乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性的标志物及检测试剂盒的制作方法

1.本技术涉及乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性检测领域，特别是涉及一种乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性的标志物及检测试剂盒。


背景技术：

2.乳腺癌是女性中发病率最高的恶性肿瘤，全球每年约新增170万患者和52万死亡病例。根据分子特征，乳腺癌主要分为四种亚型：luminala型、luminal b型、人表皮生长因子受体-2(her2)阳性、三阴性乳腺癌。美国国家癌症研究所(nci)发布的乳腺癌治疗指南指出，目前治疗乳腺癌的手段主要包括手术、放疗、化疗和靶向药。具体来说，对于雌激素或孕激素受体(er/pr)阳性的luminaa型和b型乳腺癌患者，可以使用激素疗法获得不错的治疗效果；对于her2阳性的乳腺癌患者，可以使用erbb2单抗类药物如曲妥珠单抗(trastuzumab)等，达到不错的治疗效果；而对于三阴性乳腺癌患者，目前还没有非常有效的治疗方法，一般只能接受传统化疗。
3.紫杉烷类化疗药物，包括多烯紫杉醇和紫杉醇，是当前治疗三阴性乳腺癌最常用的化疗药物。然而，研究显示，37％-71％的患者在紫杉醇化疗过程中会出现耐药性的问题，造成患者的复发和最终死亡。
4.目前国际上有多项研究致力于探索乳腺癌患者紫杉醇的耐药性机理，并寻找可以用于预测紫杉醇化疗耐药性的生物标志物。研究发现由abcb1基因编码的多药抗性蛋白1(mdr1)的表达上调是导致乳腺癌细胞出现紫杉醇耐受性的关键机制。但是，乳腺癌耐药细胞中mdr1上调的调控机制尚不明确。对于乳腺癌患者多烯紫杉醇的耐药性，还没有可以应用于临床的预测性标志物及相关的检测方法或检测试剂。


技术实现要素：

5.本技术的目的是提供一种新的乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性的标志物及检测试剂盒。
6.本技术采用了以下技术方案：
7.本技术的第一方面公开了一种乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性的标志物，该标志物为控制abcb1基因表达的环状rna，该环状rna为seq id no.1所示序列。
8.需要说明的是，本技术研究发现seq id no.1所示序列的环状rna，即circabcb1，能够控制abcb1基因表达量升高，通过检测circabcb1的表达量可以预测乳腺癌对紫杉醇的耐药性，有助于患者尽早发现耐药风险，优化化疗药物的选择过程，节省宝贵的治疗时间，减少患者的精神痛苦和经济负担；因此，本技术创造性的提出将控制abcb1基因表达的seq id no.1所示序列的环状rna作为乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性的标志物。
9.本技术的第二方面公开了控制abcb1基因表达的环状rna作为乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性标志物的应用，该环状rna为seq id no.1所示序列。
10.可以理解，本技术研究发现了控制abcb1基因表达的环状rna可以作为乳腺癌多烯
紫杉醇化疗耐药性的标志物；因此，本技术提出了该环状rna作为乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性标志物的应用。
11.本技术的第三方面公开了控制abcb1基因表达的环状rna在制备乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性的检测试剂中的应用，该环状rna为seq id no.1所示序列。
12.需要说明的是，本技术研究发现控制abcb1基因表达的环状rna可以作为乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性的标志物，通过检测该环状rna可以检测乳腺癌多烯紫杉醇化疗的耐药性；因此，本技术提出了该环状rna在制备乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性的检测试剂中的应用；该应用具体包括，例如针对该环状rna设计相应的特异性检测探针、引物或其它检测试剂，将其作为乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性的检测试剂。
13.本技术的第四方面公开了一种检测乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性的试剂盒，该试剂盒中包含检测控制abcb1基因表达的环状rna的试剂，该环状rna为seq id no.1所示序列。
14.可以理解，为了便于使用，本技术将检测环状rna的试剂制成试剂盒，以便于乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性检测；其中，检测环状rna的试剂可以是特异性检测本技术环状rna的任何试剂，例如特异性探针、引物等。
15.优选的，本技术的试剂盒中，检测控制abcb1基因表达的环状rna的试剂为环状rna特异性引物对，该环状rna特异性引物对的上游引物为seq id no.2所示序列，下游引物为seq id no.3所示序列。
16.优选的，本技术的试剂盒中还包含检测内参基因gapdh的试剂。
17.优选的，本技术的试剂盒中，检测内参基因gapdh的试剂为内参基因特异性引物对，内参基因特异性引物对的上游引物为seq id no.4所示序列，下游引物为seq id no.5所示序列。
18.需要说明的是，seq id no.2和seq id no.3所示序列的引物对，以及seq id no.4和seq id no.5所示序列的引物对，只是本技术的一种实现方式中具体采用的环状rna特异性引物和内参基因特异性引物，不排除还可以设计更多的特异性引物或者特异性探针。
19.优选的，本技术的试剂盒中还包含乳腺癌细胞cdna标准品，该乳腺癌细胞cdna标准品包括多烯紫杉醇敏感细胞cdna和多烯紫杉醇耐药细胞cdna。
20.需要说明的是，本技术的一种实现方式中，以多烯紫杉醇敏感细胞cdna为参照，通过比较待测样品中的circabcb1的表达情况是否相当于多烯紫杉醇敏感细胞cdna上调，判断待测样品是否耐药；并且，采用多烯紫杉醇耐药细胞cdna作为参考，判断待测样品的耐药风险和程度。
21.还需要说明的是，本技术的一种实现方式中，多烯紫杉醇敏感细胞cdna是来源于对多烯紫杉醇敏感的乳腺癌细胞株提取rna后逆转录而成的cdna；多烯紫杉醇耐药细胞cdna是通过将敏感型乳腺癌细胞连续暴露于梯度增高的多烯紫杉醇中，建立耐药细胞亚系，对耐药细胞亚系提取rna后逆转录而成的cdna。
22.优选的，本技术的试剂盒中还包含用于实时荧光定量pcr检测的试剂。
23.需要说明的是，本技术的一种实现方式中具体采用的是实时荧光定量pcr检测，更具体的是sybr green实时荧光定量pcr反应体系，因此，本技术为了使用方便，将实时荧光定量pcr检测的试剂组合到本技术的试剂盒中。可以理解，原则上，实时荧光定量pcr检测的
试剂也可以直接通过市售购买获得。另外，如果不是采用实时荧光定量pcr检测，例如采用固相基因芯片、液相基因芯片或其它技术进行环状rna和内参基因检测，本技术的试剂盒中也可以含有相应的检测试剂，在此不作具体限定。
24.本技术的第五方面公开了一种乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性的检测方法，包括采用本技术的试剂盒，对待测样品的环状rna或环状rna的cdna进行定量检测，根据环状rna的表达量，判断待测样品的多烯紫杉醇化疗耐药性。
25.需要说明的是，本技术的乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性检测方法，通过检测待测样品中环状rna(circabcb1)的表达量，可以判断待测样品是否对多烯紫杉醇产生耐药性，有助于患者尽早发现耐药风险，优化化疗药物的选择过程，这对个体化的化疗方案的实施具有重要的指导作用。可以理解，本技术的乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性检测方法，是对离体的核酸样本进行检测，并且所获得的检测结果仅仅是作为多烯紫杉醇化疗耐药性判断的依据，不能直接得出提供待测样品的个体的健康或疾病状况。
26.本技术的有益效果在于：
27.本技术研究发现了一种新的乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性的标志物，即seq id no.1所示序列的控制abcb1基因表达的环状rna。通过本技术标志物的检测，即检测环状rna分子circabcb1的表达量，可以预测乳腺癌对紫杉醇的耐药性，有助于尽早发现耐药风险，优化化疗药物的选择过程，节省治疗时间，减少病患精神痛苦和经济负担，为定制个体化的乳腺癌化疗方案奠定了基础。
附图说明
28.图1是本技术实施例中多烯紫杉醇耐药乳腺癌细胞株mcf7-res及其亲本的多烯紫杉醇敏感细胞株mcf-7的实时荧光定量pcr检测结果图；
29.图2是本技术实施例中多烯紫杉醇耐药乳腺癌细胞株mda-res及其亲本的多烯紫杉醇敏感细胞株mda-mb-231的实时荧光定量pcr检测结果图。
具体实施方式
30.目前，要判断肿瘤患者是否对某种化疗药物产生耐药，临床上主要通过监测患者血液中的循环肿瘤dna(ctdna)中是否产生新的突变，结合患者用药后的体感和ct影像观测肿瘤大小来推测。这种方法的局限性在于，ctdna在血液中的含量极少，一管血中所包含的ctdna更是微乎其微，需要通过超高深度的测序，才有可能捕获到ctdna的信号，假阴性几率较高且成本高昂。并且，测序得到的数据中超过99％都是血细胞中正常的dna信息，这些数据不包含肿瘤细胞dna的突变，在后续分析中都会被过滤掉，造成资源浪费。此外，通过患者体感和ct影像观察肿瘤大小都带有较强的主观性，没有可以量化的标准，结果不稳定。
31.近年来，随着分子生物学技术的发展，市面上也出现了一些检测肿瘤耐药的试剂盒。例如名称为“恶性实体瘤化疗耐药检测试剂盒”的专利申请，专利公开号cn106119380a，其公开了一种通过荧光定量pcr(qpcr)技术检测limk1、mdr1、gapdh三个基因的表达水平，以推断实体瘤，包括肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌或子宫内膜癌等，患者耐药性的试剂盒。该专利申请的检测方法中需要检测limk1、mdr1、gapdh这三个基因在患者的肿瘤组织和非肿瘤组织中的表达量，计算limk1基因和mdr1基因相对于内参
gapdh基因的比率，若肿瘤组织的limk1和mdr1基因与gapdh基因的比例均大幅高于非肿瘤组织中的比率，则认为该患者耐药性较强；反之，若肿瘤组织与肺肿瘤组织相似，则认为该患者对化疗药物敏感。
32.这种耐药性检测方法的局限性在于，检测方法只考虑了编码蛋白的mrna本身表达量的上调，而没有考虑起到调控作用的非编码rna，例如lncrna、circrna和mirna，的表达量变化。根据已有报导及本技术的前期研究，非编码rna在预测化疗耐药性方面比mrna有更好的特异性。所以仅使用limk1、mdr1基因的表达水平来预测肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，明显不够全面，难以达到较高的准确上。
33.环状rna是在真核生物转录组中广泛存在的天然的环状结构非编码rna。与线性rna相比，环状rna在体内高度稳定，主要存在于胞质中且能被分选进外泌体中。此外，研究还发现环状rna在肿瘤发生和发展过程中的潜在作用，可能参与肿瘤相关的通路的调控。近期有多个研究发现环状rna参与调控肿瘤的化疗耐药性，但是，在多烯紫杉醇(docetaxel)耐药的乳腺癌病人及细胞系中，至今没有环状rna标志物被报导。
34.基于以上研究背景和认识，本技术利用多烯紫杉醇耐药的乳腺癌细胞株mda-res和mcf7-res以及它们的对多烯紫杉醇敏感的母细胞株mda-mb-231和mcf-7作为研究材料。通过实时荧光定量pcr实验检测各个样品中环状rna分子的表达量；结果发现，环状rna分子circabcb1在两个多烯紫杉醇耐药的乳腺癌细胞株mda-res和mcf7-res的所有样品中高表达，而在两个对多烯紫杉醇敏感的乳腺癌母细胞株的所有样品中低表达或不表达。说明在乳腺癌细胞中，环状rna分子circabcb1的表达量随着对多烯紫杉醇耐药性的产生而增加。因此，本技术创造性的提出，可以将环状rna分子circabcb1，作为预测乳腺癌多烯紫杉醇耐药性的标志物。其中，circabcb1即控制abcb1基因表达的环状rna，其序列为seq id no.1所示序列。
35.本技术创造性的将控制abcb1基因表达的环状rna，即circabcb1，作为乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性的标志物；通过检测乳腺癌样品中circabcb1的表达量，能够区分对多烯紫杉醇敏感或耐药的样品，从而可以预测、评价乳腺癌对多烯紫杉醇的耐药情况，有助于患者尽早发现耐药风险，优化化疗药物的选择过程，节省治疗时间，减少患者的精神痛苦和经济负担，对个体化的化疗方案的实施具有重要的指导作用。
36.下面通过具体实施例对本技术作进一步详细说明。以下实施例仅对本技术进行进一步说明，不应理解为对本技术的限制。
37.实施例
38.为验证circabcb1在多烯紫杉醇耐药的恶性乳腺癌细胞中的表达及特征，本例通过将恶性乳腺癌细胞株mda-mb-231和mcf-7连续暴露在梯度增加的多烯紫杉醇中，经过多代培养，最终得到多烯紫杉醇耐药的乳腺癌细胞株mda-res和mcf7-res细胞株。收集两组耐药细胞样本，同时收集它们的对多烯紫杉醇敏感的母细胞株mda-mb-231和mcf-7作为研究材料，采用实时荧光定量pcr(rt-qpcr)进行验证。所有细胞株均由深圳华大基因科技服务有限公司提供和保存。
39.具体操作步骤如下：
40.1.肿瘤样品总rna的提取
41.(1)收集约5
×
106个乳腺癌细胞于离心管中，用pbs清洗3遍，然后加入1ml的
trizol裂解细胞，用移液器吸打几次，冰上水平摇晃裂解5分钟。
42.(2)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟，然后，4℃温度下10000
×
g离心15分钟，把上层水相转移到新的离心管中。
43.(3)加入0.5ml异丙醇沉淀水相中的rna，室温放置10分钟，然后4℃温度下10000
×
g离心10分钟，移去上清。
44.(4)加入1ml的75％乙醇洗涤rna沉淀，4℃温度下7500
×
g离心5分钟，弃上清。
45.(5)室温放置10分钟干燥rna，加入100μl无rnase的灭菌水溶解rna。
46.按照以上rna提取步骤，本例分别提取了多烯紫杉醇敏感的乳腺癌细胞株mda-mb-231和mcf-7的rna，以及多烯紫杉醇耐药的乳腺癌细胞株mda-res和mcf7-res的rna，总计四个rna样品。
47.采用nanodrop2000紫外分光光度计，对提取的四个rna样品进行浓度和纯度检测，剩余样品-70℃保存备用。
48.2.肿瘤rna样品逆转录制备cdna
49.在ep管中加入10μl的depc水、1μl随机引物、1μl模板rna和1μl的dntps，短暂离心。
50.65℃温育5分钟后，立刻0℃冰水浴1分钟。
51.然后，于冰上加入4μl的5
×
first-strand buffer、1μl的0.1m dtt、1μl的rnase inhibitor和1μl的superscriptⅲ逆转录酶，混匀后短暂离心。
52.将反应体系置于42℃温育60分钟进行逆转录，然后70℃温育15分钟灭活逆转录酶，-20℃保存。
53.按照以上逆转录方法，本例分别对提取的四个rna样品进行逆转录，获得相应的cdna用于后续试验。
54.3.实时荧光定量pcr检测
55.本例根据ncbi genbank数据库检索到的人abcb1基因序列及内参基因gapdh的序列，使用primer5.0遵循实时荧光定量pcr引物设计原则，设计上、下游引物，并使用blast对设计的引物的特异性进行评价，最终获得本例用于试验的特异性引物，如表1所示。其中，针对环状rna分子circabcb1的引物为反向pcr引物。
56.表1特异性引物
[0057][0058]
分别采用以上引物对提取的四个rna的cdna进行实时荧光定量pcr扩增，本例采用sybr green实时荧光定量pcr进行检测，其中包含sybr green荧光染料、dntps及pcr缓冲液，pcr缓冲液包含25mm的kcl、200mm的(nh4)2so4、2.5mm的mgcl2。本例在abi的steponeplus
tm
实时荧光定量pcr仪上，以肿瘤cdna样品为模板进行circabcb1及内参基因gapdh的实时荧光定量检测。
[0059]
在冰上进行反应体系的准备，采用20μl的反应体系，每个样品设置3个平行重复，在每个反应管中依次加入无菌水、肿瘤cdna模板、引物、和sybr green荧光染料混合液，具体的，20μl反应体包括：2
×
sybr green荧光染料混合液10μl、10mm上游引物1μl、10mm下游引物1μl、cdna样品2μl，补充无菌水至20μl。
[0060]
反应条件为：95℃预变性30秒，然后进入45个循环：95℃5秒，64℃40秒，其中，64℃时收集荧光。
[0061]
实时荧光定量pcr反应结束后，根据扩增曲线，以gapdh基因的表达量为内参，采用2-δδct
的方法计算circabcb1在各个样品中的相对表达量；以多烯紫杉醇敏感的细胞为参照，通过比较受检测样品中circabcb1的表达上调情况，判断受测样品是否耐药。
[0062]
4.结果与分析
[0063]
(1)总rna提取结果
[0064]
本例采用agilent 2100对提取的四个rna样品进行浓度和rna完整性检测，检测结果如表2所示。检测结果显示，四个rna样品的浓度和完整性都符合使用需求。
[0065]
表2 rna样品浓度和完整性检测结果
[0066]
样品名称浓度(ng/μl)体积(μl)总量(μg)rin28s/18smcf-716311422.83101.8mcf7-res820119.029.91.8mda-mb-23167322.149.41.9mda-res540105.4102
[0067]
(2)实时荧光定量pcr检测结果
[0068]
实时荧光定量pcr检测circabcb1在多烯紫杉醇耐药及敏感的乳腺癌细胞系中的表达量差异结果如图1和图2以及表3所示。
[0069]
表3 circabcb1表达量统计结果
[0070][0071]
图1为多烯紫杉醇耐药乳腺癌细胞株mcf7-res及其亲本的多烯紫杉醇敏感细胞株mcf-7的实时荧光定量pcr检测结果图，包括circabcb1的扩增曲线和内参基因gapdh的扩增曲线。图2为多烯紫杉醇耐药乳腺癌细胞株mda-res及其亲本的多烯紫杉醇敏感细胞株mda-mb-231的实时荧光定量pcr检测结果图，同样包括circabcb1的扩增曲线和内参基因gapdh的扩增曲线。
[0072]
图1和图2的结果显示，对于内参基因gapdh而言，无论是多烯紫杉醇敏感的亲本细胞还是多烯紫杉醇耐药乳腺癌细胞株，其内参基因表达量都类似，在图1和图2的扩增曲线中，可以看出敏感细胞和耐药细胞的内参基因gapdh扩增曲线是交叉重叠或相差无几的。但是，敏感细胞和耐药细胞的环状rna分子circabcb1的表达量却大不相同，与多烯紫杉醇敏
感的亲本细胞mcf-7和mda-mb-231相比，多烯紫杉醇耐药乳腺癌细胞株mcf7-res和mda-res细胞中环状rna分子circabcb1的表达量明显上调，上调的幅度分别为544.67和25.53倍，如表3所示。
[0073]
以上结果说明，在乳腺癌细胞中，环状rna分子circabcb1的表达量随着对多烯紫杉醇耐药性的产生而增加，可以采用circabcb1的表达量作为预测乳腺癌多烯紫杉醇耐药性的生物标志。通过检测待测乳腺癌样本中环状rna分子circabcb1的表达量，可以判断受测样本是否对多烯紫杉醇产生耐药性，可以预测、评价乳腺癌对多烯紫杉醇的耐药情况，有助于尽早发现耐药风险，优化化疗药物的选择过程，节省宝贵的治疗时间，减少患者的精神痛苦和经济负担，对个体化的化疗方案的实施具有重要的指导作用。
[0074]
因此，本例将控制abcb1基因表达的环状rna，即circabcb1，作为乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性的标志物，其中，环状rna分子circabcb1为seq id no.1所示序列。
[0075]
seq id no.1：
[0076]
guaugccuauuauuacaguggaauuggugcuggggugcugguugcugcuuacauucagguuucauuuuggugccuggcagcuggaagacaaauacacaaaauuagaaaacaguuuuuucaugcuauaaugcgacaggagauaggcugguuugaugugcacgauguuggggagcuuaacacccgacuuacagaugaugucuccaagauuaaugaaggaauuggugacaaaauuggaauguucuuucagucaauggcaacauuuuucacuggguuuauaguaggauuuacacgugguuggaagcuaacccuugugauuuuggccaucaguccuguucuuggacugucagcugcugucugggcaaagauacuaucuucauuuacugauaaagaacucuuagcguaugcaaaagcuggagcaguagcugaagaggucuuggcagcaauuagaacugugauugcauuuggaggacaaaagaaagaacuugaaagguacaacaaaaauuuagaagaagcuaaaagaauugggauaaagaaagcuauuacagccaauauuucuauaggugcugcuuuccugcugaucuaugcaucuuaugcucuggccuucugguaugggaccaccuugguccucucaggggaauauucuauuggacaaguacucacu
[0077]
在以上试验的基础上，本例进一步的，将检测控制abcb1基因表达的环状rna的试剂作为检测乳腺癌多烯紫杉醇化疗耐药性的试剂盒，具体的，将seq id no.2和seq id no.3所示序列的上下游引物作为检测环状rna分子circabcb1的特异性引物，将seq id no.4和seq id no.5所示序列的上下游引物作为检测内参基因gapdh的特异性引物，将两对特异性引物组合到试剂盒中，用于检测待测样品的circabcb1表达量。
[0078]
进一步的，将多烯紫杉醇敏感细胞cdna和多烯紫杉醇耐药细胞cdna组合到试剂盒中。以多烯紫杉醇敏感细胞cdna为参照，通过比较待测样品中的circabcb1的表达情况是否相当于多烯紫杉醇敏感细胞cdna上调，判断待测样品是否耐药；采用多烯紫杉醇耐药细胞cdna作为参考，判断待测样品的耐药风险和程度。其中，多烯紫杉醇敏感细胞cdna即本例多烯紫杉醇敏感的母细胞株mda-mb-231或者mcf-7提取的rna逆转录而成的cdna；多烯紫杉醇耐药细胞cdna即本例多烯紫杉醇耐药的乳腺癌细胞株mda-res或者mcf7-res提取的rna逆转录而成的cdna。另外，本例的试剂盒中，还可以根据需求选择性的加入sybr green实时荧光定量pcr反应试剂，sybr green实时荧光定量pcr反应试剂中包含sybr green荧光染料、dntps及pcr缓冲液，其中pcr缓冲液包含25mm的kcl、200mm的(nh4)2so4以及2.5mm的mgcl2。
[0079]
以上内容是结合具体的实施方式对本技术所作的进一步详细说明，不能认定本技术的具体实施只局限于这些说明。对于本技术所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。