一种检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于荧光免疫检测技术领域，具体涉及一种双抗原夹心法检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。


背景技术：

2.恙虫病是由恙虫病东方体(orientia tsutsμgamushi，ot)所引起的自然疫源性疾病。恙螨幼虫是恙虫病惟一的传播媒介，恙螨幼虫通过叮咬鼠类等啮齿类动物形成自然界的感染循环。恙虫病东方体跟随恙螨的咬噬而进入人体，先在皮肤叮咬处开始繁衍，再进入血液，最初攻击的是破损部位的髓样细胞，进而攻击血管内皮细胞。之后恙虫病东方体利用宿主细胞上存在的表面蛋白聚糖和菌体表面蛋白将其自身附着到靶细胞上。恙虫病在我国分布极为广泛，受地理地貌、气候、野生动物影响很大，不同菌株和不同地区的恙虫病东方体抗原性和毒力又存在差异，恙虫病的致病机制也尚未完全明确，辅助检查无特异性，导致该病的预防和诊断仍面临较大困难。
3.目前，恙虫病的检测方法主要分为两大类，一是免疫学检测方法，二是针对病原体核酸的检测方法。免疫学方法主要包括间接免疫荧光法(ifa)、外斐氏反应、酶联免疫吸附法(elisa)等。ifa方法具有一定的局限性：成本高昂、操作复杂、检测操作需要专业培训、试剂生产也需要相应的生物安全防护设施，因而ifa在疫区的应用有限。外斐氏反应凝集试验该方法的灵敏度和特异性都无法满足临床要求。elisa的灵敏度较高，而且检测结果为具体数值，可以进行相对定量，制作成本低，可以进行高通量检测，但是elisa依然存在着不少问题：操作步骤繁琐、容易出现污染、需要专业人员进行操作等。针对病原体核酸的检测方法，包括普通pcr，荧光定量pcr，环介等温扩增试验(lamp法)，重组聚合酶反应(rap法)等。整体来说，pcr技术诊断的准确性是优于其他方法对于早期恙虫病的诊断，但是也存在着一些急需改进的问题，如实时pcr针对56
‑
kda抗原检测具有高速特异性但序列变异性可能改变引物的退火温度，从而降低实验的灵敏度。另外pcr法需要专门的仪器设备以及相应的基础设施，在体系配置阶段又容易产生污染，同时也需要专业人员进行操作。
4.免疫层析技术是一种将色谱层析技术、免疫学技术以及免疫标记技术相结合的固相膜免疫分析技术。通常是根据标记物的光学特性等获得可观察或测量的信号，最终判定检测结果。它的诊断原理是：样品溶液借助毛细作用在硝酸纤维(nc)膜上泳动，层析时标记物与待测物的复合物被相应的配体捕获而浓集显色，以nc膜上显色条带的有无或多少来定性或定量分析。
5.近年来，随着免疫层析技术的发展加上具有携带方便、操作简单且敏感性、特异性高等特点，胶体金免疫层析试纸条开始应用于恙虫病的诊断。目前，国外已报道有三个商品化的胶体金免疫层析试纸，澳大利亚panbio公司产品，以karp标准株重组蛋白为诊断抗原；美国的access bio公司产品，以karp、gilliam和kato株混合重组抗原作为诊断抗原；美国inbbios公司产品，以karp、gilliam、kato和ta716混合重组抗原作为诊断抗原。但胶体金试
纸条的t/c线最终为红色线条，在血清的检测过程中会受到血清背景颜色的干扰，影响实验的准确结果，且胶体金在日光下进行读取，灵敏度有一定的局限性。荧光微球是在受到激发光的激发后发出肉眼可见的荧光，抗干扰能力强，降低信噪比，具有更高的灵敏度。
6.荧光微球是指将荧光染料通过物理和化学等方法吸附或包埋到粒子内而形成的，直径在纳米至微米级(0.01
‑
10μm)范围内，受激发光源激发能发出荧光的固体微粒。相比胶体金等传统标记物(须大量聚集才会被辨别出)，它的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，所以荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限。在微球壳结构的作用下，荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性。形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响。荧光微球免疫层析试纸条检测恙虫病东方体抗体目前未见其他报道。因此，基于荧光免疫层析技术和双抗原夹心免疫法，构建一种恙虫病东方体抗体的高效快检方法具有重要意义。


技术实现要素：

7.发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条和制备方法。
8.本发明还提供包括上述检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条的试纸卡或试剂盒。
9.本发明还提供了上述检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条的应用。
10.为了解决上述技术第一个技术问题，本发明公开了一种检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条，包括硝酸纤维素膜4，所述硝酸纤维素膜4两端分别设有样品垫2和吸水垫7，所述样品垫2、吸水垫7和硝酸纤维素膜4均置于底板3上，所述硝酸纤维素膜4设有检测线5和控制线6。
11.优选地，所述样品垫2设有加样孔。
12.其中，所述检测线5含有恙虫病东方体混合重组抗原；优选地，所述恙虫病东方体混合重组抗原喷涂在检测线5上。
13.其中，所述质控线6含有兔抗恙虫病东方体多克隆抗体；优选地，所述兔抗恙虫病东方体多克隆抗体喷涂在质控线6上。
14.其中，所述恙虫病东方体混合重组抗原是以从恙虫病东方体sj2菌株感染的l929细胞培养液中提取的基因组为模板，扩增目的基因；将所得目的基因连接表达载体p et
‑
28( )，经转化、表达，所得sj2重组抗原与ptan株重组抗原和gilliam重组抗原按照1：(0.5
‑
1.5)：(0.5
‑
1.5)体积比混合获得；优选地，所述sj2重组抗原与ptan株重组抗原和gilliam重组抗原的用量比为1：1：1。
15.其中，所述扩增目的基因的上下引物和下游引物分别如seq id no.1和seq id no.2所示。所述ptan株和gilliam标准株重组抗为课题组前期制备。
16.其中，所述ptan株重组抗原制备方法可参考文献”min cao,hengbin guo,tang tan g,et al.preparation of recombinant antigen of tsutsugamushi ptan strain and develop ment of rapid diagnostic reagent for scrub typhus[j].am j trop med hyg,2007,76(3)：553
‑
558”。
[0017]
其中，所述gilliam株重组抗原制备方法可参考文献”操敏,郭恒彬,郁兴明,王柏仁,杨文富,唐家琪.恙虫病东方体蛋白基因的原核表达及活性鉴定[j].中国公共卫生,2004,{4}(07):5
‑
7.”[0018]
其中，所述兔抗恙虫病东方体多克隆抗体的制备方法为取恙虫病东方体混合重组抗原进行动物免疫(动物选择实验用白兔)，全程共免疫4次，通过颈动脉插管收集全血，分离制备抗血清，并采用亲和层析法进一步纯化所得抗体。
[0019]
其中，0.1
‑
0.5mg/ml的恙虫病东方体混合重组抗原被吸收在检测线中。
[0020]
其中，0.3
‑
0.7mg/ml的兔抗恙虫病东方体多克隆抗体被吸收在质控线中。
[0021]
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了一种试纸卡，其包含上述试纸条。
[0022]
本发明还公开了一种试剂盒，其也包含上述试纸条。
[0023]
为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述试纸条，或试纸卡，或试剂盒在检测恙虫病东方体抗体中的应用。
[0024]
其中，所述应用包括如下步骤：
[0025]
(1)将样品稀释液、荧光微球偶联的恙虫病东方体混合重组抗原和待检测血清混合后；
[0026]
(2)将步骤(1)所得物质置于样品垫上，静置，紫外灯下观察；当质控线和检测线均显色，则待检测血清为阳性；当质控线显色，而检测线不显色，则待检测血清为阴性。
[0027]
步骤(1)中，所述样品稀释液包括脱脂奶粉和吐温；优选地，所述吐温为吐温20。
[0028]
步骤(1)中，所述样品稀释液的溶剂为水。
[0029]
步骤(1)中，所述样品稀释液中脱脂奶粉的浓度为0.02
‑
0.08g/ml。
[0030]
步骤(1)中，所述样品稀释液中吐温与溶剂的用量为(5
‑
15)μl：1ml；
[0031]
步骤(1)中，所述荧光微球偶联的恙虫病东方体混合重组抗原的制备方法为将含有荧光微球和2
‑
吗啉乙磺酸缓冲液的混悬液活化后，加入恙虫病东方体混合重组抗原进行偶联、封闭，即得。
[0032]
其中，所述含有荧光微球和2
‑
吗啉乙磺酸缓冲液的混悬液为将荧光微球与2
‑
吗啉乙磺酸缓冲液混匀后，离心，所得沉淀经2
‑
吗啉乙磺酸缓冲液溶解。
[0033]
其中，所述活化为经1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺和n
‑
羟基琥珀酰亚胺溶液活化；优选地，所述荧光微球与1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺的用量比为0.1μl：(10
‑
30)μg；进一步优选地，优选地，所述荧光微球与1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺的用量比为0.1μl：20μg。
[0034]
其中，所述活化的温度为1
‑
7℃；优选地，所述活化的温度为4℃。
[0035]
其中，所述活化的时间为0.5h以上；优选地，所述活化的时间为0.5
‑
1.5h；进一步优选地，所述活化的时间为0.8
‑
1.2h。
[0036]
其中，所述活化后，去除活化的物质，重悬，再加入恙虫病东方体混合重组抗原进行偶联、封闭。
[0037]
其中，所述荧光微球与恙虫病东方体混合重组抗原的用量比为0.1μl：(4
‑
14)μg；优选地，所述荧光微球与恙虫病东方体混合重组抗原的用量比为0.1μl：9μg。
[0038]
其中，所述偶联的温度为1
‑
7℃；优选地，所述偶联的温度为2
‑
6℃。
[0039]
其中，所述偶联的时间为0.5h以上；优选地，所述偶联的时间为1h以上；进一步优
选地，所述偶联的时间为1
‑
3h；更进一步优选地，所述偶联的时间为1.5
‑
2.5h。
[0040]
其中，所述偶联后加入牛血清蛋白溶液，进行封闭。
[0041]
其中，所述封闭的温度为1
‑
7℃；优选地，所述封闭的温度为2
‑
6℃。
[0042]
其中，所述封闭的时间为0.5h以上；优选地，所述封闭的时间为0.5
‑
1.5h；进一步优选地，所述封闭的时间为0.8
‑
1.2h。
[0043]
其中，所述封闭后，用ph为6.0
‑
7.0的保护液(称取1g蔗糖、0.1g牛血清蛋白bsa、0.1g聚乙烯吡咯烷酮pvp、100μl吐温20溶液溶解在0.1mol/l的2
‑
吗啉乙磺酸mes溶液中)保护；其中，所述聚乙烯吡咯烷酮的平均分子量为10000。
[0044]
步骤(1)中，所述样品稀释液、荧光微球偶联的恙虫病东方体混合重组抗原和待检测血清的体积比为60：(20
‑
60)：(2
‑
5)。
[0045]
步骤(2)中，所述静置的温度为20
‑
30℃。
[0046]
步骤(2)中，所述静置的时间为5min以上；优选地，所述静置的时间为5
‑
30min；进一步优选地，所述静置的时间为5
‑
20min；更进一步优选地，所述静置的时间为5
‑
15min；再更进一步优选地，所述静置的时间为5
‑
10min；最优选地，所述静置时间为6
‑
10min。
[0047]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
[0048]
本发明采用双抗原夹心法实现对恙虫病东方体抗体的检测，具有检测仪器成本低，操作简单，快速，稳定性好，特异型好，灵敏度高，实用性较强、容易保存、具有市场开发价值。
附图说明
[0049]
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
[0050]
图1为荧光免疫层析检测试纸条结构示意图；其中，1为荧光微球
‑
抗原复合物；2为样品垫；3为底板；4为硝酸纤维素膜；5为检测线；6为质控线；7为吸水垫。
[0051]
图2为荧光免疫层析检测试纸条检测结果判定示意图；其中t为检测线；c为质控线；a)为阴性结果示意图；b)为阳性结果示意图；c)和d)为无效示意图。
[0052]
图3为1mg/ml edc不同用量时试纸条荧光强度示意图；a)为0μl；b)为5μl；c)为10μl；d)为20μl；e)为30μl；f)为40μl。
[0053]
图4为0.3mg/ml混合重组抗原不同用量时试纸条荧光强度示意图；a)为0μl；b)为10μl；c)为20μl；d)为30μl；e)为40μl；f)为50μl。
[0054]
图5为保护液不同ph时试纸条荧光强度示意图；a)为6.0；b)为6.5；c)为7.0；d)为7.5；e)为8.0；f)为8.5。
[0055]
图6为10μg/ml的免疫荧光微球不同用量时试纸条荧光强度示意图；a)为0μl；b)为10μl；c)为20μl；d)为30μl；e)为40μl；f)为50μl；g)为60μl。
[0056]
图7为检测时间不同时试纸条荧光强度示意图；a)为1min；b)为3min；c)为6min；d)为7min。
[0057]
图8为荧光免疫层析检测试纸条灵敏度测定示意图；a)为488ng/ml；b)为244ng/ml；c)为122ng/ml；d)为61ng/ml；e)为30.5ng/ml；f)为15.3ng/ml；g)为7.63ng/ml；h)为3.82ng/ml。
[0058]
图9为荧光免疫层析检测试纸条特异性测定示意图；a)为恙虫病阳性病人血清；b)为斑点热阳性病人血清；c)为出血热阳性病人血清；d)为疟疾阳性病人血清；e)为伤寒阳性病人血清；f)为血吸虫阳性病人血清。
[0059]
图10为胶体金纸条结构示意图；其中，a)为底板；b)为样品垫；c)为金标垫；d)为硝酸纤维素膜；e)为检测线；f)为质控线；g)为吸水垫。
具体实施方式
[0060]
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0061]
本发明中所述浓度，如无特殊说明，均为质量浓度。
[0062]
下述实施例中所述ptan株重组抗原制备方法参考文献”min cao,hengbin guo,tang tang,et al.preparation of recombinant antigen of tsutsugamushi ptan strain and development of rapid diagnostic reagent for scrub typhus[j].am j trop med hyg,2007,76(3)：553
‑
558”制备。
[0063]
下述实施例中所述gilliam株重组抗原制备方法可考文献”操敏,郭恒彬,郁兴明,王柏仁,杨文富,唐家琪.恙虫病东方体蛋白基因的原核表达及活性鉴定[j].中国公共卫生,2004,{4}(07):5
‑
7.”制备。
[0064]
实施例1：双抗原夹心法检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条的制备方法和检测方法
[0065]
1.恙虫病东方体混合重组抗原的制备
[0066]
(1)以恙虫病东方体sj2菌株感染的l929细胞培养液为提取材料，利用dna提取试剂盒提取恙虫病东方体sj2菌株的基因组，作为pcr反应模板。(在l929细胞中传代保存的恙虫病东方体sj2株，来源于安徽省三界地区黑线姬鼠体表临淮岗纤恙螨感染小白鼠获得的恙虫病东方体分离株)。
[0067]
(2)利用primer premier 5.0软件设计一对引物：
[0068]
上游引物：5
’‑
ggcgaattcaaaaactagaagttatagcg
‑3’
[0069]
下游引物：5
’‑
ggggatccggatttagagcagag
‑3’
[0070]
其中，上游引物加入保护碱基ggc和引入ecor i酶切位点gaattc；下游引物加入保护碱基gg和引入bamh i酶切位点ggatcc。
[0071]
(3)扩增出目的基因genbank序列号为km115577.1，选用ecor i酶和bamh i酶利用双酶切法将目的基因连接构建表达载体pet
‑
28a( )，通过热激法将质粒转化到感受态细胞bl21中。挑取单菌落过夜培养(37℃，160rpm)；将菌液转接活化培养4
‑
5h后，加诱导剂iptg至终浓度为0.1mmol/l，诱导表达5
‑
6h。获取目标菌液离心收集沉淀，进行纯化，获得所需sj2重组抗原。
[0072]
(4)取纯化后的sj2重组抗原与ptan株和gilliam标准株重组抗原1：1：1体积比混合，获得所需的混合重组抗原。
[0073]
其中，以安徽三界地区东方体新株sj2，福建平潭株ptan(核苷酸序列如seq id no.3所示)及我国重要流行株型gilliam株东方体(核苷酸序列如seq id no.4所示)56kda重组蛋白混合作为诊断抗原，代表了我国东方体主要流行株型，扩大了检测的抗原谱。
[0074]
2.荧光微球偶联的恙虫病东方体混合重组抗原的制备
[0075]
(1)每10μl(固含量1％)的荧光微球中加入0.1mol/l 2
‑
吗啉乙磺酸缓冲mes溶液1ml，振荡混匀5min。4℃，12000rpm离心20min，弃上清，再次使用1ml 0.1mol/l的2
‑
吗啉乙磺酸mes缓冲液溶解荧光微球，得到混悬液。
[0076]
(2)在步骤(1)所得混悬液中加入20μl新鲜配制的1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺edc和n
‑
羟基琥珀酰亚胺nhs溶液(edc和nhs均为1mg/ml，溶剂为超纯水)，涡旋混匀后，4℃振荡活化1h，再于12000rpm，4℃，离心20min，弃上清，使用1ml mes缓冲液清洗荧光微球1次，去除残留的edc和nhs，得到沉淀。
[0077]
(3)将步骤(2)所得沉淀利用1ml mes缓冲液重悬，加入30μl步骤1所制备的恙虫病东方体混合重组抗原(0.3mg/ml)，旋涡混匀，4℃振荡偶联2h，得到混悬液。
[0078]
(4)在步骤(3)所得混悬液中加入250μl 10％bsa溶液，使其终浓度为2％，4℃振荡封闭1h，再于12000r/min，4℃，离心20min。沉淀用1ml荧光微球保护液(ph6.5)复溶，超声30
‑
60s，使荧光微球被完全吹散，4℃保存备用。
[0079]
3.兔抗恙虫病东方体多克隆抗体的制备
[0080]
取步骤1的恙虫病东方体混合重组抗原进行动物免疫，动物选择实验用白兔，全程共免疫4次，末次免疫后7天左右于耳缘静脉取血检测，通过间接elisa方法确定效价，待效价大于1：50000时，通过颈动脉插管收集全血，分离制备抗血清，并采用亲和层析法进一步纯化所得抗体。纯化后抗体进行免疫原western blot检测，结果显示在目标区域有清晰的目的条带，说明经过纯化的兔多克隆抗体能够特异性识别恙虫病东方体。
[0081]
4.硝酸纤维素膜的制备
[0082]
设置三维平面点膜喷金仪参数，分别将0.3mg/ml的步骤1所制备的恙虫病东方体混合重组抗原和0.5mg/ml的步骤3所制备的兔抗恙虫病东方体多克隆抗体以1μl/cm的量平行包被在nc膜上，分别作为检测线和质控线，相邻两条线之间距离4mm。
[0083]
5.试纸条的组装
[0084]
如图1所示，在底板上沿样品检测时的层析方向依次将样品垫2、硝酸纤维素膜4、吸水垫7粘贴在底板3上，将吸水垫7粘贴在pvc底板靠近质控线6的一端，压在nc膜4上，重叠2mm，将样品垫2粘贴在pvc底板靠近检测线5的一端，同样压在nc膜4上，重叠2mm；最后使用压片机将粘贴好的pvc底板压实，用裁条机切成4mm宽的试纸条，置于含有干燥剂的密封袋中，于4℃保存。
[0085]
6.检测方法为：
[0086]
将60μl样品稀释液(每10ml超纯水中加入0.5g脱脂奶粉、100μl吐温20溶液)、40μl标记好的荧光微球
‑
抗原复合物溶液(图1中的1，实施例1中步骤2所制备的荧光微球偶联的恙虫病东方体混合重组抗原)和2
‑
5μl待测血清涡旋混匀后，滴加到试纸条样品垫的加样孔上，室温静置5min，用紫外灯照射观察实验结果，如图2所示，待测样品如果质控线和检测线均显色，则判定为阳性；如果仅质控线显色，而检测线不显色，则判定为阴性。
[0087]
实施例2：抗原夹心法检测恙虫病东方体抗体的试纸条的工艺优化
[0088]
本实施例在实施例1的基础上主要通过对荧光微球活化条件、抗原标记量、保护液的ph、免疫荧光微球用量以及检测时间进行研究(若无特殊说明，则其他步骤同实施例1)，对检测试纸条的性能进行优化。
[0089]
1.活化微球edc用量的优化
[0090]
取10μl荧光微球(固含量1％)于6支1.5ml离心管中，编号a
‑
f，各加入1ml 0.1mol/l mes缓冲液(ph＝6.5)。振荡混匀后，离心弃上清，再次使用1ml 0.1mol/l的mes缓冲液溶解荧光微球，得到混悬液；分别向所得混悬液中加入0μl、5μl、10μl、20μl、30μl、40μl的1mg/ml edc和nhs溶液，其他实验条件相同，完成试纸条的制备。根据检测试纸条的荧光强度选择最优的活化剂用量。如图3所示：在edc(1mg/ml)用量为0μl时，蛋白和微球之间不发生偶联，试纸条上无荧光强度；在edc(1mg/ml)用量低于20μl时，试纸条的荧光强度随着edc用量的增加而增加；edc(1mg/ml)用量达到30
‑
40μl时，荧光强度开始降低。因此，活化10μl(固含量1％)荧光微球时，选择20μl的1mg/ml edc溶液为最优的用量。
[0091]
2.混合重组抗原标记量的优化
[0092]
取10μl荧光微球(固含量1％)于6支1.5ml离心管中，编号a
‑
f，各加入1ml 0.1mol/l mes缓冲液(ph＝6.5)。振荡混匀后，离心弃上清，再次使用1ml 0.1mol/l的mes缓冲液溶解荧光微球，得到混悬液；向所得混悬液中分别加入20μl 1mg/ml edc和nhs溶液进行微球活化，活化结束完成清洗后，分别向a
‑
f管中加入0μl、10μl、20μl、30μl、40μl、50μl的步骤1所制备的混合重组抗原(0.3mg/ml)，其他实验条件相同，完成试纸条的制备，根据检测试纸条的荧光强度选择最优的混合重组抗原标记量。如图4所示：当荧光微球对应的标记蛋白量低于30μl时，荧光强度值随着标记抗体量的增加而增大；当蛋白量达到40
‑
50μl时，荧光强度反而有轻微降低。因此，标记10μl荧光微球时，选择30μl混合重组抗原为最优的标记量。
[0093]
3.保护液ph的优化
[0094]
分别取10μl荧光微球(固含量1％)于6支1.5ml离心管中，编号a
‑
f，完成免疫荧光微球的封闭后，分别使用ph为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5的保护液重悬沉淀，并完成试纸条的制备。根据检测试纸条的荧光强度选择最优的保护液ph。如图5所示：在仅用阴性样本进行实验时发现，ph值在6.0
‑
7.0之间时，ph6.5的纸质条c线荧光强度最高，而ph高于7.5时，试纸条出现了假阳性的结果，t线出现淡淡的条带，因此保护液的ph选择6.5。
[0095]
4.免疫荧光微球用量的优化
[0096]
分别取0μl、10μl、20μl、30μl、40μl、50μl、60μl的标记好的荧光微球
‑
抗原复合物溶液于7支1.5ml离心管中，编号a
‑
g，加入样品稀释液补足至100μl，分别加入2μl阳性血清进行检测，根据检测试纸条的荧光强度选择最优的免疫荧光微球用量。如图6所示：当不加入荧光微球时，t、c线均不显色，随着荧光微球用量的逐步增加，t、c线亮度也逐步变亮。当微球用量为40μl时，t、c线亮度均很高，而且随着微球用量的再次加大，亮度变化不明显。考虑到实际成本，最终确定免疫荧光微球用量为40μl。
[0097]
5.检测时间的优化
[0098]
取40μl标记好的荧光微球
‑
抗原复合物溶液加入60μl样品稀释液，涡旋混匀后加入2μl阳性血清，再次混匀后将液体全部滴加到试纸条样品垫上，开始计时，每隔一分钟拍摄一次，观察试纸条上t/c的颜色变化。以确定试纸条的最优检测时间。如图7所示：第一分钟，由于反应时间较短，nc膜上t/c线几乎看不见；到3min时，t/c线逐渐清晰；从第6min开始，t/c线亮度几乎不再变化。因此试纸条检测时间定为6min。
[0099]
实施例3：抗原夹心法检测恙虫病东方体抗体的性能评价
[0100]
本实施例中，所采用的试纸条和检测方法为在实施例1的基础上，选用实施例2中
的最优参数。
[0101]
1.试纸条灵敏度测定
[0102]
用样品稀释液将纯化后的多克隆抗体蛋白梯度稀释成488
‑
3.82ng/ml，然后取偶联好的荧光微球40μl与稀释好的样品60μl在离心管中混匀。将混合物滴加到试纸条的样品垫上，计时6min，检测试纸条的荧光强度，检测试纸条的灵敏度。如图8所示：当多克隆抗体稀释到3.82ng/ml时，试纸条呈现阴性结果，试纸条的最低检测线为7.63ng/ml。
[0103]
2.试纸条特异性测定
[0104]
取40μl标记好的荧光微球
‑
抗原复合物溶液和60μl样品稀释液分别加入6支离心管中，涡旋混匀后分别加入2μl恙虫病阳性血清和五份混合好的斑点热、出血热、疟疾、伤寒、血吸虫5种阳性病人血清。涡旋混匀后，将混合物滴加到试纸条的样品垫上，计时6min，观察试纸条的显色情况，检测试纸条的特异性。如图9所示：组装的试纸条，只与恙虫病病人阳性血清发生反应，与其它重要病原体阳性血清呈阴性反应，表明本试验制备的检测恙虫病东方体抗体的荧光微球免疫层析试纸条特异性较好。
[0105]
3.试纸条稳定性测定
[0106]
将制备好的荧光免疫层析试纸条充分干燥后，装入加有干燥剂的铝箔袋中，放置于4℃条件下密封保存。将制备好的试纸条从4℃冰箱中取出，在室温下平衡10min，分别对7天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月的试纸条进行检测，检测时使用经过试纸条验证成功的30份阳性血清样本、10份阴性血清样本对试纸条的稳定性进行验证。观察试纸条的显色情况，检测试纸条的稳定性。将4℃条件下保存6个月的荧光微球试纸条检测结果除1份阳性样本未检出之外，其余结果均与前期实验结果符合，阳性符合率为96.7％，阴性符合率为100％，表明该试纸条稳定性良好，在4℃条件下可以保存6个月。
[0107]
4.临床样本检测
[0108]
采用本研究建立的荧光免疫层析试纸条检测经临床病理和elisa实验确诊的恙虫病患者样本112份、阴性样本60份进行检测。其中阳性血清112份中检出阳性106份，检测敏感性为94.64％(106/112)，阴性样本中，检出阴性样本56份，阳性4份，特异性为93.33％(56/60)，表明本荧光微球免疫层析试纸条能够应用于人体血清中恙虫病东方体抗体的检测。
[0109]
对比例1：抗原夹心法检测恙虫病东方体抗体荧光免疫层析试纸条与胶体金试纸条的对比
[0110]
1.胶体金试纸条的制备
[0111]
(1)胶体金的合成
[0112]
实验过程中所有和溶液接触的器皿用王水浸泡24h，用超纯水清洗干净。将98ml的超纯水装入双颈瓶中，再加入2ml 2％氯金酸溶液，搅拌混匀。将油浴锅温度设置成128℃，当氯金酸溶液沸腾后，迅速加入10ml 38.8mm的柠檬酸三钠溶液。持续加热20
‑
30min后，关闭油浴锅，待双颈烧瓶冷却后，分装，4℃保存。
[0113]
(2)胶体金
‑
抗原复合物的制备
[0114]
1)准确量取10ml步骤(1)合成的胶体金加入50ml锥形瓶中，加入k2co3液调节至ph＝8.5，并利用磁力搅拌器搅拌均匀。
[0115]
2)将40μg实施例1步骤1所制备的混合重组抗原缓慢加入步骤1)所得胶体金溶液
中，在5min内滴加完毕。匀速搅拌30min后，缓慢加入1ml 1％的peg
‑
20000。继续匀速搅拌30min，缓慢加入1ml 10％的bsa溶液。继续匀速搅拌30min后，得到标记好的免疫胶体金，将其转移至洁净的50ml离心管中，于4℃过夜静置。次日，12000rpm，4℃离心20min。小心吸出上清，用1/10体积复溶液(1g蔗糖、0.1g bsa、0.1g peg
‑
20000、100μl吐温20溶液溶解在0.01m的tris溶液中)溶解金标沉淀，喷洒在金标垫上。
[0116]
(3)免疫层析试纸条的组装
[0117]
如图10所示，将处理后的样品垫b、金标垫c、硝酸纤维素膜d、吸水垫g及底板a五部分按顺序组装。撕开底板粘纸，将硝酸纤维素膜贴在底板中间位置。将金标垫贴在硝酸纤维素膜下方重叠0.2cm，将样品垫贴于金标垫下方重叠0.2cm。最后，将吸水垫贴于硝酸纤维素膜上方重叠0.2cm。组装完成后，压实并切成0.4cm的试纸条。最后放入装有干燥机的铝箔袋，封口机封口，于4℃保存。
[0118]
2.荧光免疫层析试纸条与胶体金试纸条的对比
[0119]
同实施例3的方法测定试纸条灵敏度，具体为：胶体金试纸条检测限为61ng/ml，荧光微球免疫层析试纸条检测限为7.63ng/ml。
[0120]
用胶体金试纸条检测已经过临床诊断及elisa实验验证过的病人血清样本，其中检出阳性样本103例，检测敏感性91.96％(103/112)，对60份阴性样本检测：54份为阴性，6份检出阳性，检测特异性为90％(54/60)。而荧光微球免疫层析试纸条检测时，其中阳性血清112份中检出阳性106份，检测敏感性为94.64％(106/112)，阴性样本中，检出阴性样本56份，阳性4份，特异性为93.33％(56/60)。表明荧光微球免疫层析试纸条的检测优于胶体金免疫层析试纸条。
[0121]
本发明提供了一种检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。