一种利用球孢白僵菌芽生孢子提高植物抗病性的方法与流程

1.本发明涉及植物生长调节和病害防治技术领域，具体涉及一种利用球孢白僵菌芽生孢子促进植物生长提高抗病性的方法。


背景技术：

2.球孢白僵菌(beauveria bassiana)是一种广谱生防真菌，近年来研究表明，球孢白僵菌不仅具有杀虫作用，还能够在植物中内生定殖，实现促生、抗逆的效应。球孢白僵菌根据培养条件不同，具有气生孢子(aerogenic spore)、芽生孢子(blastospores)及深层孢子(submerged conidia)三种不同形态的孢子，其中气生孢子是白僵菌生防制剂的主要来源，且目前针对白僵菌植物内生性进行生物防治研究与利用全部采用气生孢子。但由于气生孢子具有极强的疏水性，在液体剂型创制方面受到极大的限制，这也是白僵菌这一优异生防制剂进一步推广应用的瓶颈问题。芽生孢子和深层孢子具有亲水性，在液体剂型研发和应用方面更具有优势，但目前尚未见到对于芽生孢子和深层孢子内生定殖及诱导植物抗性方面相关研究与应用的报道。芽生孢子较深层孢子更加易于大量培养，在生产上更具有较大的应用潜力。
3.灰霉菌(botyrtis cinerea)是一种存在较为普遍、寄主范围广泛的腐生型植物病原真菌，它能够杀死植物组织并利用死亡的组织获取营养供给自身的生长。灰霉菌能够引起至少200多种植物的严重病害，其中包括葡萄、番茄、草莓、莴苣、拟南芥等。在作物收获前，它能引起植物倒伏、落叶等；收获后还能造成烂果、产量降低等现象。灰霉菌主要是以菌核或分生孢子的形式在土壤或感病植株中越冬越夏，在适宜的条件下，孢子能够随着气流、雨水进行传播扩散，主要是通过伤口或柱头侵染植物，并且温暖湿润的环境容易引起灰霉病的流行和危害，尤其是在温度范围为20℃～30℃，相对湿度在95％以上的条件下，造成灰霉病病害流行的可能性更大。灰霉病起初只是在欧洲和美洲流行，直至20世纪80年代才开始在我国逐渐蔓延，但随着近年来大量地种植单一农作物，灰霉病已成为一种影响农业生产的世界性病害。灰霉病是设施番茄上最重要的病害。该病害可危害花、茎、叶、果实，在发病部位形成灰色霉状物，容易造成烂果，对保护地番茄的生产造成了极大的威胁。番茄常年产量损失为20％左右，重病年份为50％左右。目前，番茄生产缺少抗病品种，番茄灰霉病主要依靠化学防治但化学农药的大量使用，导致病菌严重的抗药性、农药残留和环境污染。灰霉病的流行严重影响了番茄的产量和品质。
4.尽管已经筛选到一些对病害具有生防作用的微生物，但还远远不够。一方面，生防中抗病微生物的多样化使用有利于防止病菌产生抗性，所以对病菌具有抗性作用的微生物的种类多多益善；另一方面，这些抗病微生物很少能侵入到植物中，持效期短，且在植物中成功定殖更是少之又少，难以实现病害的长效控制。利用球孢白僵菌芽生孢子，不仅可以有效改善球孢白僵菌制剂水溶性，更增加了球孢白僵菌内生定殖效率，伴随植株生长，为宿主植株提供全天候保护。内生定殖的球孢白僵菌芽生孢子对宿主植株具有很好地促生抗病作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提出一种利用球孢白僵菌芽生孢子促进植物生长提高抗病性的方法，利用富营养液体培养基扩增球孢白僵菌芽生孢子，在此基础上创制球孢白僵菌芽生孢子液剂，利用该液剂对植物幼苗进行灌根处理处理，通过球孢白僵菌芽生孢子在植株体内的定殖，实现促进作物生长、降低灰斑病发病率，进而增加作物产量。
6.本发明的技术方案是这样实现的：
7.本发明提供一种球孢白僵菌，所述球孢白僵菌的16s rdna含有如seq idno：1所示的序列，所述球孢白僵菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.19372。
8.本发明进一步保护一种利用球孢白僵菌芽生孢子促进植物生长提高抗病性的方法，利用上述的球孢白僵菌芽生孢子灌根处理植株幼苗，通过球孢白僵菌在植株体内的定殖，促进植物生长、降低病害发病率，进而增加作物产量。
9.作为本发明的进一步改进，球孢白僵菌需经富营养液体培养基处理16h～ 200h，优选48h，期间球孢白僵菌以芽生孢子形态大量增殖。
10.作为本发明的进一步改进，将含有所述球孢白僵菌的菌剂施于植株上，使所述球孢白僵菌在植株上定殖，促进植物生长、抑制病害发生。
11.作为本发明的进一步改进，将含有所述球孢白僵菌芽生孢子的菌剂灌根处理植物幼苗。
12.作为本发明的进一步改进，所述菌剂为所述球孢白僵菌芽生孢子与含有助悬剂的纯净水配成的悬浮液。
13.作为本发明的进一步改进，所述悬浮液中球孢白僵菌芽生孢子的浓度为107个孢子/ml～109个孢子/ml(优选1
×
108个孢子/ml)，所述助悬剂浓度为0.01～ 0.1％(w/v，优选0.05％)，所述助悬剂选自吐温
‑
20、吐温
‑
80、曲拉通
‑
x100(可以是所有无毒表面活性剂)中的一种或几种混合。
14.作为本发明的进一步改进，所述灌根处理的方法为：在无雨的早上或夜间将 10ml～60ml(优选25ml)配制好的芽生孢子悬液浇灌到每株玉米幼苗根部。
15.作为本发明的进一步改进，所述玉米幼苗处于2～3叶苗期。
16.作为本发明的进一步改进，所述灌根处理的方法为：在无雨的早上或夜间将 10ml～60ml(优选25ml)配制好的芽生孢子悬液浇灌到每株玉米幼苗根部。
17.本发明进一步保护一种生防制剂，为上述的应用中的悬浮剂。
18.本发明具有如下有益效果：本发明的一株球孢白僵菌具有促进作物生长、提高宿主植株对灰斑病抗性的双重生活学功能；利用富营养液体培养基扩增球孢白僵菌芽生孢子，不仅可以有效改善球孢白僵菌制剂水溶性，更增加了球孢白僵菌内生定殖效率，为宿主植株提供更加持久的保护。内生定殖的球孢白僵菌芽生孢子对宿主植株具有很好的促生抗病作用，能够更好地满足农业生产中防治灰斑病的要求。
19.本发明的目的在于提出一种利用球孢白僵菌芽生孢子促进植物生长提高抗病性的方法，利用富营养液体培养基扩增球孢白僵菌芽生孢子，在此基础上创制球孢白僵菌芽生孢子液剂，利用该液剂对植物幼苗进行灌根处理处理，通过球孢白僵菌芽生孢子在植株体内的定殖，实现促进作物生长、降低灰斑病发病率，进而增加作物产量。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1白僵菌芽生分生孢子不同培养时间的生长特征(100
×
视野)；
22.图2不同时间下芽生孢子浓度的测定；
23.图3芽生孢子在拟南芥不同部位48h的定殖情况：(a)根部；(b)茎部； (c)叶片；
24.图4芽生孢子在拟南芥不同部位72h的定殖情况：(a)根部；(b)茎部； (c)叶片；
25.图5芽生孢子在拟南芥叶片中96h、120h及144h的定殖情况：(a)96h； (b)120h；(c)144h；
26.图6不同处理拟南芥叶片接种灰霉菌第4天感病症状：control：拟南芥叶片不接白僵菌和灰霉菌；bc：拟南芥叶片接灰霉菌；bb1 bc：拟南芥叶片接白僵菌气生孢子和灰霉菌；bb2 bc：拟南芥叶片接白僵菌芽生孢子和灰霉菌；
27.图7不同处理拟南芥叶片接种灰霉菌第7天感病症状；
28.图8白僵菌气生分生孢子和芽生孢子定殖对拟南芥接种灰霉菌4～7天发病率的影响；
29.图9拟南芥叶片接种灰霉菌第4～7天病斑直径分析。不同字母代表不同实验处理之间的差异显著性。
具体实施方式
30.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1球孢白僵菌菌株bbcsjl1芽生孢子培养及芽生孢子悬液定殖植物后促生抗病能力鉴定
32.实验材料
33.1.1供试菌种
34.本实验使用的菌种为球孢白僵菌bbcsjl1菌株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmcc no.19372。
35.1.2供试植物
36.本实验使用的植物为拟南芥(arabidopsis thaliana)野生型(columbia，col
‑
0)。
37.1.3供试病原菌
38.灰霉菌(botrytis cinerea)分离自拟南芥植株。
39.实验方法
40.2.1sdy(富营养)液体培养基的配制
41.蛋白胨5g、酵母粉5g、葡萄糖20g、加水定容至500ml，121℃高压灭菌 20min后，将其取出放置在超净工作台内，向培养基中加入2.5ml稀释后的草铵膦，混合摇匀，放在4℃冰
箱中备用。
42.2.2球孢白僵菌芽生孢子的培养
43.将提前制备的20ml sdy液体培养基倒入50ml灭菌后的三角瓶中，使用6 mm菌饼器在pda平板培养基左右两侧(距中央1/2处)各打下2块菌饼，将其接种至三角瓶中，并放置在温度25℃、转速200rpm的摇床内进行培养。
44.2.3球孢白僵菌芽生孢子的形态观察
45.放入摇床24h后开始计时，每隔12h，将sdy液体培养基从摇床内取出放置在超净工作台内，从中各吸取一滴放在载玻片上，盖上盖玻片，将边缘溢出液体使用擦镜纸吸净。将盖玻片倒置，置于激光共聚焦显微镜下，在显微镜中找到清晰的孢子视野后，选择gfp 488nm激光发射波段，将显微镜中呈现的视野与电脑显示屏同步，调节焦距，选择清晰且具有代表性的孢子形态进行拍照留存。
46.2.4球孢白僵菌芽生孢子的收集
47.待芽生孢子大量富集，使用5层左右的无菌擦镜纸和漏斗进行过滤，将滤液收集到无菌的50ml离心管中。将离心管放入离心机中进行离心，离心条件为 12000rpm转速下离心5min，弃上清，取沉淀。
48.2.5球孢白僵菌芽生孢子悬液的制备
49.首先配制浓度为0.05％的吐温
‑
80悬液，吸取4ml的吐温
‑
80试剂，定容至 800ml，121℃高压灭菌20min，再将灭菌后的吐温
‑
80溶液放置在超净工作台内，待冷却后倒入含芽生孢子的离心管中，充分混匀。使用血球计数板计数，将以上三种孢子悬液的浓度定为1
×
108个孢子/ml。
50.2.6拟南芥的播种和移栽
51.首先，取无菌的培养土平铺在培养皿内，土壤厚度不宜过薄，之后向土壤中浇水，使土壤充分浸湿即可。取适量拟南芥种子均匀播种在土壤表面，放入温度为26℃，光照12h的人工气候室进行培养。培养一周后，将拟南芥进行移栽，移栽至规格为3
×
7的方格育苗盘中，继续放入人工气候室内培养，培养至4～5周。但由于拟南芥不耐干旱，在种植过程中要注意留意缺水情况，前期拟南芥幼苗小而弱，建议将水注入底部托盘内，避免损伤幼苗。
52.2.7球孢白僵菌芽生孢子悬液的接种
53.在移栽后第5周采用灌根法，将提前制备好的芽生孢子悬液充分混匀，使用 10ml注射器将孢子悬液注入根系表层土壤接种，注意要避开与叶片的接触，白僵菌接种拟南芥的量为10ml/株。
54.2.8球孢白僵菌在拟南芥中的定殖观察
55.为确保白僵菌孢子充分定殖进入到拟南芥植株中，我们在白僵菌接种12h 后开始进行观察。首先我们使用酒精消毒后的剪子，将植株的根、茎、叶组织分别剪下，依次放入1％次氯酸钠、70％无水乙醇、无菌水中进行表面消毒，取适量大小的植物组织放在载玻片中央(植物组织如果较厚，可以用无菌手术刀进行切片处理)。在载玻片上滴入一滴水，盖上盖玻片，放入激光共聚焦显微镜下，在显微镜中找到清晰的植物组织视野，同步到电脑显示屏，经过x轴、y轴和焦距的调整，直至找到带有绿色荧光标记的孢子图像，进行拍照留存。
56.2.9拟南芥生长情况分析
57.在移栽后第5周采用灌根法对拟南芥进行处理，并设置3个处理：纯水对照组、
0.05％的吐温
‑
80的溶液处理组和球孢白僵菌芽生孢子悬液处理组。2周后对株高、地上部分和地下部分的鲜重进行测量。每个处理20株，重复3次。
58.2.10灰霉菌接种拟南芥
59.在球孢白僵菌接种12h后，我们使选取长势良好、大小相近的5周～6周拟南芥植株，使用无菌的剪子将其叶片取下，每4个叶片均匀地放置在琼脂培养基中，并将叶柄插入培养基内。取出制备好的灰霉菌孢子悬液，混合摇匀，在每个叶片左右两侧各滴加5μl灰霉菌孢子悬液(避开叶脉)。将接种完成后的琼脂平板盖好，在平板周围缠上湿润的卫生纸加强保湿。前24h，将其放置在25℃，黑暗处培养(高湿度和暗培养利于灰霉菌的生长和侵染)。之后，将其放置在温度25℃，周期16h光照/8h黑暗的条件下培养(对照置于相同条件下培养)，进行叶片的发病率统计以及病斑的观察。
60.2.11拟南芥发病率统计方法
61.待叶片发病后，每一天观察记录每个处理中叶片的发病情况，记录发病的叶片总数及观察的总叶片数，其两者的比值即为植物叶片的发病率。
62.2.12拟南芥病斑测量方法
63.待叶片发病后，使用游标卡尺在叶片病斑处进行测量，取垂直和水平直径长度，计算出二者的均值即为病斑直径的长度。
64.实验结果
65.3.1不同培养时间下芽生孢子的形态观察
66.培养至36h时，菌丝上已长出孢子梗，但菌丝数量较少；培养至48h时，菌丝数量有所增加；培养至60h时，培养基中开始出现圆柱形的孢子，即芽生孢子；培养至72h时，芽生孢子的数量增多；培养至84h时，孢子量较密集，孢子和菌丝交错在一起，并且出现少许卵形孢子；培养至96h时，卵形孢子开始增加，圆柱形孢子有所减少；培养至108h时，孢子数量达到最大，圆柱形孢子和卵形孢子相叠加，菌丝量很少；培养至120h时，孢子量和菌丝量均减少；而132 h时，菌丝量呈明显增加现象，如图1所示。
67.3.2不同培养时间下芽生孢子的浓度测定
68.研究结果表明，白僵菌芽生孢子在36h至84h之间，随着时间发展，孢子数量逐渐增多。培养至36h时，孢子浓度约8.5
×
105个/ml；培养至48h时，孢子浓度约1.3
×
106个/ml；培养至60h时，孢子浓度约5.6
×
106个/ml；培养至72 h时，孢子浓度约4.5
×
107个/ml；培养至84h时，孢子浓度约2.5
×
108个/ml；培养至96h时，孢子数量有所减少，孢子浓度约2.2
×
108个/ml；培养至108h 时，孢子数量增加，并达到孢子最大量，孢子浓度约4.0
×
108个/ml；而培养至 120h和132h，孢子数量再次减少，孢子浓度为3.2
×
108和3.15
×
108个/ml，如图 2所示。
69.3.3球孢白僵菌芽生孢子在拟南芥中的定殖
70.在48h时，在拟南芥的根部、茎部和叶片均可以观察到清晰的圆柱形孢子即芽生孢子，如图3所示。
71.72h时，根部孢子数量较上一时期有所减少，叶片中孢子数量明显增加，孢子主要集中分布在茎部和叶片，并且我们在叶片中观察到，大部分芽生孢子均匀地排列在细胞间隙中，如图4所示。
72.96h时，我们观察到在叶片中部分芽生孢子有萌发的现象；120h时芽生孢子大量富
集在叶片中，均匀地排列在细胞间隙中；144h时，芽生孢子已生长成菌丝，菌丝形态清晰可见，如图5所示。
73.3.5球孢白僵菌芽生孢子对拟南芥生长的影响
74.处理2周后，纯水对照组与0.05％的吐温
‑
80的溶液处理组植株没有明显的差异，而球孢白僵菌芽生孢子悬液组中植株株高、地上鲜重及根鲜重都显著高于前两组，这表明球孢白僵菌芽生孢子悬液对植株具有明显的促生作用。
75.表1 球孢白僵菌芽生孢子对拟南芥生长的影响
[0076][0077]
3.4拟南芥叶片离体接种灰霉菌
[0078]
在接种灰霉菌第4天时，除对照组外，其余三个接种灰霉菌处理的拟南芥叶片均表现出不同程度的萎蔫、黄化，其中使用白僵菌接种的两个处理其叶片发病数和发病程度均低于只接种灰霉菌的处理，如图6所示。
[0079]
在接种灰霉菌第7天时，只接种灰霉菌的叶片出现大面积褐色病斑；接种白僵菌气生孢子的叶片病斑大小也有所增加；接种白僵菌芽生孢子的叶片发病症状也逐渐加重，发病个数有所增加，如图7所示。
[0080]
3.5拟南芥叶片离体接种灰霉菌发病率
[0081]
研究发现，除对照组外，其余三个处理的叶片发病率均随着时间的发展而增加。其中白僵菌芽生孢子对灰霉菌的侵染具有明显的抑制效果，例如在接种灰霉菌第6天时，只接种灰霉菌的拟南芥叶片发病率超过70％，而接种了白僵菌芽生孢子的叶片发病率低于45％。在接种灰霉菌第7天时，只接种灰霉菌的拟南芥叶片发病率高达90％，而接种了白僵菌芽生孢子的叶片发病率为65％。除此之外，白僵菌气生孢子对灰霉菌的侵染也有一定的延缓作用，在接种灰霉菌后的四天时间里，其叶片发病率均低于只接种灰霉菌的叶片发病率。如图8所示。
[0082]
3.6拟南芥叶片离体接种灰霉菌病斑大小
[0083]
除对照组外，其余三个接种灰霉菌处理的叶片随着时间的发展均表现出病斑增大的趋势。在接种灰霉菌后的四天时间里，使用白僵菌定殖后的病斑均小于只接种灰霉菌的叶片病斑，尤其是接种白僵菌芽生孢子后的作用效果最为显著，如图9所示。
[0084]
实施例2球孢白僵菌芽生孢子悬液对番茄促生抗病能力鉴定
[0085]
1材料和方法
[0086]
实验材料
[0087]
1.1供试菌种
[0088]
本实验使用的菌种为球孢白僵菌bbcsjl1菌株，保存于中国微生物菌种保藏管理
委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmcc no.19372。
[0089]
1.2供试植物
[0090]
本实验使用的植物为精品红柿王，购于吉林省李白种业有限公司。
[0091]
1.3供试病原菌
[0092]
灰霉菌(botrytis cinerea)分离自番茄植株。
[0093]
实验方法
[0094]
2.1球孢白僵菌芽生孢子悬液的制备
[0095]
同实施例1。
[0096]
2.2灰霉菌孢子悬液的制备
[0097]
同实施例1。
[0098]
2.3实验设置
[0099]
小区实验于2020年4月3日至7月20日在双阳区蔬菜种植户张春峰温室(n43
°
35
′
44
″
，e 125
°
37
′
22
″
)进行。
[0100]
番茄幼苗移栽后21d后进行实验。实验共分为3组：对照组(control)、接种灰霉菌处理组(bc)和球孢白僵菌芽生孢子悬液 接种灰霉菌处理组(bb bc)。在bb bc组中番茄根部灌入25ml球孢白僵菌芽生孢子悬液，其他组分别灌入 25ml 0.05％吐温
‑
80水溶液。24h后，对bc组和bb bc组采用毛笔涂抹法接种灰霉菌(孢子浓度约为2
×
105个孢子/ml)。在同一温室内进行随机区组实验，每组2垄(36株)，每个处理重复5次。采用常规管理方式。
[0101]
2.4球孢白僵菌芽生孢子悬液对番茄植株生长的影响
[0102]
盆栽试验处理后14d，收获番茄植株，测量地上部生物量和根部生物量，。
[0103]
2.5球孢白僵菌芽生孢子悬液对番茄灰霉病的防治效果
[0104]
调查各小区处理50d后番茄植株发病率、病情指数及病果率，计算防治效果。番茄灰霉病的分级标准及药效计算方法按照《农药田间药效试验准则》进行。
[0105]
2.6数据分析
[0106]
采用wps进行数据统计分析。
[0107]
3实验结果
[0108]
3.1球孢白僵菌芽生孢子悬液对番茄植株生长的影响
[0109]
从表2可见
[0110]
表2 球孢白僵菌芽生孢子悬液对番茄植株生长的影响
[0111]
处理地上鲜重(g)根鲜重(g)control304.74
±
10.7640.41
±
3.85bc280.93
±
8.3334.26
±
5.71bb bc330.51
±
12.1445.44
±
5.67
[0112]
3.2球孢白僵菌芽生孢子悬液对番茄灰霉病的防治效果
[0113]
从表3可知，接种灰霉菌处理组(bc)发病率和病情指数分别高达74.9％和 45.3，施用球孢白僵菌芽生孢子悬液处理组(bb bc)抑制了灰霉病的发生，其发病率和病情指数分别为23.7％和9.6％，相对防治效果达到68.4％。
[0114]
表3 球孢白僵菌芽生孢子悬液对番茄灰霉病的防治效果
[0115]
处理发病率(％)病情指数防效(％)
control00
‑
bc74.945.3
‑
bb bc23.79.668.4
[0116]
与现有技术相比，本发明的一株球孢白僵菌具有田间防治水稻二化螟和玉米螟，并且提高玉米植株对玉米螟的抗虫和对玉米大斑病的抗病双重生物防治能力，并易于定殖到玉米植株内，为玉米提供持久抗性。本发明利用这株球孢白僵菌对水稻二化螟、玉米螟和玉米大斑病进行生物防治，是一种高效稳定的水稻二化螟、玉米螟和玉米大斑病生物防治方法，其利用了所述球孢白僵菌在玉米种子萌发期、苗期上易于定殖且与玉米共同作用提高了玉米植株对玉米螟和玉米大斑病菌抗性的特点，能够更好地满足农业生产中防治玉米玉米螟和玉米大斑病的要求。
[0117]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。