一株解毒抑菌生防菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，一种真菌在生防领域中的应用，特别涉及glarea lozoyensis p1菌株及在防治小麦赤霉病、小麦白粉病方面的用途。


背景技术：

2.小麦赤霉病是由镰刀菌属真菌引起的小麦第一大病害，其发生不仅会引起小麦减产，而且由于镰刀菌产生的毒素(如don、zen等)威胁人及动物安全。由于小麦花期降雨日数多，因此小麦赤霉病受气候因素的影响较大，降雨和气流给小麦赤霉病的发生和流行提供有利条件，也给化学防治带来许多困难；另外，在选育抗病品种方面常规育种存在一定难度，一直也未获得突破性进展。而对于小麦赤霉病的防治，实际生产中使用多菌灵或其复配制剂，虽然效果较好，但连续使用后存在产生抗药性的问题。防治效果的减弱导致赤霉病的防治越来越困难，如何在保护环境的前提下有效的防治赤霉病是目前研究的首要问题。
3.在生物防治中，拮抗菌及其代谢产物都起到了重要作用。新颖生防菌资源的活性化合物是开发生物农药的重要来源。本研究所获得生防菌glarea lozoyensis p1做为一种生防资源尚未见报道，其发酵液对小麦赤霉病菌菌丝生长和孢子萌发都具有较高活性，更为突出的是该生防菌能够抑制小麦赤霉菌呕吐毒素的产生。同时该菌也对小麦白粉病菌具有较高的活性。


技术实现要素：

4.本发明一方面是开发一种对小麦赤霉病有较高防治效果的新颖生防菌。本发明所提供的生防菌已于2021年1月6日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：cctcc no:m 2021019，名称为：glarea lozoyensis p1。
5.本发明另一方面是将开发的新颖生防菌用于小麦赤霉病、小麦白粉病的防治。
6.本发明还提供了所述glarea lozoyensis p1的发酵培养基，包括下列成分：甘露醇40g/l，酶水解酪蛋白33g/l，酵母提取物10g/l，硫酸铵5g/l，磷酸二氢钾9g/l，补充蒸馏水至1l。
7.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所述glarea lozoyensis p1的发酵液对小麦赤霉菌的菌丝生长和孢子发芽具有显著的抑制效果，与对照相比，glarea lozoyensis p1的发酵液10倍稀释液对菌丝生长的抑制率在100％，发酵液50倍稀释液对菌丝生长的抑制率在53.3％，此外，glarea lozoyensis p1的发酵液50倍稀释液的对孢子萌发的抑制效果在95％以上。更为优异的是，glarea lozoyensis p1抑制小麦赤霉病菌毒素的产生，将glarea lozoyensis p1与小麦赤霉菌共培养，未检测到呕吐毒素，对毒素的抑制率达到100％。表明本发明所述的glarea lozoyensis p1对小麦赤霉菌生长和赤霉菌呕吐毒素都有显著的抑制效果。
8.从以上技术方案可知：本发明的glarea lozoyensis p1来源可靠，对温度、ph等自然条件的适应范围广，对不良环境的耐受力强，能维持生态平衡，能适应病害生态系统，容
易培养和保存，抑制小麦赤霉病的效果好，且glarea lozoyensis p1对小麦白粉病也具有较高的抑制作用，因此，glarea lozoyensis p1在农业方面有很大的应用前景。
9.本技术技术路线合理，可为大规模工业化生产提供可靠的中试数据和设计依据，实现液体发酵工业化生产glarea lozoyensis p1，为开发相关生物制剂及大田推广奠定基础。
附图说明
10.图1为本发明所述glarea lozoyensis p1的菌落形态；
11.图2为本发明所述glarea lozoyensis p1菌株its扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图。m表示dna分子量；1
‑
2表示glarea lozoyensis p1样品；
12.图3为本发明所述glarea lozoyensis p1在不同培养基上培养25天、50天，后的发酵液稀释10倍处理对小麦赤霉菌菌丝生长影响，其中1为1#培养基，2为2#培养基，3为3#培养基，4为4#培养基，5为5#培养基，6为6#培养基，7为7#培养基；
13.图4为本发明所述glarea lozoyensis p1在6#培养基培养50天时的发酵液对小麦赤霉病菌丝生长影响图，其中ck为空白对照；
14.图5为本发明所述glarea lozoyensis p1发酵液5倍、10倍和50倍稀释液处理对小麦赤霉菌孢子萌发的影响；
15.图6为本发明所述glarea lozoyensis p1发酵液对小麦白粉病菌的抑制效果。
具体实施方式
16.以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
17.实施例1拮抗菌株的分离与筛选
18.本发明涉及的生防菌glarea lozoyensis p1来源于2020年8月本技术第一发明人从恩施市巴东县林木种植山区沉积泥土样品中筛选获得。该菌在pda培养基上生长，25℃培养20天后，菌落生长不规则，呈粉红色，菌落形态见图1。
19.实施例2glarea lozoyensis p1的菌落形态以及its序列测定
20.菌落形态特征：固体培养基(平板、斜面培养基)，精密称量麦芽浸粉20g，大豆蛋白胨1g，葡萄糖20g，琼脂20g，置1 000ml量瓶中，加水溶解并定容，用6mol/l氢氧化钠溶液调至ph 7.0～7.3。在固体培养基上菌落生长颜色：粉色，生长速速非常缓慢，菌落皱褶、绒毛状；菌落边缘纤毛状。
21.its的扩增和测序鉴定：
22.pcr扩增的正向引物62f：acgcccacccttgtgtaata(seq id no:2)；
23.518r：cctacctgatccgaggtcaa(seq id no:3)。
24.pcr反应体系为25μl,扩增程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
25.pcr产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行分离检测，pcr产物用takara胶回收试剂盒纯化回收，连接到t载体上，再转化到大肠杆菌中。每个样品挑选2个阳性克隆，以m13通用引物
在自动测序上进行正反双向测序。用dnastar package中的edit seq软件以及dnatools对所得到的序列进行编辑，用megalign进行比对。
26.我们扩增测定了这个真菌的its基因(见序列表seq id no:1所示)，pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示。经测序所得到的序列大小在457bp，在ncbi网站比对，和glarea lozoyensis的相似性达到99％。因此，将该菌鉴定为glarea lozoyensis。
27.结合菌落形态及分子鉴定，将这一菌株记为glarea lozoyensis p1。
28.实施例3不同培养基发酵不同天数对小麦赤霉菌菌丝生长影响
29.采用菌丝生长速率法，测定glarea lozoyensis p1在7种不同的发酵培养基、不同发酵天数培养时的发酵液对小麦赤霉菌菌丝生长影响。用实施例1中的固体培养基，在25℃条件下培养glarea lozoyensis 15天，从长好的平板培养基上挖块，转接到7种不同培养基中，装液量为300ml的1l的三角瓶中，碾碎，置25℃、200r/min的摇床上培养10d、25d和50d。
30.7种发酵培养基的配方分别如下：
31.1#培养基：甘露醇40g/l，蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，补充蒸馏水至1l。
32.2#培养基：甘露醇40g/l，酵母氮源基础(yeast nitrogen base，ynb不含硫酸铵)6.7g/l,补充蒸馏水至1l。
33.3#培养基：甘露醇40g/l，蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，酵母氮源基础(yeast nitrogen base，ynb不含硫酸铵)6.7g/l，补充蒸馏水至1l。
34.4#培养基：甘露醇40g/l，蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，硫酸铵5g/l，磷酸二氢钾1g/l，补充蒸馏水至1l。
35.5#培养基：甘露醇40g/l，蛋白胨33g/l，酵母提取物10g/l，硫酸铵5g/l，磷酸二氢钾9g/l，补充蒸馏水至1l。
36.6#培养基：甘露醇40g/l，酶水解酪蛋白(casein enzymatic hydrolysate，n
‑
z
‑
amine)33g/l，酵母提取物10g/l，硫酸铵5g/l，磷酸二氢钾9g/l，补充蒸馏水至1l。
37.7#培养基：甘露醇100g/l，酶水解酪蛋白(casein enzymatic hydrolysate，n
‑
z
‑
amine)33g/l，酵母提取物10g/l，硫酸铵5g/l，磷酸二氢钾9g/l，补充蒸馏水至1l。
38.分别在发酵10天，25天和50天时取发酵液，5000g转速离心15min，取上清，在用0.22μm水相细菌滤膜过滤，获得无菌发酵滤液。按照体积1:9(即1ml发酵液 9毫升)将发酵液和培养基加入到培养皿中混匀。每种培养基3个重复，待培养接凝固后，用培养好的小麦赤霉菌接种，在25℃黑暗培养3天。采用十字交叉法测量菌落直径。结果见表1。
39.从表1可以看出，不同发酵培养基抑制小麦赤霉菌的生长存在较大差异(图3)。10天的发酵液处理，小麦赤霉菌的菌落生长比发酵25天、50天的菌落直径要大；25天的发酵液处理，除了6号培养基配方，其它6种配方发酵液处理的菌落直径要小于50天发酵液处理。这可能是是不同培养基中的营养成分影响活性物质的成分。50天的发酵液处理，6号培养基配方的发酵液处理小麦赤霉菌菌落直径最小，仅为0.8cm(图4)。
40.表1不同发酵培养基不同天数对小麦赤霉病菌丝生长影响
[0041][0042][0043]
实施例4最佳培养基发酵液不同稀释倍数对小麦赤霉病菌的抑制效果
[0044]
选择用实施例3中的6#培养基发酵生防菌glarea lozoyensis p1，在25℃180rpm下摇培50天。设置发酵液稀释10倍、20倍和50倍三种梯度，按照稀释10倍(即1ml发酵液 9毫升培养基)，稀释20倍(即0.5ml发酵液 9.5ml培养基)，稀释50倍(即200μl发酵液 9.8ml培养基)将发酵液和培养基加入到培养皿中混匀。每种稀释倍数3个重复，待培养接凝固后，用培养好的小麦赤霉菌接种，在25℃黑暗培养3天。采用十字交叉法测量菌落直径。菌落扩展生长抑制率计算公式：
[0045][0046]
试验结果见表2。从表2看出，glarea lozoyensis p1发酵液不同稀释倍数对小麦赤霉病菌都有抑制效果，稀释10倍、20倍和50倍的抑制率分别为100％，64.72％和53.3％。
[0047]
表2 glarea lozoyensis p1发酵液稀释不同倍数对小麦赤霉菌菌丝生长抑制效果
[0048][0049]
实施例5最佳培养基发酵液对小麦赤霉病菌孢子萌发的影响
[0050]
小麦赤霉病菌孢子萌发的试验采用孢子萌发法测定，首先准备小麦赤霉菌分生孢子，将本实验室保存的小麦赤霉菌ph
‑
1，在新鲜的pda培养基上活化，25℃黑暗条件下培养3d，打取10块(8mm)菌落边缘菌丝块转接到150ml的羧甲基纤维素酯液体培养基(cmc)中，置于恒温摇床上，25℃150r/min摇培5d，分别将供试菌株的分生孢子悬浮液用双重纱布过滤，用血球计数板计数调整孢子浓度为1
×
104。选择用实施例3中的6号培养基，发酵生防菌glarea lozoyensis p1在25℃180rpm下摇培50天。设置发酵液稀释5倍、10倍和50倍三种梯度，观察孢子萌发的总体积为1ml(孢子
‑
发酵液混合样)。用分生孢子的水溶液稀释发酵液，在1.5ml的离心管中分别加发酵液和孢子溶液体积如下：200μl：800μl(稀释5倍)；100μl：
900μl(稀释10倍)；20μl：980μl(稀释50倍)。配置好后将其放置于25℃下培养4
‑
8h，以不加发酵液的为空白对照。在显微镜下随机选择5个视野，每个视野观察20个孢子，记录孢子发芽情况。结果见表3和图5。
[0051]
从表3可以看出，随着glarea lozoyensis p1发酵液稀倍数的增加对小麦赤霉菌分生孢子的抑制率逐渐降低，稀释5
‑
10倍时，抑制率高达100％，当稀释倍数为50倍时，抑制率为95.23％。说明glarea lozoyensis p1发酵液对赤霉菌的孢子萌发有显著抑制作用
[0052]
表3 glarea lozoyensis p1发酵液对赤霉菌的孢子萌发抑制效果
[0053][0054]
实施例6 glarea lozoyensis p1发酵液对真菌毒素降解效果的研究
[0055]
称取200g大米，加入600g去离子水置于1l的三角瓶中灭菌，灭菌之后用玻璃棒搅拌均匀，共需要6瓶。然后每瓶接种相同的小麦赤霉菌菌丝块，其中3瓶接种生防菌glarea lozoyensis p1，剩下3瓶作为空白对照。放置于25℃下培养期间每隔1天晃动瓶子，让赤霉菌和生防菌glarea lozoyensis p1均匀生长。待生长30天之后，将米饭毒素培养基收集到锡箔纸中，放置于70℃的烘箱中烘干，用于毒素检测。真菌毒素的检测委托江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所完成。试验结果结果见表4。
[0056]
从表4可以看出，仅接种小麦赤霉病菌的3个对照处理，都能检测出毒素并且含量也较高，而接种生防菌glarea lozoyensis p1的3个处理，都未能检测出任何毒素，说明该生防菌能够抑制小麦赤霉菌毒素的产生。
[0057]
表4 glarea lozoyensis p1发酵液对毒素的抑制效果
[0058][0059]
实施例7 glarea lozoyensis p1发酵液对小麦白粉病菌室内生物活性测定
[0060]
采用离体叶段法。将培养至1叶1心的小麦，第1叶剪成30mm长叶段，置于含50μg/ml 99％苯骈咪唑(上海国药集团生产)的0.5％水琼脂保鲜培养基上备用。采用实施例2中的不同发酵配方的发酵液，吸取4ml glarea lozoyensis p1 50天发酵液并加入表面活性剂吐温20(终浓度为2.5
×
10
‑4)，充分混匀后在波特喷雾塔(potter精密实验室喷雾塔，英国burkard仪器公司)中施用，喷雾量为350ml/m2，喷施含2.5
×
10
‑4吐温20的na培养基处理为阴性对照、清水喷施为空白对照，自然晾干，24h后接种小麦白粉病菌分生孢子(接种量为10～20分生孢子/10倍视野)。然后放在17℃的空调房中培养，先避光12h，然后在24h日光灯
40w照射下培养。待空白对照充分发病后(7d)，调查每个处理的每片叶的发病严重度。每个处理3次重复。试验结果见表5和图6。
[0061]
防治效果(％)＝(ck―t)
×
100/ck
[0062]
ck为空白对照平均严重度；t为处理平均严重度。
[0063]
由表5可以看出，不同发酵配方50天的发酵液对小麦白粉病的活性也存在差异。其中1号发酵液的防治效果达到90.23％，6号发酵液的防治效果为80.14％。表明该生防菌的发酵液对小麦白粉病菌也具有较高活性。
[0064]
表5 glarea lozoyensis p1发酵液对小麦白粉病菌的抑菌活性
[0065][0066]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。