一种调节阪崎克罗诺杆菌耐压强胁迫的蛋白、其编码基因及应用的制作方法

1.本发明具体涉及一种调节阪崎克罗诺杆菌耐压强胁迫的蛋白、其编码基因及应用，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.随着科技的飞速发展，食品种类日益繁多，这为食品安全带来了巨大挑战——食源性致病菌种类的增加为当今食品工业常用的灭菌技术提出了难题。
3.阪崎克罗诺杆菌是一种高致病食源性肠杆菌，该属的细菌是生活于人和动物肠道内的兼性厌氧革兰氏阴性杆菌，隶属于肠杆菌科。其感染的大多数病例都是婴幼儿，主要引起菌血症、脑膜炎、坏死性小肠结肠炎等，致死率高达40％
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80％。这是因为阪崎克罗诺杆菌主要存在于婴幼儿配方奶粉中，但在其他的婴幼儿食品中也同样可以检测出阪崎克罗诺杆菌。由于阪崎克罗诺杆菌优秀的耐干燥特性，使得作为我国居民主要饮食成分的米粉和面粉成为其天然的储存场所。另外，果蔬表面、熟食制品等食品及自来水管道、奶粉冲调器、食品加工工厂等环境中也可以检测到阪崎克罗诺杆菌的存在。
4.传统的食品灭菌方法主要通过控制温度、改变食品水分活度以及化学试剂的化学作用等达到灭菌目的，但易造成食品中对热敏感的营养素的破坏和流失，引起化学剂物质残留、增加微生物的抗性等问题。超高压灭菌作为一种新型杀菌技术，与传统灭菌方式相比，杀菌的同时对蛋白质、维生素、风味等物质的共价键没有影响，可以保持食品风味、保留营养物质、增加蛋白质食品对蛋白酶的敏感度，提高食品可消化性和降低敏感性。但由于其设备成本较高、灭菌过程具有间歇性等原因，许多食品公司对超高压灭菌技术持保守态度。
5.阪崎克罗诺杆菌由于其致密的生物膜结构，对于高压刺激具有较好的稳定性，所以如果找到一种可以调节阪崎克罗诺杆菌生物膜结构的功能基因，则可以控制阪崎克罗诺杆菌对于压力的耐受性，这对于高压杀菌具有重要的实践意义，但迄今未见相关报道。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的在于提供一种调节阪崎克罗诺杆菌耐压强胁迫的蛋白、其编码基因及应用，以克服现有技术中的不足。
7.为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
8.本发明实施例提供了一种调节阪崎克罗诺杆菌耐压强胁迫的基因，其具有seq id no：2所示序列。
9.本发明实施例提供了一种调节阪崎克罗诺杆菌耐压强胁迫的蛋白，其编码基因具有seq id no：2所示序列。
10.本发明实施例还提供了包含具有seq id no：2所示序列的基因的载体。
11.本发明实施例还提供了包含具有seq id no：2所示序列的基因的宿主细胞。
12.进一步的，所述宿主细胞为阪崎克罗诺杆菌。
13.本发明实施例还提供了具有seq id no：2所示序列的基因在调控阪崎克罗诺杆菌的压力耐受性中的应用。
14.本发明实施例还提供了一种降低阪崎克罗诺杆菌的压力耐受性的方法，其包括：在阪崎克罗诺杆菌中表达由seq id no：2所示基因编码的蛋白。
15.进一步的，所述降低阪崎克罗诺杆菌的压力耐受性的方法包括：构建包含seq id no：2所示基因的表达载体，并将所述导入阪崎克罗诺杆菌。
16.本发明实施例还提供了一种试剂盒，其包括seq id no：2所示基因、其编码的蛋白或包含该基因的载体。
17.本发明实施例还提供了seq id no：2所示基因、其编码的蛋白或包含该基因的载体在制备用于灭杀阪崎克罗诺杆菌的产品中的用途。
18.相较于现有技术，本发明的技术方案可以明显降低阪崎克罗诺杆菌细胞膜的完整性，使得阪崎克罗诺杆菌的抗压性能大幅减弱，不仅可以有效抑制阪崎克罗诺杆菌菌膜的形成，还可以在较低压力下实现较好的阪崎克罗诺杆菌杀灭效果，在食品安全等领域有广阔应用前景。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
20.图1a是阪崎克罗诺杆菌在50mpa和400mpa下的差异基因kegg富集散点图；
21.图1b是阪崎克罗诺杆菌在0mpa和400mpa下的cpx双组分系统基因表达量分析图；
22.图2a为本发明实施例中交叠扩增片段的凝胶电泳检测结果(图2a
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图2d中的数字1
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23为泳道编号)，其中，泳道1：dl2000 dna marker，泳道23：融合ab片段；
23.图2b为本发明实施例中plp12cm
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atcc质粒的凝胶电泳检测结果，其中，泳道5：dl2000dnamarker，泳道1
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4：阳性重组克隆；
24.图2c为本发明实施例中atcc插入突变株的凝胶电泳检测结果，其中，泳道7：dl2000dnamarker，泳道6：阳性克隆；
25.图2d为本发明实施例中atcc缺失突变的凝胶电泳检测结果，其中，泳道8：dl2000dnamarker，泳道1
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6：缺失突变株，泳道7：β2163(p1p12cm
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atcc)阴性对照)；
26.图3a为超高压处理对阪崎克罗诺杆突变菌δcpxa的影响的检测结果；
27.图3b为超高压处理对阪崎克罗诺杆菌野生菌株和突变菌δcpxa致死率的对比图；
28.图4a为超高压处理对阪崎克罗诺杆菌野生菌株和δcpxa突变菌株细胞膜影响的对比，其中处理压强为0mpa；
29.图4b为超高压处理对阪崎克罗诺杆菌野生菌株和δcpxa突变菌株细胞膜影响的对比，其中处理压强为50mpa；
30.图4c为超高压处理对阪崎克罗诺杆菌野生菌株和δcpxa突变菌株细胞膜影响的对比，其中处理压强为400mpa；
31.图5a为超高压处理对阪崎克罗诺杆菌野生菌株和δcpxa突变菌株胞内核酸泄漏
的对比；
32.图5b为超高压处理对阪崎克罗诺杆菌野生菌株和δcpxa突变菌株胞内蛋白泄漏的对比；
33.图5c为超高压处理对阪崎克罗诺杆菌野生菌株和δcpxa突变菌株胞内k

泄漏的对比；
34.图6a为超高压处理对阪崎克罗诺杆菌野生菌株和δcpxa突变菌株菌膜形成能力影响的对比，其中处理压强为0mpa；
35.图6b为超高压处理对阪崎克罗诺杆菌野生菌株和δcpxa突变菌株菌膜形成能力影响的对比，其中处理压强为50mpa；
36.图6c为超高压处理对阪崎克罗诺杆菌野生菌株和δcpxa突变菌株菌膜形成能力影响的对比，其中处理压强为400mpa。
具体实施方式
37.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
38.本发明利用基因工程技术敲除了阪崎克罗诺杆菌的耐高压基因(将seq id no：1所示基因序列突变为seq id no：2所述基因序列)，降低了组氨酸激酶的表达，从而降低了细胞膜的完整性和菌膜的形成，使得阪崎克罗诺杆菌的抗高压性能降低。
39.进一步的，野生型阪崎克罗诺杆菌的耐压强胁迫基因可以被命名为cpxa，其序列为seq id no：1所示，主要来源于革兰氏阴性菌中的双组分调控系统
‑‑
cpx系统。cpxa作为压力传感器通过转移磷酸基团使转录因子cpxr磷酸化，通过调节dna的转录，进而影响细胞膜完整性和菌膜形成。本发明所述cpxa基因的突变体δcpxa的序列如seq id no：2所示，其可以使阪崎克罗诺杆菌在50mpa压力下致死率为36.1％，相比于野生型增加了9％，显著降低了阪崎克罗诺杆菌的抗压性能。
40.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。
41.实施例1阪崎克罗诺杆菌cpxa基因差异性表达的发现
42.将5ml调整好浓度的阪崎克罗诺杆菌菌悬液(约108cfu/ml)分装到10ml聚乙烯塑料袋中包装封口在50mpa和400mpa条件下进行10min超高压处理。然后使用kobas软件分析kegg通路中差异表达基因的统计富集。发现50mpa处理后双组分调控系统(two
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component system)发生了差异性表达，参见图1a。对阪崎克罗诺杆菌400mpa超高压条件下差异表达基因进行q
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pcr验证，可以看出，400mpa条件下，阪崎克罗诺杆菌cpx双组分调控系统中表达组氨酸激酶的cpxa基因转录水平发生下调，参见图1b，说明在高压环境胁迫下，阪崎克罗诺杆菌cpx双组分调控系统中感应器受到损伤，对外界信号的感应能力减弱，并预期破坏了该双
组份系统所调控的压力响应过程。由此可进行推论，高压胁迫可能通过对关键的双组份系统的损伤达到了抑菌效果。
43.实施例2阪崎克罗诺杆菌cpxa基因的克隆
44.提取阪崎克罗诺杆菌的基因组dna为模板，根据目的基因的基因组序列设计以下引物：
45.正向引物为cpxaf：agggcacgatgattgagca
46.反向引物为cpxar：ctgaccgataaagttgcgaatg
47.经过测序，阪崎克罗诺杆菌cpxa的pcr扩增产物具有seq id no：1所示核苷酸序列。
48.实施例3阪崎克罗诺杆菌突变体δcpxa的构建
49.根据阪崎克罗诺杆菌的基因组dna序列设计以下引物：
50.atcc
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tf：gtccctgttaaaggaattgctcg
51.atcc
‑
tr：atcagcatttcaacggcatca
52.atcc
‑
mf1：ggaatctagaccttgagtcgttgctcgacgtgatgatgcc
53.atcc
‑
mr1：gtgataaagcggcaaccagagccagaaaatggcgaagatgc
54.atcc
‑
mf2：gcatcttcgccattttctggctctggttgccgctttatcac
55.atcc
‑
mr2：acagctagcgacgatatgtctttgttgtttctgacggtggc
56.plp
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uf：gacacagttgtaactggtcca
57.plp
‑
ur：caggaacacttaacggctgac
58.分别以atcc
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mf1/atcc
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mr1和atcc
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mf2/atcc
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mr2扩增，获得atcc上游同源臂a片段和atcc下游同源臂b片段。再以上述a、b片段为模板，进行交叠pcr扩增获得融合ab片段，参见图2a。将ab纯化片段与自杀载体plp12cm进行连接，重组产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。用plp
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uf/plp
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ur筛选ab插入的重组克隆，检测结果如图2b所示。阳性克隆纯化后扩大培养，并提取质粒plp12cm
‑
atcc，将plp12cm
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atcc转化大肠杆菌β2163，挑取阳性克隆，划线纯化培养。最后将大肠杆菌β2163(plp12cm
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atcc)与阪崎肠杆菌分别过夜培养，稀释涂布lb平板，供体菌大肠杆菌β2163因缺陷型不能在lb平板生长，只有质粒插入到染色体指定位点的阪崎肠杆菌能存活。再以atcc
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tf/plp
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utr对克隆进行检测，结果如图2c所示。取上图插入株对应克隆，以引物atcc
‑
tf/atcc
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tr进行检测，结果如图2d所示。克隆纯化后，再次扩增验证，并递交pcr产物测序，结果如seq id no：2所示，测序结果证实阪崎肠克罗诺菌atcc缺失突变株(δcpxa)构建成功。
59.实施例4阪崎克罗诺杆菌野生株和突变株(δcpxa)耐压力性能比较
60.1.超高压对δcpxa突变菌株的影响
61.参见图3a
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图3b，分别将调整好浓度的δcpxa突变菌株菌悬液(约108cfu/ml)在50mpa和400mpa条件下进行10min超高压处理。可知与野生菌株相比，cpxa基因的缺失使得δcpxa菌株在超高压条件下致死增加，在50mpa条件下，差异极显著，与相同条件处理后的野生菌株相比，致死率提高了约9％。表明，双组分调控基因中的cpxa基因的缺失使得阪崎克罗诺杆菌对超高压的抵抗能力降低，双组分调控系统参与了阪崎克罗诺杆菌对压强压力的响应。
62.2.阪崎克罗诺杆菌野生菌株和δcpxa突变菌株细胞膜通透性的比较
63.参见图4a
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图4c，将超高压处理后的野生菌株和δcpxa突变菌株进行pi染色，并在荧光显微镜下观察。结果发现在50mpa条件下δcpxa菌株死亡的数量比野生菌株多。说明cpxa可能通过影响细胞膜完整性的方式赋予菌体相应的压力拮抗能力。
64.3.阪崎克罗诺杆菌野生菌株和δcpxa突变菌株胞内物质泄漏的比较
65.1)核酸泄漏的比较
66.参见图5a，通过测定未处理组和处理组的无细胞滤液在260nm(od260)处的光密度，评估野生菌株和δcpxa突变菌株在50mpa和400mpa各处理10min后细胞内核酸的泄漏情况。发现与野生菌株相比，δcpxa在50mpa条件下泄漏至外环境中的核酸显著增加。体现出了cpxa在临界致死条件下的调控作用。
67.2)蛋白泄漏的比较
68.参见图5b，通过bca法，检测被蛋白还原的cu

与bca试剂形成紫色络合物在562nm处吸光度，计算出泄漏蛋白的浓度。可以看出cpxa基因的缺失使得菌株在在两个压强处理条件下胞内蛋白泄漏程度与野生菌株相比具有显著性，50mpa条件下泄漏情况更严重。这表明cpxa的缺失破坏了细菌对胞质整体性的控制，并强化了超高压处理的抑菌效果。
69.3)胞内k

泄漏的比较
70.参见图5c，k

在维持细胞渗透压、参与细胞膜形成中至关重要。虽然在未处理与超高压处理条件下，胞内的k

均有泄漏，但超高压处理后的δcpxa突变菌株泄漏情况更为严重。
71.与野生菌株相比，cpxa基因的缺失使得δcpxa突变菌株在超高压处理下死亡率增加，通过pi染色结果和胞内物质泄漏情况对比可以证实，该基因的缺失削弱了阪崎克罗诺杆菌在超高压环境下的抗压能力，加速了细胞的死亡。
72.4.阪崎克罗诺杆菌野生菌株和δcpxa突变菌株菌膜形成能力的比较
73.参见图6a
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图6c，菌膜的形成是阪崎克罗诺杆菌的特性之一，也是其致病机之一。根据菌膜形成量与结晶紫染色在od590处吸光度间成正比的关系分析cpxa基因的缺失对阪崎克罗诺杆菌在超高压处理后菌膜形成能力的影响。总体上实验组随着处理压强的增加生物膜形成能力降低，两株菌株在相同菌膜培养条件和培养时间下，δcpxa菌株菌膜分解速度下降，老化脱落期延长。相同处理条件下，不同时间段的野生菌株和δcpxa突变菌株形成菌膜的能力不同，由图可以看出，δcpxa主要影响了菌膜初期的形成，不同处理条件的12hδcpxa突变菌株菌膜形成量均比野生菌株少，且具有显著性。
74.应当理解，以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。