毡毛青霉DZ-9-67及其在杜仲叶总黄酮提取中的应用的制作方法

毡毛青霉dz
‑9‑
67及其在杜仲叶总黄酮提取中的应用
(一)技术领域
1.本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一株毡毛青霉dz
‑9‑
67及其在杜仲叶总黄酮提取中的应用。
(二)

背景技术：

2.杜仲(eucommia ulmoides oliv.)，又名胶木，为杜仲科杜仲属植物。杜仲在我国栽培已有两千多年的历史。我国第一部药书汉代的《神农本草经》就记载了杜仲树皮的药效，并将杜仲列为上品。明代李时珍著作《本草纲目》中更为详细的记述了杜仲药名的由来和药效。2020年版中国药典一部药材和饮片中收录了杜仲(eucommiae cortex)和杜仲叶(eucommiae folium)。药典记载杜仲的功能与主治为：补肝肾，强筋骨，安胎。用于肝肾不足，腰膝酸痛，筋骨无力，头晕目眩，妊娠漏血，胎动不安；杜仲叶的功能与主治为：补肝肾，强筋骨。用于肝肾不足，头晕目眩，腰膝酸痛，筋骨痿软。
3.杜仲叶含有多种生物活性成分，包括木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、多糖类等化合物，其中，黄酮类化合物含量较高，如钟淑娟的分析表明：杜仲皮、叶、雄花、籽的总黄酮平均含量分别为1.33％、9.02％、3.02％和1.22％[钟淑娟,杨欣,李静,等.杜仲不同部位总黄酮含量及抗氧化活性研究.中国药房,2017,28(13):1787
‑
1790]。黄酮类化合物在抗氧化、抑制脂质过氧化反应、预防动脉粥样硬化及保护心脑血管、防癌、抗癌等方面效果良好，在辅助药物和保健食品领域都有广泛的应用。杜仲叶黄酮含量丰富，是提取黄酮的良好原料。
[0004]
目前，国内有较多的关于杜仲叶总黄酮的提取方法报道，方法主要有水提法、有机溶剂提取法、超声波或微波辅助提取法、co2超临界萃取法、酶辅助提取法和半仿生提取法等。不同的提取方法有各自的优缺点，总黄酮得率也差异较大。水提法成本低，但总黄酮得率较低；有机溶剂提取法的总黄酮得率有显著提高，但需要大量有机溶剂；超声或微波辅助提取法在有机溶剂提取法的基础上，增加超声波或微波处理，促进总黄酮溶出，提取得率有一定的提高；co2超临界萃取法可以获得较高的提取得率和产品纯度，但设备要求比较高；酶辅助提取法的提取条件温和、活性物质不易失活，但商品化的纯酶成本较高；半仿生提取法工艺复杂，高温煎煮容易破坏黄酮的结构。几种方法相比之下，超声波辅助溶剂提取有一定的优势。
[0005]
为了提高杜仲叶总黄酮的提取得率，本发明对杜仲叶总黄酮超声波辅助提取工艺进行改进，增加微生物发酵预处理步骤，可以显著提高杜仲叶总黄酮的提取得率。
(三)

技术实现要素：

[0006]
本发明目的是提供一株新的微生物菌株—毡毛青霉(penicillium velutinum)dz
‑9‑
67，及其在杜仲叶总黄酮提取中的应用，能够显著提高杜仲叶总黄酮的提取得率。
[0007]
本发明采用的技术方案是：
[0008]
本发明提供一株用于杜仲叶总黄酮提取的发酵预处理微生物菌株—毡毛青霉
(penicillium velutinum)dz
‑9‑
67，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmcc no:61728，保藏日期2021年6月21日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
[0009]
本发明所述毡毛青霉dz
‑9‑
67，是从杜仲叶的微生物富集培养物中分离，经过筛选和诱变选育获得的优良菌株。所述毡毛青霉dz
‑9‑
67的菌落形态特征如下：在马铃薯葡萄糖琼脂(pda)平板培养基上，28℃培养3d，菌落初期为灰白色细短绒毛状，后逐渐变为绿色至橄榄绿色，中部隆起而其他部分平坦，菌丝较短，表面产生大量粉状分生孢子。气生菌丝顶端产生分生孢子梗，梗的顶端1
–
4个分枝，每枝的末端细胞分裂成串的分生孢子，形成典型的帚状分生孢子穗；分生孢子呈球形或近似球形，直径2.5
–
3.0μm，绿色。毡毛青霉dz
‑9‑
67在pda平板培养基上28℃培养3d的菌落照片见图1。
[0010]
所述的毡毛青霉dz
‑9‑
67的rdna核糖体内转录间隔区(rdna
‑
its)核苷酸序列为seq id no.1所示。
[0011]
本发明还提供一种所述毡毛青霉dz
‑9‑
67在杜仲叶总黄酮提取中的应用，所述应用的方法为：杜仲叶粉中加入无菌蔗糖水溶液，接种毡毛青霉dz
‑9‑
67孢子，于28
–
30℃发酵1.5
–
3d，发酵物加入乙醇水溶液中浸提后再进行超声提取，抽滤，滤液浓缩后，获得浓缩物，真空干燥，获得杜仲叶总黄酮粗提物。
[0012]
进一步，所述的无菌蔗糖水溶液浓度为3
–
5g/l，经高压蒸汽121℃灭菌15min，无菌蔗糖水溶液体积用量以杜仲叶粉重量计为1.0
–
1.5ml/g，所述毡毛青霉dz
‑9‑
67孢子接种量以杜仲叶粉重量计为5
×
107–7×
107个/g；所述杜仲叶粉是将成熟的绿色杜仲叶烘干粉碎后过20目筛获得。
[0013]
进一步，所述毡毛青霉dz
‑9‑
67孢子以孢子液的形式加入，所述孢子液的制备方法为：低温保藏的毡毛青霉dz
‑9‑
67接种于马铃薯葡萄糖(pda)平板培养基，于28
–
30℃恒温培养1.5
–
2d后，加入无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；优选将孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为5
×
108–7×
108个/ml。所述的pda平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/l(切成边长约1cm的小方块，煮沸20min后过滤留汁)，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，溶剂为自来水，ph自然(实测6.5左右)。
[0014]
进一步，所述浓缩物的制备方法为：所述的发酵物加入体积浓度50％
–
70％乙醇水溶液中，搅拌均匀后置于60
–
70℃水浴中浸提2
–
4h，然后转入50℃的超声波清洗机中，200
–
300w超声提取30
–
60min；超声醇提结束后，趁热抽滤，将滤液45℃减压浓缩至原体积的1/15
–
1/25，获得浓缩物；所述乙醇水溶液用量以发酵前杜仲叶粉重量计为15
–
25ml/g。
[0015]
进一步，所述真空干燥条件为：50℃、0.1mpa条件下真空干燥至恒重。
[0016]
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在杜仲叶超声乙醇提取总黄酮前，增加了毡毛青霉dz
‑9‑
67的发酵预处理。毡毛青霉dz
‑9‑
67是从杜仲叶的微生物富集物培养物中筛选，并经诱变选育而获得的优良菌株，在杜仲叶粉中适度生长而产生多糖水解酶，水解杜仲叶纤维素、半纤维素和果胶等物质，使得杜仲叶结构组织疏松，在超声乙醇提取时，黄酮化合物更容易溶出。本发明提供的杜仲叶总黄酮提取方法，较不采用发酵预处理的超声乙醇提取法相比，杜仲叶总黄酮的提取得率可以提高34.2％。
(四)附图说明
[0017]
图1毡毛青霉dz
‑9‑
67的菌落形态照片。
[0018]
图2分光光度法测定总黄酮的标准曲线(以芦丁为标准品)。
(五)具体实施方式
[0019]
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0020]
本发明所述的杜仲叶为杜仲科植物杜仲(eucommia ulmoides oliv.)的干燥叶，中药材的拉丁学名为eucommiae folium，在夏秋二季枝叶茂盛时采收，晒干或低温烘干。杜仲叶粉是干燥的杜仲叶经粉碎后过20目筛的细粉。
[0021]
实施例1：发酵菌株的分离和筛选
[0022]
发酵杜仲叶的微生物菌株，按如下步骤分离和筛选：
[0023]
(1)250
‑
ml三角瓶中加入约5g的杜仲叶粉，再加入5ml无菌生理盐水润湿，于28℃恒温培养4d。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1
×
10
‑6、1
×
10
‑7、1
×
10
‑8倍后，分别吸取0.1ml稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(pda)上，于28℃恒温培养2d，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜pda平板培养基，置于28℃恒温培养3d，得纯培养菌株14株，各菌株的编号见表1。
[0024]
(2)14个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入5ml无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为5
×
108个/ml，即为各菌株的孢子液。
[0025]
(3)八层纱布扎口的250
‑
ml三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g的杜仲叶粉，加10ml的浓度为3g/l无菌蔗糖水溶液，再接种1ml上述步骤(2)各菌株的孢子液，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于28℃条件下发酵培养3d。
[0026]
(4)步骤(3)经发酵的全部杜仲叶粉，加入150ml的体积浓度为50％乙醇水溶液，摇匀后置于60℃水浴中浸提2h，然后转入50℃的超声波清洗机中，200w超声提取30min。超声醇提结束后，趁热用布氏漏斗抽滤，hplc法测定滤液中总黄酮含量。
[0027]
同样条件下，以不接种霉菌孢子液作未经发酵的杜仲叶粉对照。杜仲叶粉经不同菌株发酵后，总黄酮的提取得率见表1。
[0028]
表1不同菌株发酵杜仲叶后总黄酮的提取得率
[0029][0030]
由表1数据可以看出，杜仲叶粉经菌株dz
‑
9发酵后，较未经发酵的对照相比，总黄酮的提取得率提高的幅度最高，达到了16.6％，本发明选定该菌株作为提高杜仲叶总黄酮提取得率的发酵菌种。
[0031]
所述的pda平板培养基，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成边长约为1cm的小方块，称取200g，加自来水1000ml，煮沸20min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000ml，加入20g葡萄糖和20g琼脂，ph自然(实测6.5左右)，加热至琼脂溶化后分装于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm的无菌培养皿，每皿15
–
20ml。
[0032]
所述的杜仲叶总黄酮含量采用分光光度法测定，具体方法为：5.0ml杜仲叶总黄酮提取液(视样品中总黄酮浓度高低适当调整取样量，控制测定a
510
＝0.2
–
0.7之间，固体总黄酮粗提物用60％的乙醇水溶液溶解)，于25
‑
ml比色管中，加入质量浓度5％亚硝酸钠(nano2)水溶液1.0ml，静置6min，加质量浓度10％硝酸铝[al(no3)3]水溶液1.5ml，静置6min，加质量浓度20％氢氧化钠(naoh)水溶液4ml，再用体积浓度60％乙醇水溶液定容至25ml，摇匀，放置15min，于510nm处测定吸光度(a
510
)，由芦丁标准曲线计算得样品中总黄酮含量，再由含量乘以测定样品的体积得总黄酮质量。
[0033]
芦丁标准曲线的绘制：用体积浓度60％乙醇水溶液配制浓度为0.2g/l的芦丁标准品溶液。分别取芦丁标准品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于25ml比色管中，用体积浓度60％的乙醇水溶液补充至5.0ml，加入质量浓度5％亚硝酸钠水溶液1.0ml，静置6min，加质量浓度10％硝酸铝水溶液1.5ml，静置6min，加质量浓度20％氢氧化钠水溶液4ml，再用体积浓度60％乙醇水溶液定容至25
‑
ml，摇匀，放置15min，在510nm处测定吸光度(a
510
)。以芦丁浓度为横坐标，a
510
为纵坐标绘制标准曲线(图2)。
[0034]
所述的杜仲叶总黄酮提取得率按以下公式计算：
[0035][0036]
实施例2：发酵菌株dz
‑
9的诱变选育
[0037]
对菌株dz
‑
9进行诱变育种，筛选发酵性能优良的菌株，具体方法为：
[0038]
(1)孢子液的制备：菌株dz
‑
9经pda平板培养基28℃活化培养2d后，加5ml无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮后，转入含45ml无菌生理盐水的三角瓶中(加有20
–
30粒玻璃珠)，室温振荡20min。孢子悬液经过滤除去菌丝(三角漏斗垫2层擦镜纸)，在显微镜下用血球计数板对悬液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量在1
×
108个/ml。
[0039]
(2)诱变：在红光照明下，分别取2.0ml上述孢子悬液和一枚无菌回形针于5只直径6cm的培养皿中，培养皿分别置于磁力搅拌器上，在预热30min的15w紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5min。取0.5ml上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移取0.1ml涂布pda平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的pda平板用黑布包裹，倒置于28℃培养1.5d，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。
[0040]
(3)筛选：挑取致死率在90％以上pda平板上的菌落转接新鲜pda平板培养基上，按实施例1所述的方法，对突变菌株进行筛选。经过2轮筛选，从85个菌株中筛选获得一株编号为dz
‑9‑
67的菌株，对提高杜仲叶总黄酮提取得率的发酵性能最好。用该菌株发酵杜仲叶后，总黄酮的提取得率为9.72％，较出发菌株dz
‑
9的8.56％提高了13.6％，较未经发酵对照的7.34％提高了32.4％。dz
‑9‑
67菌株经过转接传代5次，每代发酵杜仲叶后的总黄酮提取得率波动范围小于10％，说明该菌株遗传稳定性良好。
[0041]
实施例3：菌株dz
‑9‑
67的分类鉴定
[0042]
菌株dz
‑9‑
67接种在pda平板培养基上，28℃培养3d，菌落初期为灰白色细短绒毛状，后逐渐变为绿色至橄榄绿色，中部隆起而其他部分平坦，菌丝较短，表面产生大量粉状分生孢子。气生菌丝顶端产生分生孢子梗，梗的顶端1
–
4个分枝，每枝的末端细胞分裂成串的分生孢子，形成典型的帚状分生孢子穗；分生孢子呈球形或近似球形，直径2.5
–
3.0μm，绿色。毡毛青霉dz
‑9‑
67在pda平板培养基上28℃培养3d的菌落照片见图1。
[0043]
将菌株dz
‑9‑
67交由生工生物工程(上海)有限公司测得其核糖体its区rdna核苷酸序列为seq id no.1所示，该序列在ncbi(national center for biotechnology information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行blast比对，与5株已知的毡毛青霉(penicillium velutinum)有大于99％的同源性。根据菌株dz
‑9‑
67菌落特征和rdna
‑
its核苷酸序列比对结果，可以确定菌株dz
‑9‑
67的生物学分类位置为(参考mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(fungi)，子囊菌门(ascomycota)，散囊菌纲(eurotiomycetes)，散囊菌目(eurotiales)，曲霉科(aspergillaceae)，青霉属(penicillium)，毡毛青霉(penicillium velutinum)。
[0044]
its区rdna序列为：
[0045]
tcccacccgtgtttatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgcctcacggccgccggggggcttctgccctctggcccgcgcccgccgaagacaccattgaacgctgtctgaagattgcagtctgagcaattagctaaataagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgtgaatt
gcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccttggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggccccgtcctccttcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggcttcgtcttccgctcttgtaggcccggccggcgcttgccgacaacaatcaatcttttttcaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaactt。
[0046]
综上，从杜仲叶粉的微生物富集物中分离的菌株dz
‑
9，经紫外线诱变后，筛选获得了菌株dz
‑9‑
67，即毡毛青霉(penicillium velutinum)dz
‑9‑
67，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmcc no:61728，保藏日期2021年6月21日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
[0047]
实施例4：毡毛青霉dz
‑9‑
67应用于杜仲叶总黄酮的提取
[0048]
毡毛青霉dz
‑9‑
67应用于杜仲叶总黄酮的提取，可以按以下步骤操作：
[0049]
(1)低温保藏的毡毛青霉dz
‑9‑
67(冻干管或平板菌落)接种于新鲜pda平板培养基，于30℃恒温培养2d，加5ml的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为5
×
108个/ml。所述的pda平板培养基成分和配制方法同实施例1。
[0050]
(2)八层纱布扎口的250
‑
ml三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g的杜仲叶粉，加10ml的浓度为3g/l无菌蔗糖水溶液，接种1ml步骤(1)制备的毡毛青霉dz
‑9‑
67的孢子液(孢子接种浓度为5
×
107个/g)，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于30℃条件下培养2d，得发酵物。
[0051]
(3)步骤(2)全部发酵物，加入150ml的体积浓度50％的乙醇水溶液，搅拌均匀后置于60℃的水浴中浸提2h，然后转入50℃超声波清洗机中，200w超声提取30min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液45℃减压浓缩至10ml，获得总黄酮浓缩物。
[0052]
(4)步骤(3)的全部浓缩物于50℃、0.1mpa条件下真空干燥10h至恒重，研磨成细粉，得杜仲叶总黄酮粗提物。
[0053]
按上述步骤，得杜仲叶总黄酮粗提物3.91g，总黄酮含量为24.6％，即得到杜仲叶总黄酮0.963g，提取得率为9.63％，产品为深棕色粉状物。
[0054]
实施例5：毡毛青霉dz
‑9‑
67应用于杜仲叶总黄酮的提取
[0055]
毡毛青霉dz
‑9‑
67应用于杜仲叶总黄酮的提取，可以按以下步骤操作：
[0056]
(1)低温保藏的毡毛青霉dz
‑9‑
67(冻干管或平板菌落)接种于新鲜pda平板培养基，于30℃恒温培养1.5d，加5ml的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为6
×
108个/ml。所述的pda平板培养基成分和配制方法同实施例1。
[0057]
(2)八层纱布扎口的250
‑
ml三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g的杜仲叶粉，加12.5ml的浓度为4g/l无菌蔗糖水溶液，接种1ml步骤(1)制备的毡毛青霉dz
‑9‑
67的孢子液(孢子接种浓度为6
×
107个/g)，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于30℃条件下培养2.5d，得发酵物。
[0058]
(3)步骤(2)全部发酵物转入500
‑
ml的三角瓶中，加入200ml的体积浓度60％的乙醇水溶液，搅拌均匀后置于65℃的水浴中浸提3h，然后转入50℃超声波清洗机中，250w超声提取45min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液45℃减压浓缩至10ml，获得总黄酮浓缩物。
[0059]
(4)步骤(3)的全部浓缩物于50℃、0.1mpa条件下真空干燥10h至恒重，研磨成细粉，得杜仲叶总黄酮粗提物。
[0060]
按上述步骤，得杜仲叶总黄酮粗提物3.37g，总黄酮含量为29.3％，即得到杜仲叶总黄酮0.988g，提取得率为9.88％，产品为深棕色粉状物。
[0061]
实施例6：毡毛青霉dz
‑9‑
67应用于杜仲叶总黄酮的提取
[0062]
毡毛青霉dz
‑9‑
67应用于杜仲叶总黄酮的提取，可以按以下步骤操作：
[0063]
(1)低温保藏的毡毛青霉dz
‑9‑
67(冻干管或平板菌落)接种于新鲜pda平板培养基，于28℃恒温培养1.5d，加5ml的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为7
×
108个/ml。所述的pda平板培养基成分和配制方法同实施例1。
[0064]
(2)八层纱布扎口的250
‑
ml三角瓶于160℃干热灭菌2h，加入10g的杜仲叶粉，加15ml的浓度为5g/l无菌蔗糖水溶液，接种1ml步骤(1)制备的毡毛青霉dz
‑9‑
67的孢子液(孢子接种浓度为7
×
107个/g)，搅拌均匀。三角瓶用八层纱布扎口，于28℃条件下培养3d，得发酵物。
[0065]
(3)步骤(2)全部发酵物转入500
‑
ml的三角瓶中，加入250ml的体积浓度70％的乙醇水溶液，搅拌均匀后置于70℃的水浴中浸提4h，然后转入50℃超声波清洗机中，300w超声提取60min。超声醇提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液45℃减压浓缩至10ml，获得总黄酮浓缩物。
[0066]
(4)步骤(3)的全部浓缩物于50℃、0.1mpa条件下真空干燥10h至恒重，研磨成细粉，得杜仲叶总黄酮粗提物。
[0067]
按上述步骤，得杜仲叶总黄酮粗提物2.86g，总黄酮含量为36.4％，即得到杜仲叶总黄酮1.04g，提取得率为10.4％，产品为深棕色粉状物。
[0068]
如不经本实施例步骤(1)和步骤(2)的发酵过程，其他步骤按本实施例方法，10g的杜仲叶粉可提取获得杜仲叶总黄酮粗提物2.43g，总黄酮含量为31.9％，即得到杜仲叶总黄酮0.775g，提取得率为7.75％，产品为深棕色粉状物。可见，在杜仲叶总黄酮超声乙醇提取前，增加了毡毛青霉dz
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67的发酵预处理，较不采用发酵预处理的常规方法相比，杜仲叶总黄酮的提取得率可以提高34.2％。