一种日本鳗鲡抗菌肽Cathelicidin2基因启动子及其应用的制作方法

一种日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子及其应用。


背景技术：

2.抗菌肽(antimicrobial peptides，amps)是一类具有生物活性的小分子多肽，是机体先天性免疫防御系统的重要组成部分，能够对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、病毒和寄生虫等均具有较好抑制或杀伤作用，在天然免疫应答反应中发挥重要作用[chung,c.
‑
r.,j.
‑
h.jhong,z.wang,w.chen,wan,horng and t.
‑
y.lee(2020)."characterization and identification of natural antimicrobial peptides on different organisms."international journal of molecular sciences 21:986.]。鱼类与哺乳动物等高等脊椎动物一样，具有先天性免疫和适应性免疫系统。抗菌肽作为鱼类先天性免疫系统的重要组成部分，当鱼体受到损伤或病原微生物侵袭时，能够迅速产生并在体内扩散以起到防御和杀伤作用。鱼类抗菌肽主要由cathelicidins、肝脏表达抗菌肽
‑
2(liverexpressed antimicrobial peptide 2,leap
‑
2)、piscidins、β
‑
defensins、hepcidins、以及nklysins组成[齐志涛,徐杨,邹钧,聂品(2020)."水产动物抗菌肽研究进展."水产学报44(09):1572
‑
1583.]。
[0003]
cathelicidin是目前发现的一个最大抗菌肽家族，具有广谱抗病原微生物的作用，对革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌、病毒和原生动物都有很好的杀灭效果。研究表明人类仅有一个cathelicidin基因，而其他哺乳动物和鱼类含有多个cathelicidin基因。鱼类cathelicidin结构同哺乳动物一样，包括信号肽(pre区域)、pro区域以及c端成熟肽三个区域，但所含氨基酸数目有所不同。目前在日本鳗鲡、虹鳟(oncorhynchus mykiss)以及大西洋鲑(salmo salar)、美洲红点鲑(salvelinus fontinalis)鉴定出cathelicidin1和cathelicidin2两种抗菌肽，在香鱼(plecoglossus altivelis)和茴鱼(thymallus thymallus)鉴定出cathelicidin2一种抗菌肽，而在大西洋鲟(gadus morhua)鉴定出cathelicidin1、cathelicidin2、cathelicidin3三种抗菌肽[张东玲，关瑞章(2013)."鱼类cathelicidin抗菌肽的研究进展."集美大学学报(自然科学版)18(06):413
‑
419.]。但有关鱼类抗菌肽cathelicidin2启动子的研究仅在虹鳟中有所报道[赵紫霞，许建，江炎亮，白庆利，蒋立坤，陈葆华，徐鹏(2018)."虹鳟免疫诱导型基因cathelicidin2启动子功能分析."渔业科学进展39(04):37
‑
45.]。该研究成功构建了虹鳟pgl3
‑
cathelicidin2启动子荧光素酶表达载体，当且发现nf
‑
κb转录因子能够增强该启动子活性，但其荧光素酶表达载体是否被病毒、细菌等病原微生物进行诱导表达的免疫调控的机制尚未见报道。
[0004]
基因的表达调控已成为分子生物学研究领域的热点，启动子是基因表达调控的重要元件。鉴于鱼类cathelicidin2在抗细菌和病毒免疫及其病害防治中的重要性，研究其基因表达调控机制将为通过调节cathelicidin2的表达来防治鱼类细菌和病毒病提供新的思路。启动子是决定基因表达及其调控的关键因素，为研究鱼类cathelicidin2基因的表达调
控机制，我们通过日本鳗鲡cathelicidin2开放阅读框序列与基因组序列比对分析获得可能的日本鳗鲡cathelicidin2基因5
′
侧翼调控区序列，经过引物设计pcr克隆验证获得日本鳗鲡cathelicidin2基因启动子序列，分析表明该启动子具有已经报道的虹鳟cathelicidin2启动子中的c/ebpalp、nf
‑
kappab、gata、gaaa的转录结合位点，但缺失了crebp、maff、hre转录结合位点，并存在其特有的ap1、ap
‑
2、c
‑
jun、c
‑
fos、sp1、nf
‑
mue1、ftz、rap1、usf、myod等转录因子结合位点，显示日本鳗鲡cathelicidin2基因启动子序列种属特异性。经报告基因检测实验证明了该日本鳗鲡cathelicidin2基因启动子具有较强的启动子活性，能够被革兰氏阴性菌表明重要抗原lps、水产生物重要病原菌嗜水气单胞菌以及人工合成双链rna poly i:c诱导表达。
[0005]
因此，该日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子的克隆及其强启动子活性的诱导表达分析，为研究日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因的表达调控机制、鱼类抵御病原菌感染的天然免疫应答机制、特别是重要的鱼类炎症相关nf
‑
κb和mapk信号通路网络调控机制的研究提供良好的实验系统，在应用方面为利用该启动子构建表达载体高效表达外源基因或将该启动子应用于转基因鱼构建创造条件，具有重要的理论和实际意义。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子及其应用，解决了上述背景技术中的问题。
[0007]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：提供了日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子，其核苷酸序列如seq id no：1所示。
[0008]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：提供了含有上述启动子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
[0009]
优选地，所述表达盒由上述的启动子、由上述启动子启动转录的目的基因和终止子组成。
[0010]
优选地，所述重组载体为pgl3
‑
basic、pgl2
‑
basic、pgl4.10、pgluc。
[0011]
优选地，所述重组菌为大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、酵母菌。
[0012]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：提供了上述日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子在构建真核表达载体、鱼类细胞或哺乳动物细胞中高效表达外源基因中的应用。
[0013]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：提供了上述日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子在构建转基因鱼中的应用。
[0014]
本发明具有如下有益效果：本技术人成功克隆获得了日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子。本发明通过日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因开放阅读框第一外显子序列比对分析日本鳗鲡基因组，采用降落pcr方法对分析预测抗菌肽cathelicidin2基因5’侧翼区序列进行克隆，获得了日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子序列；经报告基因分析实验证明日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子可被革兰氏阴性菌大肠杆菌重要表面抗原lps以及水产动物重要致病菌嗜水气单胞菌诱导激活。因此，该日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子的克隆及其强启动子活性的验证，在理论上将为研究鱼类抗菌肽cathelicidin2基因的表达调控机制以及重要的鱼类炎症相关功能
基因的抗细菌感染机制的研究提、特别是重要的鱼类炎症相关nf
‑
κb和mapk信号通路网络调控机制的研究提供良好的实验系统，在应用方面为利用该启动子构建表达载体高效表达外源基因或将该启动子应用于转基因鱼构建创造条件，具有重要的理论和实际意义。
附图说明
[0015]
图1为日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子转录因子结合位点示意图1。
[0016]
图2为日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子转录因子结合位点示意图2。
[0017]
图3为日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子转录因子结合位点示意图3。
[0018]
图4为采用双荧光素酶报告基因检测系统定量分析日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子的活性图。
[0019]
其中，横坐标pgl3表示空载体pgl3
‑
basic转染epc细胞的荧光素酶相对活性(作为对照组)；
[0020]
pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro为重组载体pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro转染epc细胞的荧光素酶相对活性(作为实验组)。
[0021]
如图4所示，重组载体pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro转染epc细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pgl3
‑
basic转染epc细胞的2.1倍，说明了日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子可以较好地启动荧光素酶报告基因的转录。
[0022]
每个实验设三次重复，每次重复设三个平行；误差棒代表平均值的标准误差。利用双尾成组t检验统计分析实验组与对照组的显著性差异，“*”p<0.05，“**”p<0.01。
[0023]
图5为在革兰氏阴性菌大肠杆菌重要表面抗原lps(30μg/ml)刺激条件下日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子的活性变化图。
[0024]
其中，横坐标pgl3
‑
basic表示空载体pgl3
‑
basic转染epc细胞的荧光素酶相对活性(作为对照组)；
[0025]
pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro为重组载体pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro转染epc细胞的荧光素酶相对活性(作为实验组)。
[0026]
如图5所示，经lps刺激24h重组载体pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro转染epc细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pgl3
‑
basic转染epc细胞的1.9倍，说明了日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子可被lps诱导激活。
[0027]
每个实验设三次重复，每次重复设三个平行；误差棒代表平均值的标准误差。利用双尾成组t检验统计分析实验组与对照组的显著性差异，“*”p<0.05，“**”p<0.01。
[0028]
图6为在水产动物重要致病菌嗜水气单胞菌(106cfu/ml)刺激条件下日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子的活性变化图。
[0029]
其中，横坐标pgl3
‑
basic表示空载体pgl3
‑
basic转染epc细胞的荧光素酶相对活性(作为对照组)；
[0030]
pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro为重组载体pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro转染epc细胞的荧光素酶相对活性(作为实验组)。
[0031]
如图6所示，经嗜水气单胞菌刺激6h重组载体pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro转染epc细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pgl3
‑
basic转染epc细胞的2.2倍，说明了日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子可被嗜水气单胞菌诱导激活。
id no：2所示)比对分析日本鳗鲡基因组，对分析预测具有抗菌肽cathelicidin2基因5’侧翼区序列进行扩增，上游引物“5'
‑
ctacctgggaaatgtgggtggag
‑
3'(如seq id no：3所示)”为抗菌肽cathelicidin2基因5’侧翼区序列，下游引物“5'
‑
gacatctgtaaaggtgaagacgctcc
‑
3'(如seq id no：4所示)”为抗菌肽cathelicidin2基因开放阅读框第一外显子序列，由上海生物工程公司合成。
[0051]
2.第一轮pcr采用takara公司高保真酶gc buffer(mg
2
plus)进行扩增，反应体系：2
×
primestar hs dna polymerase 12.5μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、gdna 0.5μl、灭菌水11μl；降落pcr反应程序为95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃4min，4个循环；95℃30s，58℃30s，72℃4min，4个循环；95℃30s，56℃30s，72℃4min，30个循环；72℃10min；4℃5min。
[0052]
3.第二轮pcr采用takara公司10
×
ex taq buffer(mg
2
plus)进行扩增，反应体系：ex taq 0.13μl、10
×
ex taq buffer(mg2 plus)2.5μl、dntp mixture(2.5mm each)2μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、第一轮pcr产物0.5μl、灭菌水18.87μl；降落pcr反应程序为95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃4min，4个循环；95℃30s，58℃30s，72℃4min，4个循环；95℃30s，56℃30s，72℃4min，30个循环；72℃10min；4℃5min。
[0053]
4.第二轮pcr扩增得到的pcr产物连接到takara公司pmd19t
‑
simple vector载体进行序列测定与分析，从而获得含有日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子序列的pmd19t
‑
cathelicidin2
‑
pro重组质粒。
[0054]
日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子的核苷酸序列如seq id no：1所示：
[0055]
[0056][0057]
日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因开放阅读框第一外显子序列如seq id no：2所示
[0058]
atgagaagtgagacacataagatgaagagctctgttggacctctgctgctgctctcccttgttgcttttgtctctgtgacattggccaggagcgtcttcacctttacagatgtccttgccgcggccactgcagacttcaaccagaaaagccaggagacaaaagcttttggacctccaaagcagggcgctttgcggtcaatg
[0059]
实施例2日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子转录因子结合位点预测
[0060]
上网登录基因5
′
侧翼区转录因子结合位点在线预测软件alibaba2(http://gene
‑
regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)，将已经克隆测试验证获得的抗菌肽cathelicidin2基因启动子序列复制后以fasta格式粘贴在对话框内，点击start进行转录因子结合位点的预测分析。结果如图1～图3：
[0061]
日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子主要转录因子结合位点如下：
[0062]
[0063][0064][0065]
实施例3日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子的活性分析
[0066]
一、含有日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子片段的重组荧光素酶报告基因载体pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro的构建。
[0067]
1.将日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子片段插入promega公司荧光素酶报告基因载体pgl3
‑
basic中，使萤火虫荧光素酶(luciferase)报告基因的表达由日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子控制，构建得到的重组载体命名为pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro。具体步骤如下：
[0068]
合成带有mlui酶切位点的上游引物：
[0069]
5'
‑
cgacgcgtctacctgggaaatgtgggtggag
‑
3'(如seq id no：5所示)，
[0070]
带有smai酶切位点的下游引物：
[0071]
5'
‑
tcccccgggctcagtcgcacactggtcaattacag
‑
3'(如seq id no：6所示)。采用takara公司高保真酶gc buffer(mg
2
plus)进行扩增，反应体系：2
×
primestar hs dna polymerase12.5μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、pmd19t
‑
cathelicidin2
‑
pro重组质粒0.5μl、灭菌水11μl；降落pcr反应程序为95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃4min，4个循环；95℃30s，58℃30s，72℃4min，4个循环；95℃30s，56℃30s，72℃4min，30个循环；72℃10min；4℃5min。用omega公司胶回收试剂盒进行pcr产物回收。
[0072]
2.回收后的pcr产物和载体pgl3
‑
basic分别进行mlui/smai双酶切(thermo scientific fermentas fast digest)。
[0073]
双酶切反应体系总共40μl，包括4μl 10
×
fastdigest green buffer，酶mlui及酶smai各2μl，载体/pcr产物各1.5μg，灭菌水补至40μl。
[0074]
将以上体系于pcr管中混匀后进行酶切反应，反应程序为：37℃，60min；80℃，20min；4℃，5min。
[0075]
用omega公司胶回收试剂盒分别回收上述经mlui/smai双酶切的pcr产物和载体pgl3
‑
basic，并用takara公司t4连接酶连接经双酶切的pcr产物和载体pgl3
‑
basic，连接反应体系为20μl，包括2μl10
×
t4 buffer，1μlt4 dna连接酶，40ng双酶切的载体pgl3
‑
basic，300ng双酶切的pcr产物，灭菌水补至20μl，将以上体系于pcr管中混匀后进行16℃连接过夜。
[0076]
3.上述连接产物转化大肠杆菌e.coli dh5α感受态细胞，经菌落pcr筛选阳性克隆，用omega公司无内毒素小量质粒试剂盒提取质粒，并经测序确认启动子片段插入的正确性，从而获得含有日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子片段的重组荧光素酶报告基因载体pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro。
[0077]
二、采用双荧光素酶报告基因检测系统分析日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子的基础活性。
[0078]
1.把状态较好的epc细胞接种至48孔细胞板中(1
×
105/孔)，加入l15培养基(l15基础培养基含有10％gibco澳洲胎牛血清)，转入恒温培养箱28℃中过夜培养，使其贴壁并恢复至对数生长期的状态，贴壁量达到80％左右时，进行转染实验。在转染前2h更换细胞培养基。
[0079]
转染时，按每孔0.5μl lipofectamine 3000reagent转染试剂和20μl opti
‑
mem低血清培养基配制转染试剂稀释液，混匀后室温孵育5min。再按每孔20μl opti
‑
mem低血清培养基与每孔所需质粒充分混匀，其中对照组含有20ng海肾荧光素酶内参报告基因载体prl
‑
tk、300ng荧光素酶报告基因载体pgl3
‑
basic载体，实验组含有20ng海肾荧光素酶内参报告基因载体prl
‑
tk、300ng重组荧光素酶报告基因载体pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro，随后加入0.5μl p3000
tm
试剂并混匀。将所配的质粒稀释液逐滴滴加到转染试剂稀释液中，混匀为转染复合物溶液，室温孵育15min后，缓慢加入epc细胞培养孔，于恒温培养箱(28℃)中培养。
[0080]
2.24h后收集转染细胞，用双荧光素酶报告基因检测系统分别读取萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的酶活性值，通过计算二者酶活性值的比值得出转染细胞中荧光素酶的相对活性。荧光素酶酶活测定的方法参考promega公司双萤光素酶报告基因检测系统说明书进行，具体步骤为：
[0081]
(1)配制实验所需试剂：1
×
plb裂解液：1体积5
×
passive lysis buffer加4体积双蒸水混匀配制而成；start试剂(larⅰ)：将luciferase assay substrate粉末完全溶解于10ml luciferase assay bufferⅱ溶液，用1.5ml离心管分装后，于
‑
80℃冰箱保存；stop试剂：视实验量将1体积的50
×
stop&substrate用49体积的stop&substrate用49体积的stop&buffer稀释。
[0082]
(2)缓慢吸去48孔细胞培养板中的细胞培养液，于每孔加入65μl的1
×
plb裂解液。
[0083]
(3)将48孔细胞培养板置于细胞振荡器上，振荡裂解15min。
[0084]
(3)将裂解后的细胞液转移至1.5ml离心管，离心(13000rpm，4℃，10min)。
[0085]
(4)取3μl离心后的上清液于透光性良好的1.5ml离心管中。
[0086]
(5)加入10μl start试剂，用glomax 20/20发光检测仪检测样品中的萤火虫荧光素酶活性数值。随后加入10μl stop试剂检测样品中的海参荧光素酶活性数值。两者活性的比值即为各样品的荧光素酶相对活性。
[0087]
以空载体pgl3
‑
basic和prl
‑
tk共同转染的epc细胞作为对照组，计算出pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro启动子的相对活性(图4)。
[0088]
如图4所示，重组载体pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro转染epc细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pgl3
‑
basic转染epc细胞的2.1倍，说明了日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子可以较好地启动荧光素酶报告基因的转录。
[0089]
三、免疫刺激实验
[0090]
将pgl3
‑
basic和日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子重组载体pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro分别与海肾荧光素酶内参报告基因载体prl
‑
tk共同转染epc细胞，转染12h后，在细胞培养液中分别加入lps(30μg/ml)、poly i:c(50μg/ml)以及嗜水气单胞菌(106cfu/ml)进行免疫刺激，分别在刺激12h、12h以及6h后分别收集转染细胞进行荧光素酶相对活性测定。
[0091]
在lps(30μg/ml)刺激条件下日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子的活性变化见图5。
[0092]
如图5所示，重组载体pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro转染epc细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pgl3
‑
basic转染epc细胞的1.9倍，说明了日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子可被lps诱导激活，“*”p<0.05，“**”p<0.01。
[0093]
在水气单胞菌(106cfu/ml)刺激条件下日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子的活性变化见图6。
[0094]
如图6所示，pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro转染epc细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pgl3
‑
basic转染epc细胞的2.2倍，说明了日本鳗鲡cathelicidin2基因启动子可被嗜水
气单胞菌诱导激活，“*”p<0.05，“**”p<0.01。
[0095]
在poly i:c(50μg/ml)刺激条件下日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子的活性变化见图7。
[0096]
如图7所示，重组载体pgl3
‑
cathelicidin2
‑
pro转染epc细胞中的荧光素酶相对活性为空载体pgl3
‑
basic转染epc细胞的1.1倍，无显著性差异，说明了日本鳗鲡抗菌肽cathelicidin2基因启动子不能被poly i:c诱导激活。
[0097]
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。