisrdnsrntldlqmnslrvedtavyycarhsgygssygvlfaywgqgtlvtvss(seq id no:5)
[0110]
vl
[0111]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwlqqkpgkapklliyytsilhsgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkleik(seq id no:6)
[0112]
(3)car22.3抗原识别序列：
[0113]
vh
[0114]
lqqsgpglvkpsqtlsltcaisgdsvssnsaawnwirqspsrglewlgrtyyrskwyndyavsvksritinpdtsknqfslqlnsvtpedtavyycarevtgdledafdiwgqgtmvtvs(seq id no:7)
[0115]
vl
[0116]
iqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqtiwsylnwyqqrpgkapnlliyaasslqsgvpsrfsgrgsgtdftltisslqaedfatyycqqsysipqtfgqgtklei(seq id no:8)
[0117]
(4)car-t 22.13抗原识别序列：
[0118]
vh
[0119]
evqlvqsgaevkkpgeslkisckgsgynftsywigwvrqmpgkglewmgiiypgdsdtryspsfqgqvtisadksistaylqwsslkasdtamyycatptyyfgsvafdiwgqgtmvtvss(seq id no:1)
[0120]
vl
[0121]
eivltqspdfqsvtpkekvtitcrasqsigsslhwyqqkpdqspkllikyasqsfsgvpsrfsgsgsgtdftltinsleaedaaayychqssslpytfgqgtkleik(seq id no:2)
[0122]
(5)car-t 22.14抗原识别序列：
[0123]
vh
[0124]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckpsgdtfsnyaiswvrqapgqglewmgriipilgmaiyapkfqgrvtitadkstntafmdltslyfedtavyycaraptywgskdyfdywgqgtlvtvss(seq id no:3)
[0125]
vl
[0126]
aiqltqspsslsasvgdrvtitcrasqdissglawyqqkpgtapklliydasslesgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpddfatyycqqfnsfpytfgqgtkleik(seq id no:4)
[0127]
上述抗原识别序列中，vh与vl之间的连接序列如seq id no:16所示，序列为：ggggsggggsggggs。
[0128]
(6)铰链区和连接区的序列：
[0129]
fvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd(seq id no:10)
[0130]
(7)跨膜区为cd8(cd8tm)抗原的跨膜区序列：
[0131]
iyiwaplagtcgvlllslvitlyc(seq id no:11)
[0132]
(8)共刺激因子信号区来自4-1bb的胞内信号传导基序的序列：
[0133]
krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seq id no:12)
[0134]
(9)cd3 zeta的信号传导区来自tcr复合体中cd3zeta的以酪氨酸为中心的免疫受体激活基序(immunorecceptor tyrosine-based activation motif,itam)的序列：
[0135]
rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no:13)
[0136]
优选的，本发明的car为car-t 22.13或car-t 22.14，car结构中的v
l
和v
h
来自专利号us9499632b2的美国专利，其中16f7为22.13，4g6为22.14。
[0137]
car-t 22.13的氨基酸序列如下：
[0138]
malpvtalllplalllhaarpevqlvqsgaevkkpgeslkisckgsgynftsywigwvrqmpgkglewmgiiypgdsdtryspsfqgqvtisadksistaylqwsslkasdtamyycatptyyfgsvafdiwgqgtmvtvssggggsggggsggggseivltqspdfqsvtpkekvtitcrasqsigsslhwyqqkpdqspkllikyasqsfsgvpsrfsgsgsgtdftltinsleaedaaayychqssslpytfgqgtkleikfvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no:14)
[0139]
car-t 22.14的氨基酸序列如下：
[0140]
malpvtalllplalllhaarpqvqlvqsgaevkkpgssvkvsckpsgdtfsnyaiswvrqapgqglewmgriipilgmaiyapkfqgrvtitadkstntafmdltslyfedtavyycaraptywgskdyfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggsaiqltqspsslsasvgdrvtitcrasqdissglawyqqkpgtapklliydasslesgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpddfatyycqqfnsfpytfgqgtkleikfvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no:15)
[0141]
嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)
[0142]
如本文所用，术语“car-t细胞”、“car-t”、“cart”、“本发明car-t细胞”均指本发明第四方面所述的car-t细胞。
[0143]
本发明涉及靶向cd22嵌合抗原受体结构的构建、靶向cd22嵌合抗原受体工程化t细胞的制备方法及其活性鉴定。
[0144]
本发明中，以cd22的序列为基础构建了靶向cd22抗原的多种类型的嵌合型抗原受体结构，并完成了这些嵌合型抗原受体在原代t细胞中的表达水平、体外活化能力及肿瘤细胞杀伤效能等层面的分析与鉴定。本发明发现了以car22.13,22.14为基础构建的不同类型嵌合型抗原受体修饰的t细胞在体外杀伤和体内清除携带cd22抗原的恶性肿瘤的能力差异，为临床应用car-t治疗cd22阳性的白血病和淋巴瘤提供了新的有效方法和制剂。
[0145]
载体
[0146]
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
[0147]
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
[0148]
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
[0149]
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。
基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
[0150]
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
[0151]
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如sambrook等(2001,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，wo01/96584；wo01/29058；和美国专利号6,326,193)。
[0152]
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
[0153]
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
[0154]
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(epstein-barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0155]
为了评估car多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段dna上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
[0156]
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其
编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在dna已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，ui-tei等，2000febs letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
[0157]
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
[0158]
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如sambrook等(2001,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
[0159]
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
[0160]
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
[0161]
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/dna或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
[0162]
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
[0163]
制剂
[0164]
本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的car-t细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述car-t细胞的浓度为1
×
10
3-1
×
108个细胞/ml，更优地1
×
10
4-1
×
107个细胞/ml。
[0165]
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水
等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
[0166]
治疗性应用
[0167]
本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(lv)转导的细胞(例如，t细胞)进行的治疗性应用。转导的t细胞可靶向肿瘤细胞的标志物cd22，协同激活t细胞，引起t细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。
[0168]
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的t细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的car-t细胞。
[0169]
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体t细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生car-t细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被t细胞以无mhc限制方式识别。此外，一种car-t就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，car-t细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
[0170]
在一个实施方式中，本发明的car-t细胞可经历稳固的体内t细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，car介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中car-修饰t细胞诱导对car中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，表达cd22的肿瘤细胞引起抗cd22的car-t细胞的特异性免疫应答。
[0171]
尽管本文公开的数据具体公开了包括抗cd22 scfv、铰链和跨膜区、和4-1bb和cd3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
[0172]
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的car治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
[0173]
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
[0174]
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。
[0175]
本发明的car修饰t细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
[0176]
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码car的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
[0177]
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的car的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。car-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和car-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
[0178]
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
[0179]
本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的car-修饰的t细胞。
[0180]
本发明的car-修饰的t细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如il-2、il-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
[0181]
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
[0182]
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的t细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。t细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如rosenberg等，neweng.j.of med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
[0183]
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的t细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的t细胞组合物优选通过i.v.注射施用。t细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
[0184]
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将t细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ara-c)或对ms患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对pml患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的t细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和fk506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发
明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(xrt)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
[0185]
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。病人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1
×
106个至1
×
10
10
个本发明经修饰的t细胞(如，cart-cd22细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
[0186]
本发明的主要优点包括：
[0187]
(a)本发明的嵌合抗原受体，其细胞外抗原结合结构域为特定的抗cd22 scfv，该特定的抗cd22 scfv结合特定的绞链区和胞内结构域形成的car显示出了极大的对肿瘤细胞的杀伤能力，而且特异性好，对t细胞本身的细胞毒性较小，副作用低。
[0188]
(b)本发明提供的嵌合抗原受体可在携带car基因的慢病毒感染t细胞后实现car蛋白的稳定表达和膜定位。
[0189]
(c)本发明的car修饰的t细胞在体内存活时间较长，且抗肿瘤效力较强；本发明所用的抗原结合结构域为人源化或来自于人的抗体，较小可能产生种特异的免疫排斥反应。
[0190]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0191]
实施例1
[0192]
慢病毒表达载体的构建
[0193]
委托上海博益生物科技有限公司进行全长dna合成和克隆，实现编码质粒的构建。选择pwpt慢病毒载体作为克隆载体，克隆位点为bamh i和mlui位点。具体序列如前所述。
[0194]
实施例2
[0195]
car-t细胞的制备
[0196]
(1)取健康人静脉血，通过密度梯度离心方法，分离获得单个核细胞(pbmcs)。
[0197]
(2)在第0天，将pbmcs接种于经过终浓度为5μg/ml cd3单克隆抗体(okt3)及终浓度为5μg/ml的retronectin(购自takara公司)预包被的细胞培养瓶中，培养基为含1％人血白蛋白的gt-551细胞培养基，培养基里添加终浓度为1000u/ml的重组人白介素2(il-2)，在37℃，饱和湿度为5％co2培养箱中培养。
[0198]
(3)在第1天，缓慢吸取并弃去培养pbmcs的上清液，并加入新的含1％人血白蛋白的gt-551细胞培养基，培养基里添加终浓度为1000u/ml的重组人白介素2(il-2)，在37℃，饱和湿度为5％co2培养箱继续培养。
[0199]
(4)在第3天，加入新鲜培养液，浓缩纯化的car-cd22s慢病毒液，protamine sulfate(12μg/ml)，以及终浓度为1000u/ml il-2。置于37℃，5％co2培养箱中感染12小时后，弃培养液，加入新鲜的培养基，于37℃，5％co2培养箱继续进行培养。
[0200]
(5)从第6天开始，取cart-cd22s细胞进行相应的体外活性检测。
[0201]
实施例3
[0202]
car基因在t细胞基因组整合率及其编码蛋白在膜表面表达水平的检测
[0203]
分别取0.2
×
106个实施例2中培养到第6天(图2)的cart-cd22.5、cart-cd22.13和cart-cd22.14细胞样品，在重组人cd22蛋白fc段染色后，在流式细胞仪上分析car-cd22蛋白在t细胞膜表面的表达水平，未转导的t细胞(nt细胞)用作对照。
[0204]
结果如图2所示，3种car-t细胞的car结构均可在其相应修饰的t细胞中表达并完成细胞膜表面定位，并有较高的表达率。其中，cart-cd22.5和cart-cd22.14的表达率高于cart-cd22.13。
[0205]
实施例4
[0206]
cart-cd22s体外激活能力的检测
[0207]
采用实施例2中培养到第7天的cart-cd22s细胞(cart-cd22.5、cart-cd22.13和cart-cd22.14)进行细胞激活水平指标蛋白cd137和ifnγ的检测。依次取1
×
105个培养到第6天的cart-cd22细胞，分别与cd22阳性的k562-cd22 c7，k562-cd22 a4,h929-cd22 e12,raji肿瘤细胞系，以及cd22阴性的k562肿瘤细胞系或不添加肿瘤细胞，在200μl gt-551培养基中按照1:1比例培养18h后流式方法检测t细胞膜表面cd137的表达水平，elisa方法检测培养上清中ifnγ的分泌水平。
[0208]
结果如图3a所示，3种car-t细胞的表面均可以检测到cd137的表达，并且均可以在培养上清中检测到ifnγ的表达。其中，car-t22.13及car-t22.14比car-t22.5有更好的cd137活化水平，但car-t22.5的ifnγ释放水平高于car-t22.13及car-t22.14。
[0209]
实施例5
[0210]
cart-cd22s细胞诱导肿瘤细胞晚期凋亡活性的检测
[0211]
按细胞数5:1、10:1、20:1、40：1的比例分别将实施例2中培养到第14天的cart-cd22s细胞与1
×
104个cd22阴性细胞(k562)或cd22阳性细胞raji，及自构细胞k562-cd22过表达肿瘤细胞株混合，在100μl gt-551培养体系中共培养8h后，吸取50μl培养基上清，加入显色底物混合物，通过30分钟偶联的酶反应，检测肿瘤细胞被car-t细胞识别杀伤后，裂解时释放出的乳酸脱氢酶(ldh)的量，生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。
[0212]
结果如图4所示，所有t细胞对cd22阴性肿瘤细胞系k562无杀伤能力，且3种car-t细胞均可以较好的诱导cd22阳性肿瘤细胞凋亡。其中，car-t22.13,car-t22.14比car-t22.5可以更好地诱导cd22阳性肿瘤细胞的晚期凋亡；car-t22.14诱导cd22阳性肿瘤细胞的晚期凋亡能力略优于car-t22.13。
[0213]
实施例6
[0214]
t细胞脱颗粒相关膜蛋白cd107a的表达水平的检测
[0215]
取2
×
105个cd22阴性(k562)或cd22阳性(k562-cd22 a4,h929-cd22 e12,raji)肿瘤细胞系和1
×
105个car-t细胞，在200μl gt-551培养基中按照体积比1:1比例培养5h后，检测car-t细胞被cd22阳性的肿瘤细胞激活后t细胞脱颗粒相关膜蛋白cd107a的表达水平变化。
[0216]
结果如图5所示，3种car-t细胞被cd22阳性的肿瘤细胞(k562-cd22 c7,k562-cd22 a4,h929-cd22 e12)激活后,cd107a释放水平表达增加，与raji细胞共培养后，car-t细胞
的cd107a无明显表达增加。其中，car-t22.14的cd107a释放高于car-t22.13及car-t22.5，杀伤效果更强。
[0217]
对比例
[0218]
在本技术的嵌合抗原受体结构的筛选过程中，发明人测试了大量的候选序列。
[0219]
候选的cart细胞包括car-t22.3，car-t22.5，car-t22.7，car-t22.8，car-t22.9，car-t22.10，car-t22.11，car-t22.12，car-t22.15，car-t22.16，car-t22.17，其中cart细胞的制备方法同实施例2，检测方法与实施例3，4相同。
[0220]
候选car-t中包含的抗体序列来源于公布的文献和专利。其中，car-t22.3所用cd22抗体(m971)的轻链重链序列来源于美国专利，专利号为us8591889b2；car-t22.5所用cd22抗体(km196172)的轻链重链序列来源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/km196172；car-t22.7所用cd22抗体(vm1000)的轻链重链序列来源于美国专利，专利号为us9856323b2；car-t22.8所用cd22抗体(ll2)的轻链重链序列来源于文献(pawlak byczkowska,e.j.et al.,cancer res.49:4568-4577(1989))；car-t22.9所用cd22抗体(10f4)的轻链重链序列来源于美国专利，专利号为us2014/0127197a1；car-t 22.10所用cd22抗体(19a3)，22.11(23c6)，22.12(16f7)，22.15(4g6)，22.16(21f4)，22.17(21f4)的轻链重链序列来源于美国专利，专利号为us9499632b2。
[0221]
各个cart细胞的检测结果如图6所示。通过阳性率检测(图6a)，cd137体外激活能力的检测(图6b)以及对与靶细胞共培养后上清中ifnγ释放水平检测(图6c)等实验对比发现，car-t22.3，car-t22.7，car-t22.8，car-t22.9，car-t22.10，car-t22.16，car-t22.17，阳性率很低，视为无效；在ifnγ试验中发现，car-t22.5，car-t22.11，car-t22.13，car-t22.14，与cd22阳性的肿瘤细胞共培养后，ifnγ释放很高，cd137表达也高，表明car-t细胞被特异性激活。因此，选择22.13，22.14进行进一步的研究。
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在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。