一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测试剂盒及检测方法与流程

技术特征：
1.一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括：进行第一轮pcr扩增的外巢引物，外巢引物为its1f/its4r、its5f/its2r、ns3f/ns6r引物对中的至少一种；所述its1f/its4r引物对的序列如seq id no.1和seq id no.2所示；所述its5f/its2r引物对的序列如seq id no.3和seq id no.4所示；所述ns3f/ns6r引物对的序列如seq id no.5和seq id no.6所示；以及，进行第二轮pcr扩增的内巢引物，内巢引物为2ha0
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粉棒束孢
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f/r、5hao
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粉棒束孢
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f/r引物对中的至少一种；所述2ha0
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粉棒束孢
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f/r引物对的序列如seq id no.7和seq id no.8所示；所述5hao
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粉棒束孢
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f/r引物对的序列如seq id no.9和seq id no.10所示。2.一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测方法，其特征是，包括以下步骤：以如权利要求1中所述的外巢引物对中的至少一种作为外巢引物，提取的样本总核酸为反应模板，配制25ul反应体系进行第一轮pcr扩增；以如权利要求1中所述的内巢引物对中的至少一种作为内巢引物，第一轮pcr扩增的产物为模板，配制25ul反应体系进行第二轮pcr扩增；将第二轮pcr扩增产物进行电泳检测，检测获得条带则表明样品中含有粉棒束孢，反之则无。3.根据权利要求2所述的一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测方法，其特征是，所述第一轮pcr扩增条件具体为：95℃预变性3min；94℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸60s，37个循环；72℃延伸5min，最后4℃保存。4.根据权利要求2所述的一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测方法，其特征是，所述第二轮pcr扩增条件具体为：95℃预变性3min；94℃变性25s，57.3℃退火35s，72℃延伸60s，37个循环；72℃延伸5min，最后4℃保存。5.根据权利要求2所述的一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测方法，其特征是，所述25ul反应体系包括：pcr mix 22ul；上下游引物各0.5ul；dna模板2ul。6.根据权利要求5所述的一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测方法，其特征是，所述pcr反应的mix包括：0.18mm脱氧核苷酸；1.8mm氯化镁；60.3mm氯化钾；18.9mm tris
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hcl；0.6％甘油；5％二甲基亚砜；2.5％甲酰胺；5％甜菜碱；以无核酶水为溶剂。7.根据权利要求2所述的一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测方法，其特征是，所述样本总核酸为土壤样本核酸、组织样本核酸中的至少一种。8.根据权利要求7所述的一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测方法，其特征是，所述土壤样本核酸的提取步骤为：a.称取1g土壤，放入研钵中，倒入适量的液氮，立即研磨；再倒入适量的液氮，研磨，重复3次，使土壤颗粒研成粉末；b.将13.5ml的提取缓冲液、50μl的蛋白酶k与5g土壤置于50ml的离心管中，放入37℃恒温摇床，225r
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min
‑1振荡30min；提取缓冲液包括：0.1mol/l磷酸盐，ph为8.0；0.1mol/ledta，ph为8.0；0.1mol/l tris
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hcl，ph为8.0；1.5mol/l nacl；1.0％ctab；蛋白酶k的浓度为10g/l；c.加入1.5ml的20％sds，轻轻混匀，65℃水浴加热2h，每隔15
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30min轻轻摇匀1次；
5000r
·
min
‑1离心10min，将上清液转入新的50ml离心管中；取4.5ml提取缓冲液加入原离心管，摇匀泥浆，加入0.5ml的20％sds，65℃水浴15min，用同样的离心速度离心10min，将上清液与原上清液合并；再重复此步骤1次；d.用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀，5000r
·
min
‑1离心20min；收集上清液，并加入0.6倍体积的异丙醇，室温静置1h；25℃下12000r
·
min
‑1离心20min，倒出上清液，干燥后加入500μl去离子水，溶解粘附于离心管壁的dna和杂质，并收集于1.5ml的微型离心管中。9.根据权利要求7所述的一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测方法，其特征是，所述组织样本核酸的提取步骤为：a.取0.5g或0.5ml3的组织材料，双蒸水洗净，并用滤纸吸干；b.组织材料剪成1cm左右碎片，放入预冷的瓷研钵中；c.加入液氮速冷，研磨成细粉；d.在5ml离心管中加入抽提缓冲液2.5ml，60℃保温1小时；e.15000rpm，离心10分钟，上清转入另一个新的离心管中；f.加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，混匀抽提至水乳胶融状；j.15000rpm，离心10分钟；h.上清转入另一个新的离心管中；i.加入2/3倍体积预冷异丙醇，
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20℃保温30min
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1h，缓缓混匀dna成絮状折出；j.15000rpm，离心10分钟，弃上清；k.dna沉淀用70％乙醇洗2次；l.加入400ul te buffer溶解dna。10.根据权利要求7所述的一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测试剂盒及检测方法，其特征是，所述组织样本为植物、昆虫、微生物中的任意一种。

技术总结
本发明公开了一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测试剂盒及检测方法，涉及分子生物学领域，其技术方案要点是：包括进行第一轮PCR扩增的外巢引物，外巢引物为ITS1F/ITS4R、ITS5F/ITS2R、NS3F/NS6R引物对中的至少一种；以及，进行第二轮PCR扩增的内巢引物，内巢引物为2HA0


技术研发人员：卫秋阳 邓小书 贺元川 陈仕江 邢康康
受保护的技术使用者：重庆市中药研究院
技术研发日：2021.06.10
技术公布日：2021/10/29