一种评估培养基干粉稳定性的方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种评估培养基干粉稳定性的方法。


背景技术：

2.以单克隆抗体药物为代表的重组蛋白药物获得飞速发展，基于哺乳动物细胞培养技术是重组蛋白药物制备的核心关键技术，而其中动物细胞培养所用培养基及其关键组分优化已成为哺乳动物细胞培养工艺开发和优化的关键环节，细胞培养基是以动物细胞大规模培养为技术平台，研发及生产生物药品的关键原材料之一，直接影响产品产量、质量和安全。细胞培养基从诞生至今，已经经历了100多年的历史，历经缓冲盐溶液、天然培养基、合成培养基、有血清培养基、无血清培养基和化学成分限定培养基等发展阶段。以gibco、hyclone、sigma为首培养基开发公司相继出现，并广泛实现了培养基商业化，市售商业化培养基批次间一致，但培养基组分未知、价格高昂、货期较长，对企业新药开发带来很大的风险。
3.另一方面，培养基的形式由早期含血清培养基，逐渐发展成为不含动物源组分的化学成分明确培养基，经典培养基开发由配方各组分配制成液体培养基逐步向质地均一的干粉培养基转变，培养基干粉研磨工艺因势而生，它既易于生产放大的可操作性，又可以缩短配液时间。行业内有多种研磨方式：喷雾研磨、超微粉碎、球磨、针磨等，研磨工艺不同，粉末颗粒大小也不同。而不同研磨工艺各有利弊，直接影响工艺稳健、产品表达和产品质量等。目前以gibco、bd、sigma、健顺、倍谙基、艾米能斯等为首的培养基干粉定制公司逐渐占领了市场，它们拥有完善的gmp体系，物料可控、干粉工艺稳健，可提供最安全和理想的定制培养基，它们能严格保证批次间的一致性，实现精准投料。但定制厂家对定制化的培养基干粉不进行稳定性评价或只进行部分效期的评估，因此，市场上没有系统化的评估方法来支持干粉化的培养基可满足大规模生产的需求。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是为克服本领域中尚无完善的评估培养基干粉稳定性的方法，导致培养基干粉的稳定性对实验、生产活动中的结果产生较大影响的缺陷，提供一种评估培养基干粉稳定性的方法。
5.现有技术中通常使用单一指标测评培养基干粉的稳定性，导致所得稳定性结果偏差较大，难以反应培养基的真实情况。发明人意外发现同时评估培养基干粉的批次间稳定性、干粉储存稳定性和液体储存稳定性这三项即可较为全面地反应培养基干粉质量参数中稳定性的程度，从而为实验、生产活动结果的稳定性提供更好的保障。
6.本技术以干粉培养基(基础培养基actipro(sh31037.04，hyclone)、流加培养基cell boost 7a(sh31026.05，hyclone)和流加培养基cell boost 7b(sh31027.04cn，hyclone))为例进行研究，通过一个系统的、完整的、便于大规模生产方法的评估，得到一系列干粉培养基的稳定性参数，为大规模生产放大提供数据支持。
7.为解决上述问题，本发明采取的技术方案为：一种评估培养基干粉稳定性的方法，所述方法包括评估所述培养基干粉的批次间稳定性、干粉储存稳定性和液体储存稳定性，所述批次间稳定性、干粉储存稳定性和液体储存稳定性通过细胞培养，培养后测定细胞生长、蛋白表达和/或蛋白质量进行评估，所述干粉储存稳定性的条件为2
‑
8℃下储存不超过2年；所述液体储存稳定性的条件为2
‑
8℃下储存不超过6个月，18
‑
26℃下储存不超过2个月(其中，对于基础培养基18
‑
26℃下储存不超过1个月，对于流加培养基18
‑
26℃下储存不超过2个月)。以上时长仅为上限值，具体还要结合细胞培养结果、实际生产需求来定，并可根据生产需求进行优化。
8.本发明中所述的细胞培养方式可根据细胞类型，按照本领域中培养该细胞的常规方式进行培养即可。所述“蛋白表达”以及“蛋白质量”中的所述“蛋白”等可为本领域技术人员公知的、该细胞大量或者特殊表达的特异性目标蛋白。以上各术语的解释同样适用于以下所提及的“细胞培养”以及“蛋白”等术语。
9.为进一步提高本发明所述方法的准确性，所述方法较佳地还包括在反应器中动态评估所述培养基干粉的液体形式。优选地，所述在反应器中动态评估所述培养基干粉的液体形式通过细胞培养和理化监控培养基进行，培养后测定细胞生长、蛋白表达和/或蛋白质量进行评估。所述反应器中动态评估所述培养基干粉的液体形式的储存条件优选为ph7.0
‑
7.5下储存不超过72h。
10.较佳地，所述方法还包括评估所述培养基干粉配制培养基的时长对培养基功能的影响。优选地，所述培养基干粉配制培养基的时长对培养基功能的影响通过细胞培养和理化监控培养基进行评估，培养后测定细胞生长、蛋白表达和/或蛋白质量进行评估。所述培养基干粉配制培养基的时长优选为不超过7h。
11.较佳地，所述方法还包括评估所述培养基干粉的液体形式的过滤次数对培养基功能的影响。优选地，所述培养基功能包括培养所得细胞的生长、蛋白表达和/或蛋白质量。所述培养基干粉的液体形式的过滤次数优选不超过3次。
12.较佳地，所述方法还包括评估所述培养基干粉的溶解性。优选地，通过理化监控评估所述培养基干粉的溶解性。
13.较佳地，所述方法还包括评估所述培养基干粉的无菌过滤载量。
14.较佳地，所述方法包括评估培养基干粉的批次间稳定性、干粉储存稳定性、液体储存稳定性、配制培养基的时长、过滤稳定性、无菌过滤载量、溶解性及在反应器中动态评估所述培养基干粉的液体形式。
15.较佳地，所述理化监控为测量溶液浊度，所述浊度不超过4ntu。
16.较佳地，所述细胞培养为流加培养。
17.较佳地，所述培养基为培养动物细胞的培养基。所述的动物细胞优选cho细胞。所述的cho细胞优选为cho
‑
gs细胞。
18.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
19.本发明所用试剂和原料均市售可得。
20.本发明的积极进步效果在于：
21.本技术旨在为培养基干粉提供一种较全面的、满足大规模生产需求的稳定性评估
方法。通过同时评估培养基干粉的批次间稳定性、干粉储存稳定性和液体储存稳定性来系统性地评估培养基干粉的稳定性，得到一系列干粉培养基的稳定性参数，且可通过进一步评估培养基干粉的配制培养基的时长、过滤稳定性、无菌过滤载量、溶解性及在反应器中动态评估所述培养基干粉的液体形式，从而更全面地评估培养基的稳定性。本技术提供的培养基干粉稳定性的方法，通过一个系统的、完整的、便于大规模生产方法的评估，得到一系列干粉培养基的稳定性参数，为大规模生产放大提供数据支持。
附图说明
22.图1为培养基干粉批次间稳定性的活细胞密度。
23.图2为培养基干粉批次间稳定性的细胞活率。
24.图3为培养基干粉批次间稳定性的蛋白表达量。
25.图4为培养基干粉批次间稳定性的蛋白纯度。
26.图5为培养基干粉批次间稳定性的蛋白电荷变异体。
27.图6为培养基干粉批次间稳定性的蛋白糖基化。
28.图7为培养基干粉储存稳定性的活细胞密度。
29.图8为培养基干粉储存稳定性的细胞活率。
30.图9为培养基干粉储存稳定性的蛋白表达量。
31.图10为培养基干粉储存稳定性的蛋白纯度。
32.图11为培养基干粉储存稳定性的蛋白电荷变异体。
33.图12为培养基干粉储存稳定性的蛋白糖基化。
34.图13为培养基液体储存稳定性的活细胞密度。
35.图14为培养基液体储存稳定性的细胞活率。
36.图15为培养基液体储存稳定性的蛋白表达量。
37.图16为培养基液体储存稳定性的蛋白纯度。
38.图17为培养基液体储存稳定性的蛋白电荷变异体。
39.图18为培养基液体储存稳定性的蛋白糖基化。
40.图19为基础培养基在反应器中动态储存下的活细胞密度。
41.图20为基础培养基在反应器中动态储存下的细胞活率。
42.图21为基础培养基在反应器中动态储存下的蛋白表达量。
43.图22为基础培养基在反应器中动态储存下的蛋白纯度。
44.图23为基础培养基在反应器中动态储存下的蛋白电荷变异体。
45.图24为基础培养基在反应器中动态储存下的蛋白糖基化。
46.图25为基础培养基在反应器不同ph条件下的活细胞密度。
47.图26为基础培养基在反应器不同ph条件下的细胞活率。
48.图27为基础培养基在反应器不同ph条件下的蛋白表达量。
49.图28为基础培养基在反应器不同ph条件下的蛋白纯度。
50.图29为基础培养基在反应器不同ph条件下的蛋白电荷变异体。
51.图30为基础培养基在反应器不同ph条件下的蛋白糖基化。
52.图31为培养基不同搅拌时间的活细胞密度。
70.71.[0072][0073]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0074]
仪器设备信息详见表1
‑
2：
[0075]
表1
‑2[0076]
[0077][0078]
试剂信息见表1
‑
3：
[0079]
表1
‑3[0080][0081]
细胞株信息：cho
‑
gs(lonza biologics)表达系统广谱性，表达单克隆抗体、双克隆抗体等。
[0082]
细胞培养：
[0083]
1)细胞复苏
[0084]
从工作细胞库中取出一株细胞，在水浴锅中37.0℃解冻，将细胞悬液转移到装有8.5ml基础培养基的离心管中，1000r/min离心5分钟，去上清，用基础培养基重悬细胞并转
移到125ml平底摇瓶中，补充体积至30ml，混匀后取样进行细胞计数。将摇瓶置于二氧化碳摇床，36.5℃，6％co2，130r/min，培养3天。
[0085]
2)摇瓶扩增
[0086]
用基础培养基将细胞按0.5
×
106个/ml的密度扩增稀释至新的摇瓶中，置于二氧化碳摇床，36.5℃，6％co2，130r/min，培养3天，逐级扩增至细胞数量满足下一级种子扩增要求。
[0087]
3)fed
‑
batch批培养(流加培养)
[0088]
以actipro为基础培养基，接种密度1.0
×
106个/ml，前期培养温度36.5℃，第5天降温至33.0℃。培养至第3、5、7、9、11天分别流加5％(w/w)初始培养重量的流加培养基cell boost 7a和0.5％的流加培养基cell boost 7b，每天根据葡萄糖浓度检测结果，在葡萄糖低于3.0g/l时，补加200g/kg葡萄糖浓缩液使细胞液中葡萄糖浓度提高到5.0g/l。
[0089]
培养过程中取样检测活细胞密度、细胞活率和生化指标，培养至第14天结束培养，下罐当天留取部分细胞液样品，用于检测蛋白(抗tigit单克隆抗体)表达量和protein a纯化后检测蛋白质量，包括纯度(sec
‑
hplc法和非还原ce
‑
sds法(nrce
‑
sds法))、电荷变异体(icief法)和糖基化(fld
‑
uhplc法)。
[0090]
实施例1：溶解性研究
[0091]
根据平台培养基配制方法，对actipro、cell boost 7a和cell boost 7b分别进行干粉溶解时间、溶解ph及溶液浊度等方面的研究，以培养基干粉完全溶解，溶液浊度≤4.0ntu为判断标准，摸索不同培养基在中性水中的溶解情况，以及不同培养基干粉完全溶于水的最适ph等，其中cell boost 7b干粉需要强碱才能充分溶解，故溶解时加入naoh。通过对三种培养基进行溶解性研究发现，三种培养基配制简单，便于操作，见下表1
‑
4。
[0092]
表1
‑
4三种培养基干粉溶液配制方法
[0093]
[0094]
[0095]
[0096][0097]
实施例2：培养基干粉批次间稳定性
[0098]
分别评估了actipro、cell boost 7a和cell boost 7b三批次培养基干粉的稳定性，三批次粉末配制方法一致(三种培养基干粉溶液配制方法详见实施例1中的表1
‑
4)，溶液配制过程各指标均在表1
‑
4范围内；同时对三种培养基三批次粉末进行了细胞fed
‑
batch批培养，实验得出：三批次粉末在细胞生长、蛋白表达和蛋白质量等方面均无显著性差异，三批次收获时：活率≥60，蛋白表达量变化值≤10％，蛋白纯度(单体，sec
‑
hplc法)≥90.0，变化值≤5％，蛋白纯度(单体，nrce
‑
sds法)≥90.0，变化值≤5％，电荷变异体(酸性组分，icief法)≤40.0，变化值≤5％，糖基化组分(g0f，fld
‑
uhplc法)变化值≤5％；说明批间细胞培养工艺稳定、质量合格，详见图1～6。故培养基干粉性能稳定。
[0099]
实施例3：培养基干粉储存稳定性
[0100]
对三种培养基actipro、cell boost 7a和cell boost 7b进行了干粉储存稳定性评估，分别考察了在2～8℃下放置0、0.5、1、1.5、2年干粉培养基到的稳定性，如图7～12所示，细胞fed
‑
batch培养过程、蛋白表达及蛋白质量均无显著性差异，具体指标同实施例1，故三种培养基干粉2～8℃下效期可达2.0年。
[0101]
实施例4：培养基液体储存稳定性
[0102]
三种培养基actipro、cell boost 7a和cell boost 7b干粉按照表1
‑
4溶液配制方法进行配制，并分装于棕色透气玻璃器皿中无菌保存，按照本技术策略进行取样检测理化特性。如表2所示，actipro溶液在2～8℃下避光保存6个月，溶液浊度无显著变化；actipro溶液在18～26℃下避光保存1个月之后，溶液浊度显著升高，cell boost 7a溶液在2～8℃下避光保存6个月，溶液浊度无显著变化；cell boost 7a溶液在18～26℃下避光保存1个月之后，溶液浊度有所下降。cell boost 7b溶液在2～8℃下避光保存6个月，溶液浊度无显著变化；cell boost 7b溶液在18～26℃下避光保存1个月之后，溶液浊度随着储存时间延长而逐渐升高。
[0103]
故actipro、cell boost 7a和cell boost 7b液体在2～8℃下可储存6个月，在18～26℃下可以储存1个月。
[0104]
对2～8℃下储存1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月和18～26℃下储存1个月的三种培养基进行了fed
‑
batch批培养验证，如图13～18所示，细胞生长趋势一致，2～8℃下随着储存时间延长，细胞蛋白表达量有所降低，但均满足判断标准，蛋白质量无显著差异；18～26℃下储存1个月，细胞蛋白表达量与蛋白质量均无显著差异。具体指标同实施例1。
[0105]
结合理化测试和fed
‑
batch批培养评估，得出三种培养基满足生产需求的溶液储存时间：actipro、cell boost 7a和cell boost 7b溶液在2～8℃下避光储存≤6个月，在18
～26℃下避光储存≤1个月。
[0106]
表2.培养基液体储存稳定性理化检测结果
[0107]
[0108][0109]
通过实施例2
‑
4，测得actipro、cell boost 7a和cell boost 7b三种培养基的批次间稳定性、干粉储存稳定性和液体储存稳定性，较为全面地反应培养基干粉质量参数中稳定性的程度。以下通过实施例5
‑
8进一步验证、从其他方面更全面地测定三种培养基的稳定性。
[0110]
实施例5：基础培养基在反应器中动态研究
[0111]
根据实际生产需求，fed
‑
batch批培养时只有基础培养基需要在接种前完成培养基的配制、过滤、接种及无菌检验等操作，故对基础培养基actipro进行了反应器动态储存稳定性的评估，主要考察actipro在反应器生产平台工艺参数条件下的储存时间和反应器不同ph条件对actipro稳定性的影响。actipro干粉按照表1方法进行溶液配制，无菌过滤于反应器中进行动态研究。
[0112]
(1)actipro在反应器ph7.0的储存时间测试，在ph 7.0、36.5℃、40％do、200r/min条件下，考察actipro在中储存0、24、48、72h，溶液浊度的变化。同时对不同储存时间点进行
了fed
‑
batch批培养评估，如如表3和图19～24所示，在72h之内，浊度无明显变化且细胞生长趋势一致，蛋白表达量和蛋白质量也无显著差异。具体指标同实施例1。
[0113]
结合理化测试和fed
‑
batch批培养结果，得出基础培养基actipro在反应器中的储存要求：在ph 7.0、36.5℃、40％do、200r/min条件下，actipro可在反应器中动态储存≤72h。
[0114]
表3.基础培养基在反应器中理化检测结果
[0115][0116]
(2)考察反应器不同ph条件对actipro稳定性的影响：在反应器工艺36.5℃、40％do、200r/min基础上，对ph参数进行了摸索，如表4所示，ph6.8～7.5时随着储存时间延长，溶液浊度无显著变化，而ph8.0时溶液浊度显著升高；理化结果显示培养基在ph8.0下储存不稳定，而结合cho细胞生长特性，ph6.8下不利于细胞生长和表达，故得出ph的范围为7.0
‑
7.5，对ph7.0和ph7.5条件下不同储存时间点进行了fed
‑
batch批培养的进一步验证，如图25～30所示，在ph7.0和ph7.5条件下细胞生长趋势一致，蛋白表达量和蛋白质量无显著差异，具体指标同实施例1。
[0117]
结合理化测试和fed
‑
batch批培养结果，得出基础培养基actipro适宜在反应器ph7.0～7.5下培养。
[0118]
表4.基础培养基在反应器不同ph条件下理化检测结果
[0119]
[0120][0121]
实施例6：培养基配制时间研究
[0122]
根据实际生产需求，需要对三种培养基溶液配制过程进行研究，评估不同搅拌时间对培养基理化及功能特性的影响。如表5所示，actipro、cell boost 7a和cell boost 7b随着搅拌时间的延长，溶液浊度均无显著变化。fed
‑
batch批培养如图31～36所示，细胞生长趋势一致，蛋白表达量和蛋白质量均无显著差异，具体指标同实施例1。
[0123]
根据理化测试和fed
‑
batch批培养结果，得出三种培养基配制要求：
[0124]
actipro、cell boost 7a和cell boost 7b溶液配制时，搅拌时间≤7h。
[0125]
表5.培养基配制过程理化检测结果
[0126]
[0127][0128]
实施例7：培养基过滤次数
[0129]
大规模生产中，上游工艺中培养基和溶液配制成本大，为了避免生产过程中培养基无菌过滤不充分需要二次过滤，避免物料浪费，需要评估培养基过滤次数对培养基功能特性的影响(即培养基配制完成后，通过0.2μm无菌过滤，过滤次数n表示通过0.2μm无菌过滤n次)。如图37～42所示，三种培养基actipro、cell boost 7a和cell boost 7b不同过滤次数在fed
‑
batch批培养过程中细胞生长、蛋白表达量和蛋白质量均无显著差异，具体指标同实施例1。
[0130]
综上，得出三种培养基actipro、cell boost 7a和cell boost 7b可满足生产过程无菌过滤≤3次。
[0131]
实施例8：培养基无菌过滤载量研究
[0132]
生物制药工艺中各步骤除菌过滤平台一般采用0.2μm除菌过滤器以保证产品的安全，为了满足生产过程培养基过滤时对过滤器选择的需求，需要对0.2μm无菌过滤器进行过滤器载量测试。本实施例采用蠕动泵无菌过滤方式(如图43)，考察过滤流量、过滤时间、载量等因素并根据可滤性实验进行放大选型，为大规模生产提供最佳选型方案。如图44～46和表6所示，根据判断标准：过滤器压力≤2bar或过滤时间≤40min，经测试得出actipro溶液的过滤器载量为4433.3l/m2，cell boost 7a溶液的过滤器载量为1117.8l/m2，cell boost 7b溶液的过滤器载量为2295.6l/m2。并根据过滤器载量测试推算出放大规模下的过滤器选型，如表7所示。
[0133]
表6.培养基过滤器载量测试结果
[0134][0135]
[0136]
表7.培养基不同规模下的过滤器选型
[0137][0138]
通过得知actipro、cell boost 7a及cell boost 7b在0.2μm无菌过滤器中的载量和流量，可以选择不同规模下的滤器面积。
[0139]
上述结果可以反映出，通过实施例2
‑
4对培养基批次间稳定性、干粉储存稳定性和液体储存稳定性的评估，已经可以较为全面地反应培养基干粉质量参数中稳定性的程度。
[0140]
再结合实施例1与5
‑
8，进一步验证了通过配制培养基的时长、过滤稳定性、无菌过滤载量、溶解性及在反应器中动态评估所述培养基干粉的液体形式验证actipro、cell boost 7a和cell boost 7b三种培养基干粉的稳定性的评估方法。本技术提供的培养基干粉稳定性的方法，通过一个系统的、完整的、便于大规模生产方法的评估，得到一系列干粉培养基的稳定性参数，为大规模生产放大提供数据支持。