一种可逆的Ca的制作方法

一种可逆的ca
2
识别配体meth及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于离子识别传感技术领域，涉及一种可逆的ca
2
识别配体meth及其制备方法和应用。


背景技术：

2.钙在生物体的各项生理活动中起重要而多样的作用。它广泛参与维持细胞膜两侧的膜电位，维持神经传导功能和肌肉伸缩和舒张功能，以及促进一些激素的效果。此外，细胞内ca
2
作为第二信使参与调节神经元的胞内和胞外作用、树突生长、基因转录和记忆存储。细胞外ca
2
也被报道作为信使与细胞外钙敏感受体(casr)相互作用，调节信号传导，增殖和凋亡的癌细胞。而且，一些常见的脑疾病如脑出血、脑缺血、癫痫等常导致神经元去极化，使细胞外ca
2
在疾病出现和治疗阶段发生快速的变化。因此，实时跟踪监测ca
2
在神经元外的局部微环境中的变化，具有重要的生理和病理学意义。
3.目前已有很多方法被开发用于生物中ca
2
的检测，比如紫外
‑
可见吸收光谱法、拉曼光谱法、荧光光谱法以及电化学方法等。其中有机荧光ca
2
探针已经被研发出多种类别和型号并被广泛应用于生物组织切片和神经元的ca
2
成像。然而这些方法中绝大多数对于ca
2
的识别和监测过程是不可逆的，无法用于实时跟踪活体中ca
2
的动态变化。因此同时具有高选择性和高可逆性的ca
2
识别配体的研发将为长期追踪生物体中ca
2
的实时动态变化提供新的研究工具。
4.此外，配体的修饰方法也是构建探针和生物传感器中的重要因素。分子自组装膜，特别是自组装单分子膜(sams)，是分子自组装研究最多的领域，并且得到了广泛的应用。其可通过含有自由运动的端基，例如硫醇，炔基等的有机分子(脂肪族或者芳香族)对电极表面改性，赋予了传感器表面新的功能。目前还未见报道将可逆离子选择性配体以自组装单分子膜的形式修饰于传感器表面以组成可逆ca
2
传感器的应用。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种可逆的ca
2
识别配体meth及其制备方法和在构建可逆ca
2
选择性微电极中的应用。本发明先合成一种可逆的ca
2
识别配体meth，然后将所述meth通过金属炔键修饰于包裹有氧化石墨烯的镀金碳纤维电极表面，构建得到可逆的ca
2
离子选择性电极meth
‑
e，可实现对ca
2
的可逆动态追踪检测。
6.本发明所述的可逆的ca
2
识别配体meth具有选择性好，可逆性好的优点。基于其构建的可逆的ca
2
离子选择性电极meth
‑
e可用于ca
2
浓度的长期可逆实时检测。当溶液中存在ca
2
时，meth可以与ca(h2o)
32
弱结合并形成配合物。因此基于其构建的可逆的ca
2
离子选择性微电极在随着ca
2
在溶液中浓度增加时，电极表面富集了大量的ca
2
离子而使电极的开路电位逐渐增加。并且进一步地，随着ca
2
浓度的降低，已结合的ca
2
能够从电极表面解离并使电极的开路电位可逆地下降。从而使溶液中ca
2
浓度与电极的开路电位建立可逆的线性关系。
7.本发明提供了一种可逆的ca
2
识别配体meth的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
8.步骤(i)、将胺类物质1、二甘醇酐混合于二氯甲烷中，搅拌反应，得到2
‑
(2
‑
(二环己基氨基)
‑2‑
氧乙氧基)乙酸；
9.步骤(ii)、2
‑
(2
‑
(二环己基氨基)
‑2‑
氧乙氧基)乙酸，胺类物质2，edci和hobt在二氯甲烷中混合搅拌反应，得到可逆ca
2
识别配体meth；
10.步骤(i)中，所述胺类物质1和二甘醇酐的摩尔比为(0.5
‑
2)：(0.5
‑
2)，优选地，为1：1。
11.步骤(i)中，所述二氯甲烷的加入量为50
‑
100ml；优选地，为100ml。
12.步骤(i)中，所述反应的温度为15
‑
30℃；优选地，为30℃。
13.步骤(i)中，所述反应的时间为2
‑
3h；优选地，为2h。
14.步骤(i)中，在反应之后还包括后处理过程：反应结束后，然后用水清洗多次，蒸发除去多余的二氯甲烷。
15.其中，所述清洗用水为超纯水。
16.步骤(i)中，所述胺类物质1选自二环己胺、二苯胺、二正丙胺、二丁胺、二异丁胺等中的一种或多种；优选地，为二环己胺。
17.步骤(ii)中，所述2
‑
(2
‑
(二环己基氨基)
‑2‑
氧乙氧基)乙酸，胺类物质2，edci和hobt的摩尔比为(0.5
‑
1)：(1
‑
2)：(1
‑
2)：(1
‑
2)，优选地，为1：1：2：2。
18.步骤(ii)中，所述二氯甲烷的加入量为50
‑
100ml；优选地，为100ml。
19.步骤(ii)中，所述反应的温度为15
‑
30℃；优选地，为30℃。
20.步骤(ii)中，所述反应的时间为6
‑
8h；优选地，为6h。
21.步骤(ii)中，在搅拌反应后还包括后处理过程：反应结束后，用水洗多次后蒸发除去过量的二氯甲烷。
22.其中，所述清洗用水为超纯水。
23.步骤(ii)中，所述胺类物质2选自二炔丙胺、炔丙胺等中的一种或多种；优选地，为二炔丙胺。
24.在一个具体实施方式中，所述可逆的ca
2
识别配体meth的制备方法包括以下步骤：
25.步骤(i)、将二环己胺、二甘醇酐混合于二氯甲烷中，搅拌反应，得到2
‑
(2
‑
(二环己基氨基)
‑2‑
氧乙氧基)乙酸；反应过程如反应式(1)所示：
[0026][0027]
步骤(ii)、2
‑
(2
‑
(二环己基氨基)
‑2‑
氧乙氧基)乙酸，二炔丙胺，edci和hobt在二氯甲烷中混合搅拌反应，得到可逆ca
2
识别配体meth；反应过程如反应式(2)所示：
[0028][0029]
所述制备可逆的ca
2
识别配体meth的反应式如下式所示：
[0030][0031]
本发明还提供了一种可逆ca
2
选择性微电极meth
‑
e的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0032]
步骤一、使用含有参比电极的三电极体系，在室温条件下，将碳纤维电极浸泡在氯金酸溶液中。使用电化学工作站连接电极，设置恒电位电沉积，得到镀金碳纤维电极。
[0033]
其中，所述参比电极为ag/agcl电极，辅助电极为铂丝电极，工作电极为碳纤维电极。
[0034]
其中，所述氯金酸溶液的浓度为0.001
‑
0.1m；优选地，为0.1m。
[0035]
其中，所述电位设置为
‑
0.02～
‑
0.3v；优选地，为
‑
0.1v。
[0036]
其中，所述沉积时间为10
‑
120秒；优选地，为15秒。
[0037]
步骤二、将步骤一制备获得的镀金碳纤维电极浸泡在氧化石墨烯悬浮液中；使用电化学工作站连接电极，设置恒电位电沉积，得到包裹有氧化石墨烯的镀金碳纤维电极。
[0038]
其中，所述氧化石墨烯悬浮液的浓度为0.05
‑
2.00mg/ml；优选地，为2.00mg/ml。
[0039]
其中，所述电位设置为恒电位设置为0.2
‑
1.0v；优选地，为0.8v
[0040]
其中，所述沉积时间设置为10
‑
60min；优选地，为30min。
[0041]
步骤三、将制备好的包裹有氧化石墨烯的镀金碳纤维电极浸入上述制备获得的meth的乙醇溶液中，在无氧环境下浸泡，随后空气中干燥，得到可逆的ca
2
选择性电极meth
‑
e。
[0042]
其中，meth的乙醇溶液的浓度为1
‑
10mm；优选地，为1mm。
[0043]
其中，所述浸泡的温度为60
‑
80℃；优选地，为60℃。
[0044]
其中，所述浸泡的时间为10
‑
20小时；优选地，为15小时。
[0045]
其中，所述干燥的时间为12
‑
24小时；优选地，为24小时。
[0046]
本发明所述的可逆ca
2
识别配体meth经dft计算，其与ca
2
的自由结合能仅为
‑
1.2kcal/mol，弱于常规的ca
2
配体(通常小于
‑
5kcal/mol)，这是其具有高可逆性的重要原因。此外该可逆ca
2
识别配体meth经dft计算其可与ca
2
(h20)3形成稳定配合物，因此相比于直接结合ca
2
的配体，meth在低ca
2
浓度条件时所结合的ca
2
更容易从电极表面解离从而获得极佳的可逆性。
[0047]
本发明还提供了由上述制备方法制备得到的可逆ca
2
识别配体meth。
[0048]
本发明还提供了所述可逆ca
2
识别配体meth在制备ca
2
传感器和/或可逆ca
2
选择性电极meth
‑
e中的应用。
[0049]
本发明还提供了由上述制备方法制备得到的可逆ca
2
选择性微电极meth
‑
e。
[0050]
本发明还提供了所述可逆ca
2
选择性电极meth
‑
e在检测ca
2
，和/或在监测以及药物机理研究中的应用。
[0051]
所述ca
2
的具体检测步骤为：
[0052]
ca
2
检测：将上述步骤制备得到的可逆ca
2
选择性电极meth
‑
e作为工作电极连接在三电极体系上，将电极插入10ml的检测池，检测池内含去除ca
2
的人工脑脊液，每次加入10μl梯度浓度的ca
2
溶液，然后检测电极的开路电位。随着加入体积的增加，电极的开路电位逐渐增加，随后将检测池依次更换为浓度减小的ca
2
在人工脑脊液中的溶液，电极的开路电位逐渐减小，最终ca
2
浓度和开路电位在10.0
‑
31.6mm范围内展现良好线性，检测限为5.91μm。可用于ca
2
的可逆检测。
[0053]
本发明还提供了所述可逆ca
2
识别配体meth所构建的可逆ca
2
选择性电极meth
‑
e在鼠脑连续检测中的应用。
[0054]
本发明的有益效果包括：本发明首先合成了一种可逆的ca
2
识别配体meth，然后将所述meth通过金属炔键修饰于包裹有氧化石墨烯的镀金碳纤维电极表面，构建得到可逆的ca
2
离子选择性电极meth
‑
e。该ca
2
识别配体meth具有选择性好，可逆性好的优点。基于其构建的可逆的ca
2
离子选择性电极meth
‑
e可用于ca
2
浓度的长期可逆实时检测。
附图说明
[0055]
图1是本发明裸碳纤维电极(a)，镀金碳纤维电极(b)，氧化石墨烯修饰镀金碳纤维电极(c)以及钙离子配体修饰氧化石墨烯修饰镀金碳纤维电极(d)的x射线光电子能谱(xps)，其中分别为金元素(a)，氮元素(b)以及碳元素(c)的高分辨能谱图。
[0056]
图2是本发明可逆钙离子配体修饰氧化石墨烯修饰镀金碳纤维电极对不同钙离子浓度响应的浓度增加曲线(a)和浓度降低曲线(b)。小图是浓度响应曲线的线性拟合线。
[0057]
图3是本发明可逆钙离子配体修饰氧化石墨烯修饰镀金碳纤维电极对ca
2
的选择性和干扰性实验。左边的柱状图为ca
2
与可能的干扰金属离子(a)、神经递质(b)、活性氧和活性氮(c)以及氨基酸(d)共存时的情况。右边的柱状图为单独存在干扰离子时的情况。ca
2
浓度为10μm，k

和na

浓度为100μm，cu
2
和fe
3
浓度为1μm，aa浓度为40μm，其余均为10μm。
[0058]
图4是本发明可逆钙离子配体修饰氧化石墨烯修饰镀金碳纤维电极在脑缺血20分钟实验中对小鼠7个脑区ca
2
的连续监测。
具体实施方式
[0059]
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
[0060]
实施例1
[0061]
可逆ca
2
识别配体meth的制备：将二环己胺(3.62g,20mmol)、二甘醇酐(2.32g,20mmol)混合于100ml二氯甲烷中，30℃搅拌2h，然后用超纯水冲洗至少三次，蒸发除去多余的二氯甲烷。得到2
‑
(2
‑
(二环己基氨基)
‑2‑
氧乙氧基)乙酸(5.81g)。产率:90％。接下来,2
‑
(2
‑
(二环己基氨基)
‑2‑
氧乙氧基)乙酸(2.97g,10mmol),dipropargylamine(1.86g,
20mmol)，edci(3.82g,20mmol)和hobt(2.70g,20mmol)在100毫升的二氯甲烷中于30℃搅拌6h。接着混合物用超纯水清洗至少5次并旋蒸除去过量的二氯甲烷。得到meth。产率:88％。
[0062]1h nmr(500mhz,cdcl3)δ(ppm):4.40(s,2h),4.30(d,4h),4.23(s,2h),3.31(s,1h),2.94(s,1h),2.30(s,2h),2.24(d,2h),1.07
‑
1.82(m,18h).
[0063]
13
c nmr(500mhz,cdcl3)δ(ppm):168.61,167.53,73.17,72.57,70.36,69.56,56.80,56.12,35.42,33.99,31.19,29.88,26.54,25.77,25.30,25.17。
[0064]
实施例2
[0065]
可逆ca
2
选择性电极meth
‑
e的制备：使用含有参比电极的三电极体系，在室温条件下，将碳纤维电极浸泡在氯金酸溶液(0.1m)中。使用电化学工作站连接电极，设置恒电位(
‑
0.1v)电沉积15秒，得到镀金碳纤维电极。将该镀金碳纤维电极浸泡在2mg/ml氧化石墨烯悬浮液中。使用电化学工作站连接电极，设置恒电位0.8v电沉积30min，得到包裹有氧化石墨烯的镀金碳纤维电极。将制备好的包裹有氧化石墨烯的镀金碳纤维电极浸入meth的乙醇溶液(1mm)中，在60℃下无氧环境下浸泡15小时，随后空气中干燥24小时，得到可逆的ca
2
选择性电极meth
‑
e。
[0066]
图1是裸碳纤维电极(a)，镀金碳纤维电极(b)，氧化石墨烯修饰镀金碳纤维电极(c)以及钙离子配体修饰氧化石墨烯修饰镀金碳纤维电极(d)的x射线光电子能谱(xps)，其中分别为金元素(a)，氮元素(b)以及碳元素(c)的高分辨能谱图。其中氮元素和碳元素的信号证明了配体已经成功在电极表面修饰。
[0067]
实施例3
[0068]
可逆ca
2
选择性电极meth
‑
e用于ca
2
的可逆定量检测。将制备得到的可逆ca
2
选择性电极meth
‑
e作为工作电极连接在三电极体系上，将电极插入10ml的检测池，检测池内含去除ca
2
的人工脑脊液，每次加入10μl梯度浓度的ca
2
溶液，然后检测电极的开路电位。随着加入体积的增加，电极的开路电位逐渐增加，随后将检测池依次更换为浓度减小的ca
2
在人工脑脊液中的溶液，电极的开路电位逐渐减小。
[0069]
图2是可逆钙离子配体修饰氧化石墨烯修饰镀金碳纤维电极对不同钙离子浓度响应的浓度增加曲线(a)和浓度降低曲线(b)。小图是浓度响应曲线的线性拟合线。最终图2a和b两图中ca
2
浓度和开路电位在10.0
‑
31.6mm范围内展现良好线性，线性方程为δe
ise
＝e0 0.021*lg a(ca
2
)
‑
e
re
‑
e
ire
，检测限为5.91μm。证明本发明中的可逆ca
2
选择性电极meth
‑
e可用于ca
2
的可逆定量检测。
[0070]
实施例4
[0071]
可逆ca
2
选择性电极meth
‑
e的电极选择性研究。为了探究本发明中ca
2
选择性电极meth
‑
e对于常见干扰物的影响，分别考察了分别考察了常见金属离子(na

、k

、cu
2
、fe
3
、zn
2
、al
3
、ag

、hg
2
、fe
2
)、神经递质(aa、da、ua、gaba)、氨基酸(cys、val、leu、gly、thr、ala、gln、his、lys和arg)及常见活性氧/活性氮(clo、no2‑
、no3‑
、h2o2)单独存在与ca
2
共存时，记录开路电位的变化。其中，ca
2
浓度为10μm，k

和na

浓度为100μm，cu
2
和fe
3
浓度为1μm，aa浓度为40μm，其余均为10μm。由图3可知，左边的柱状图为ca
2
与可能的干扰金属离子(a)、神经递质(b)活性氧和活性氮(c)以及氨基酸(d)共存时的情况，这些干扰物的影响均小于3％。
[0072]
实施例5
[0073]
可逆ca
2
选择性电极meth
‑
e用于小鼠多脑区ca
2
的连续监测。动物模型的制备由
华东师范大学的公共动物护理和使用委员会批准通过的。实验所用c57大鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司。成年雄性c57小鼠(15
‑
20g)采用气体异氟醚麻醉小鼠(abs小动物气体麻醉机)，异氟醚诱导麻醉浓度为5mg ml
‑
1，持续麻醉浓度为2mg ml
‑
1。在手术过程中，老鼠被包裹在一个加热垫中，以保持体温在37℃。为了在大脑中进行测量，老鼠被固定在一个立体定位仪上。微电极植入在老鼠大脑的初级运动皮层(m1,ap＝
‑
1.2毫米,l＝1.0毫米,v＝0.52毫米),初级躯体感觉桶皮层(s1bf,ap＝
‑
1.2毫米,l＝2.8毫米,v＝1.2毫米),cornu ammonis 1(ca1,ap＝
‑
1.2毫米,l＝0.6毫米,v＝1.3毫米),dentate gyrus(dg,ap＝
‑
1.2毫米,l＝0.3毫米,v＝1.8毫米),lateral dorsal(ld,ap＝
‑
1.2毫米,l＝1.2毫米,v＝2.5毫米),caudate
‑
putamen(cpu,ap＝
‑
1.2毫米,l＝2.5毫米,v＝2.4毫米),和reticular nuclei(rt,ap＝
‑
1.2毫米,l＝1.7毫米,v＝3.2毫米)。mcao脑缺血手术，取小鼠仰卧位固定，沿胸锁乳突肌内侧缘分离肌肉和筋膜。分离左颈总动脉(cca)、颈外动脉(eca)、颈内动脉(ica)。然后，在距颈动脉分叉处4mm处切开一个小切口，小心地将线拴插入ica。血管分叉处的距离一般保持在18mm，使小鼠大脑中大脑动脉闭塞。小心地从小鼠大脑中取出线拴，获得脑血灌注。
[0074]
如图4所示，是可逆钙离子配体修饰氧化石墨烯修饰镀金碳纤维电极在脑缺血20分钟实验中对小鼠7个脑区ca
2
的连续监测。缺血20分钟时，表层皮层区域(m1，s1bf)的胞外ca
2
浓度在1.11
‑
1.24min后发生变化，海马区(ca1，dg)的胞外ca
2
浓度在2.44
‑
2.71min后发生变化，而深部区域(ld，cpu，rt)响应在4.44
‑
4.75分钟之后。同时，浅表脑区域(m1，s1bf，ca1，dg)的胞外ca
2
浓度下降速率为0.25
‑
0.31mm/min，比深部脑区域(ld，cpu，rt)的0.10
‑
0.11mm更快。在缺血结束20分钟后，浅表脑区域(m1，s1bf，ca1，dg)的细胞外[ca
2
]最终降至0.15
‑
0.21mm，远低于深部脑区域的0.43
‑
0.63mm(ld，cpu，rt)。这些数据表明每个大脑区域对局部缺血的敏感性不同。将缺血的持续时间延长至45和90分钟。观察到在缺血结束45分钟和90分钟时，胞外ca
2
浓度分别降低至相对于缺血20分钟的50％
‑
60％和27％
‑
45％。这些体内数据表明，随着缺血时间的延长，胞外ca
2
浓度的减少变得更加严重。
[0075]
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。