一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测试剂盒及检测方法与流程

1.本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，它涉及一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.粉棒束孢是虫草菌最为常见的伴生真菌，是冬虫夏草的主要病害之一。粉棒束孢具有分布广泛,寄主种类繁多的特点，通常能够造成冬虫夏草的大面积死亡，严重阻碍了冬虫夏草产业发展进程。
3.目前，针对粉棒束孢病原的检测，主要通过筛选培养基进行平板培养，继而通过菌落形态进行判定。此方法耗时较长，通常需要数天的培养才能观察；而且对检测人员的经验要求较高，需要准确判定粉棒束孢和其他丝状真菌的差异，主观性较强；此外，由于需要检测粉棒束孢污染的环境多为土壤样品和虫体本身，样品成分复杂，土壤中的其他微生物背景和虫体中的共生菌往往会干扰实验结果，影响实验的灵敏度；此外，部分针对粉棒束孢病原的检测是通过pcr扩增技术进行检测的，但其检测过程存在检测灵敏度有待进一步提升以及仅能针对单一样品进行检测，其推广应用受到较大限制。
4.因此，如何研究设计一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测试剂盒及检测方法是我们目前急需解决的问题。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测试剂盒及检测方法。
6.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
7.第一方面，提供了一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测试剂盒，所述试剂盒包括：
8.进行第一轮pcr扩增的外巢引物，外巢引物为its1f/its4r、its5f/its2r、ns3f/ns6r引物对中的至少一种；
9.所述its1f/its4r引物对的序列如seq id no.1和seq id no.2所示；
10.所述its5f/its2r引物对的序列如seq id no.3和seq id no.4所示；
11.所述ns3f/ns6r引物对的序列如seq id no.5和seq id no.6所示；
12.以及，进行第二轮pcr扩增的内巢引物，内巢引物为2ha0
‑
粉棒束孢
‑
f/r、5hao
‑
粉棒束孢
‑
f/r引物对中的至少一种；
13.所述2ha0
‑
粉棒束孢
‑
f/r引物对的序列如seq id no.7和seq id no.8所示；
14.所述5hao
‑
粉棒束孢
‑
f/r引物对的序列如seq id no.9和seq id no.10所示。
15.第二方面，提供了一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测方法，包括以下步骤：
16.以如权利要求1中所述的外巢引物对中的至少一种作为外巢引物，提取的样本总核酸为反应模板，配制25ul反应体系进行第一轮pcr扩增；
17.以如权利要求1中所述的内巢引物对中的至少一种作为内巢引物，第一轮pcr扩增
的产物为模板，配制25ul反应体系进行第二轮pcr扩增；
18.将第二轮pcr扩增产物进行电泳检测，检测获得条带则表明样品中含有粉棒束孢，反之则无。
19.进一步的，所述第一轮pcr扩增条件具体为：95℃预变性3min；94℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸60s，37个循环；72℃延伸5min，最后4℃保存。
20.进一步的，所述第二轮pcr扩增条件具体为：95℃预变性3min；94℃变性25s，57.3℃退火35s，72℃延伸60s，37个循环；72℃延伸5min，最后4℃保存。
21.进一步的，所述25ul反应体系包括：pcr mix 22ul；上下游引物各0.5ul；dna模板2ul。
22.进一步的，所述pcr反应的mix包括：0.18mm脱氧核苷酸；1.8mm氯化镁；60.3mm氯化钾；18.9mm tris
‑
hcl；0.6％甘油；5％二甲基亚砜；2.5％甲酰胺；5％甜菜碱；以无核酶水为溶剂。
23.进一步的，所述样本总核酸为土壤样本核酸、组织样本核酸中的至少一种。
24.进一步的，所述土壤样本核酸的提取步骤为：
25.a.称取1g土壤，放入研钵中，倒入适量的液氮，立即研磨；再倒入适量的液氮，研磨，重复3次，使土壤颗粒研成粉末；
26.b.将13.5ml的提取缓冲液、50μl的蛋白酶k与5g土壤置于50ml的离心管中，放入37℃恒温摇床，225r
·
min
‑1振荡30min；提取缓冲液包括：0.1mol/l磷酸盐，ph为8.0；0.1mol/l edta，ph为8.0；0.1mol/l tris
‑
hcl，ph为8.0；1.5mol/l nacl；1.0％ctab；蛋白酶k的浓度为10g/l；
27.c.加入1.5ml的20％sds，轻轻混匀，65℃水浴加热2h，每隔15
‑
30min轻轻摇匀1次； 5 000r
·
min
‑1离心10min，将上清液转入新的50ml离心管中；取4.5ml提取缓冲液加入原离心管，摇匀泥浆，加入0.5ml的20％sds，65℃水浴15min，用同样的离心速度离心10min，将上清液与原上清液合并；再重复此步骤1次；
28.d.用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀，5000r
·
min
‑1离心20min；收集上清液，并加入0.6倍体积的异丙醇，室温静置1h；25℃下12000r
·
min
‑1离心20min，倒出上清液，干燥后加入500μl去离子水，溶解粘附于离心管壁的dna和杂质，并收集于1.5ml的微型离心管中。
29.进一步的，所述组织样本核酸的提取步骤为：
30.a.取0.5g或0.5ml3的组织材料，双蒸水洗净，并用滤纸吸干；
31.b.组织材料剪成1cm左右碎片，放入预冷的瓷研钵中；
32.c.加入液氮速冷，研磨成细粉；
33.d.在5ml离心管中加入抽提缓冲液2.5ml，60℃保温1小时；
34.e.15000rpm，离心10分钟，上清转入另一个新的离心管中；
35.f.加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，混匀抽提至水乳胶融状；
36.j.15000rpm，离心10分钟；
37.h.上清转入另一个新的离心管中；
38.i.加入2/3倍体积预冷异丙醇，
‑
20℃保温30min
‑
1h，缓缓混匀dna成絮状折出；
39.j.15000rpm，离心10分钟，弃上清；
40.k.dna沉淀用70％乙醇洗2次；
41.l.加入400ul te buffer溶解dna。
42.进一步的，所述组织样本为植物、昆虫、微生物中的任意一种。
43.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
44.1、本发明采用巢式pcr技术，检测灵敏度相比于传统检测试剂盒提升显著提升，尤其适用于微量检测；整个检测过程只需电泳跑胶检测即可判断有无粉棒束孢污染，无需通过测序鉴定，具有灵敏度高、取样种类宽泛、检测便捷优势；
45.2、本发明与传统菌落培养比较具有周期短、不易污染、灵敏度高等特点，且与传统真菌鉴定效果比较具有特异性好、不易与虫草菌混淆、检测灵敏度高等特点；
46.3、本发明相对于传统检测试剂盒而言，其假阳性几率低，混合样品的灵敏度较高。
附图说明
47.此处所说明的附图用来提供对本实用新型实施例的进一步理解，构成本技术的一部分，并不构成对本实用新型实施例的限定。在附图中：
48.图1是本发明实施例中的电泳结果示意图；
49.图2是本发明实施例中的灵敏度检测结果示意图。
具体实施方式
50.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
51.实施例1：一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测试剂盒，试剂盒包括进行第一轮pcr扩增的外巢引物以及进行第二轮pcr扩增的内巢引物。
52.外巢引物为its1f/its4r、its5f/its2r、ns3f/ns6r引物对中的至少一种；its1f/its4r引物对的序列如seq id no.1和seq id no.2所示；its5f/its2r引物对的序列如seq id no.3和 seq id no.4所示；ns3f/ns6r引物对的序列如seq id no.5和seq id no.6所示。作为优选的一种实施方式，外巢引物同时具有its1f/its4r、its5f/its2r、ns3f/ns6r三种引物对。
53.外巢引物的核苷酸序列具体如下表所示：
54.引物名称序列(5
’‑3’
)its1ftccgtaggtgaacctgcggits4rtcctccgcttattgatatgcits5fggaagtaaaagtcgtaacaaggits2rgctgcgttcttcatcgatgcns3fgcaagtctggtgccagcagccns6rgcatcacagacctgttattgcctc
55.内巢引物为2ha0
‑
粉棒束孢
‑
f/r、5hao
‑
粉棒束孢
‑
f/r引物对中的至少一种；2ha0
‑
粉棒束孢
‑
f/r引物对的序列如seq id no.7和seq id no.8所示；5hao
‑
粉棒束孢
‑
f/r引物对的序列如 seq id no.9和seq id no.10所示。作为优选的一种实施方式，内巢引物同时
具备2ha0
‑
粉棒束孢
‑
f/r、5hao
‑
粉棒束孢
‑
f/r两种引物对。
56.内巢引物的核苷酸序列具体如下表所示：
57.引物名称序列(5
’‑3’
)2ha0
‑
粉棒束孢
‑
fgcctgcggagggatcatta2ha0
‑
粉棒束孢
‑
rcagaagtcgggggttttacg5ha0
‑
粉棒束孢
‑
fcctatcgttgcttcggc5ha0
‑
粉棒束孢
‑
raagttcagcgggtattcct
58.实施例2：一种虫草粉棒束孢高灵敏度检测方法，包括以下步骤：
59.s1：以实施例1中记载的三种外巢引物对作为外巢引物，提取的样本总核酸为反应模板，配制25ul反应体系进行第一轮pcr扩增；
60.s2：以实施例1中记载的两种内巢引物对为内巢引物，第一轮pcr扩增的产物为模板，配制25ul反应体系进行第二轮pcr扩增；
61.s3：将第二轮pcr扩增产物进行电泳检测，检测获得条带则表明样品中含有粉棒束孢，反之则无。
62.实施例3：prc扩增
63.(1)第一轮pcr扩增的具体步骤为：
64.1)将pcr反应所需的成分配置完后，在pcr仪上于95℃预加热3min，使模板dna充分变性，然后进入扩增循环；
65.2)在每一个循环中，先于94℃保持25s使模板变性，然后将温度降到60℃保持35s，使引物与模板充分退火；
66.3)在72℃保持60s分钟，使引物在模板上延伸，合成dna，完成一个循环；
67.4)重复循环37次，使扩增的dna片段大量累积；
68.5)最后，在72℃保持5min，使产物延伸完整，4℃保存。
69.(2)第二轮pcr扩增的具体步骤为：
70.1)将pcr反应所需的成分配置完后，在pcr仪上于95℃预加热3min，使模板dna充分变性，然后进入扩增循环；
71.2)在每一个循环中，先于94℃保持25s使模板变性，然后将温度降到57.3℃保持35s，使引物与模板充分退火；
72.3)在72℃保持60s分钟，使引物在模板上延伸，合成dna，完成一个循环；
73.4)重复循环37次，使扩增的dna片段大量累积；
74.5)最后，在72℃保持5min，使产物延伸完整，4℃保存。
75.25ul反应体系包括：pcr mix 22ul；上下游引物各0.5ul；dna模板2ul。
76.pcr反应的mix包括：0.18mm脱氧核苷酸；1.8mm氯化镁；60.3mm氯化钾；18.9mmtris
‑
hcl；0.6％甘油；5％二甲基亚砜；2.5％甲酰胺；5％甜菜碱；以无核酶水为溶剂。
77.实施例4：样本总核酸的提取
78.样本总核酸为土壤样本核酸、组织样本核酸或同时具体两种。
79.其中，土壤样本核酸的提取步骤为：
80.a.称取1g土壤，放入研钵中，倒入适量的液氮，立即研磨；再倒入适量的液氮，研磨，重复3次，使土壤颗粒研成粉末；
81.b.将13.5ml的提取缓冲液、50μl的蛋白酶k与5g土壤置于50ml的离心管中，放入37℃恒温摇床，225r
·
min
‑1振荡30min；提取缓冲液包括：0.1mol/l磷酸盐，ph为8.0；0.1mol/l edta，ph为8.0；0.1mol/l tris
‑
hcl，ph为8.0；1.5mol/l nacl；1.0％ctab；蛋白酶k的浓度为10g/l；
82.c.加入1.5ml的20％sds，轻轻混匀，65℃水浴加热2h，每隔15
‑
30min轻轻摇匀1次；5 000r
·
min
‑1离心10min，将上清液转入新的50ml离心管中；取4.5ml提取缓冲液加入原离心管，摇匀泥浆，加入0.5ml的20％sds，65℃水浴15min，用同样的离心速度离心10min，将上清液与原上清液合并；再重复此步骤1次；
83.d.用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀，5000r
·
min
‑1离心20min；收集上清液，并加入0.6倍体积的异丙醇，室温静置1h；25℃下12000r
·
min
‑1离心20min，倒出上清液，干燥后加入500μl去离子水，溶解粘附于离心管壁的dna和杂质，并收集于1.5ml的微型离心管中。
84.其中，组织样本核酸的提取步骤为：
85.a.取0.5g或0.5ml3的组织材料，双蒸水洗净，并用滤纸吸干；
86.b.组织材料剪成1cm左右碎片，放入预冷的瓷研钵中；
87.c.加入液氮速冷，研磨成细粉；
88.d.在5ml离心管中加入抽提缓冲液2.5ml，60℃保温1小时；
89.e.15000rpm，离心10分钟，上清转入另一个新的离心管中；
90.f.加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，混匀抽提至水乳胶融状；氯仿、异戊醇均为分析纯品；
91.j.15000rpm，离心10分钟；
92.h.上清转入另一个新的离心管中；
93.i.加入2/3倍体积预冷异丙醇，
‑
20℃保温30min
‑
1h，缓缓混匀dna成絮状折出；
94.j.15000rpm，离心10分钟，弃上清；
95.k.dna沉淀用70％乙醇洗2次；
96.l.加入400ul te buffer溶解dna。
97.需要说明的是，组织样本为植物、昆虫、微生物中的任意一种。
98.实施例5：实验验证
99.一、电泳检测结果
100.如图1所示。电泳检测具备较好的特异性，在不含有粉棒束孢的样品中并不能扩增出任何条带并未检出假阳性结果，同时该检测试剂盒还具备较好的适用性，能够从土壤、植物、昆虫样本中检出粉棒束孢。
101.其中，图1中a：a2、a5分别为2ha0
‑
粉棒束孢引物及5ha0
‑
粉棒束孢引物扩增条带，检测样品均为含有粉棒束孢的土壤样品；b1：不含粉棒束孢的土壤样品；b2：不含粉棒束孢的植物组织；b3：不含粉棒束孢的昆虫组织。图1中b：a2为2ha0
‑
粉棒束孢引物扩增结果， a5为2ha0
‑
粉棒束孢引物扩增序列及比对结果5ha0
‑
粉棒束孢引物扩增结果，分别检测含有粉棒束孢的土壤样品、植物样品和昆虫样品。
102.2ha0
‑
粉棒束孢引物扩增序列及比对结果如表1所示，测序结果经数据库比对，与粉棒束孢(isaria fumosorosea)株系ffjc 27(genebank id:kf876832.1)相似度达到
99.37％。
103.表1 2ha0
‑
粉棒束孢引物扩增序列及比对结果
[0104][0105]
5ha0
‑
粉棒束孢引物扩增序列及比对结果如表2所示，测序结果经数据库比对，与粉棒束孢(isaria fumosorosea)株系512
‑
a(genebank id:mk163754.1)相似度达到99.36％。
[0106]
表2 5ha0
‑
粉棒束孢引物扩增序列及比对结果
[0107][0108]
二、粉棒束孢试剂盒灵敏度验证
[0109]
采用1ml不同浓度的粉棒束孢菌悬液分别与10g土样混合的方式进行灵敏度评价，
将1ml 浓度为50个/ml粉棒束孢菌悬液混合10g土壤后仍然能够检出条带。
[0110]
粉棒束孢试剂盒灵敏度检测如图2所示，其中，2：表示采用2ha0
‑
粉棒束孢引物扩增； 5：表示采用5ha0
‑
粉棒束孢引物扩增；2
‑
1：将1ml浓度为105个/ml粉棒束孢菌悬液混合10g 土壤后扩增结果；2
‑
2：将1ml浓度为104个/ml粉棒束孢菌悬液混合10g土壤后扩增结果； 2
‑
3：将1ml浓度为103个/ml粉棒束孢菌悬液混合10g土壤后扩增结果；2
‑
4：将1ml浓度为 102个/ml粉棒束孢菌悬液混合10g土壤后扩增结果；2
‑
5：将1ml浓度为501个/ml粉棒束孢菌悬液混合10g土壤后扩增结果；5
‑
1至5
‑
5检测同上依次类推。
[0111]
通过实验验证发现，本发明采用的巢式pcr技术，其检测灵敏度相比于传统检测试剂盒提升显著提升，尤其适用于微量检测；整个检测过程只需电泳跑胶检测即可判断有无粉棒束孢污染，无需通过测序鉴定，具有灵敏度高、取样种类宽泛、检测便捷优势。另外，与传统菌落培养比较具有周期短、不易污染、灵敏度高等特点，且与传统真菌鉴定效果比较具有特异性好、不易与虫草菌混淆、检测灵敏度高等特点；此外，本发明相对于传统检测试剂盒而言，其假阳性几率低，混合样品的灵敏度较高。
[0112]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。