蛔甙在制备提高S.carpocapsaeAll线虫产量制剂中的应用的制作方法

蛔甙在制备提高s.carpocapsae all线虫产量制剂中的应用
技术领域：
1.本发明属于生物农药研发领域，具体涉及蛔甙在制备提高s.carpocapsae all线虫产量制剂中的应用。


背景技术：

2.昆虫病原斯氏线虫属steinernema和异小杆线虫属heterorhabditis线虫是具有巨大应用潜力的天敌类杀虫制剂，已广泛用于防治农林、牧草、花卉和卫生等领域的害虫。这类线虫以3龄感染期虫态主动搜索寄主昆虫，对非靶标生物和环境安全，可规模化生产。昆虫病原线虫以感染期虫态随寄主食物或从昆虫的自然开口(如肛门、气门)、节间膜进入昆虫体内，随后释放肠腔中携带的xenorhabdus属(与斯氏线虫steinernema共生)或photorhabdus属(与异小杆线虫heterorhabditis共生)共生细菌。线虫以及共生细菌分泌的毒素(毒性因子)导致昆虫死亡，然后线虫利用共生细菌转化寄主体内的营养物质繁殖后代。
3.昆虫病原线虫培养方法主要有活体培养(in vivo)和离体培养(in vitro)。活体培养技术是利用敏感且容易饲养的昆虫寄主来培养昆虫病原线虫，目前主要使用的是大蜡螟幼虫galleria mellonella。离体培养主要包括固体培养和液体培养。固体培养是在含有海绵填充剂的培养基中加入单一共生细菌和无菌线虫构建的；这一培养方法适应性广，设备和培养基成本低廉，但耗费人工，适用于人力成本不高的商业模式。液体培养主要是应用发酵罐系统进行，可大批量获得昆虫病原线虫；这一培养系统设备、培养基成本和自动化程度高，适用于人力成本较高的商业模式。不论是使用固体还是液体培养方法，昆虫病原线虫商业化培养的技术关键是如何获得高产量的线虫和降低线虫成本。
4.线形动物普遍存在的蛔甙类ascarosides信息物质在调节线虫的聚集、趋避、交配、多尔态(dauer)形成及扩散传播等行为中发挥了重要作用。本发明发现，蛔甙可提高s.carpocapsae all线虫的产量。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是提供蛔甙在提高s.carpocapsae all线虫产量中的应用。
6.本发明通过实验发现，蛔甙能提高昆虫病原s.carpocapsae all线虫的产量。
7.因此，本发明提供蛔甙在制备提高昆虫病原s.carpocapsae all线虫产量制剂中的应用(即蛔甙在提高s.carpocapsae all线虫产量中的应用)，所述的蛔甙，其结构式如式1任一所示：
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本发明的第二个目的是提供一种提高s.carpocapsae all线虫产量的方法，是将
蛔甙添加到加入相应共生细菌的s.carpocapsae all线虫培养基中，促进线虫繁殖从而获得更高的线虫产量；
[0011]
所述的蛔甙，其结构式如式1中任一所示。
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优选，所述的蛔甙为ascr#1、ascr#2、ascr#3、ascr#5、ascr#6、ascr#8、ascr#9、ascr#10、ascr#11、ascr#12，其在培养基中的浓度是0.02nm
‑
0.02μm。
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进一步优选，所述的蛔甙为ascr#3、ascr#5、ascr#7、ascr#10或ascr#11时，其在培养基中的浓度是0.02nm。
[0014]
本发明发现，相比于无菌pbs对照组，蛔甙能够显著地提高s.carpocapsae all感染期线虫产量。因此，可以将蛔甙用于培养系统中提高s.carpocapsae all感染期线虫产量，为商品化生产具有成本优势的s.carpocapsae all线虫提供核心技术。
具体实施方式：
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以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
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实施例1：
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一、实验材料
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1、蛔甙：包括11种人工合成蛔甙，代号分别为ascr#1、ascr#2、ascr#3、ascr#5、ascr#6、ascr#7、ascr#8、ascr#9、ascr#10、ascr#11、ascr#12，其结构式分列如下：
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分别将11种蛔甙以无菌pbs溶解至0.5μm、0.5nm、0.5pm，然后再稀释至一定的浓度，以一定的量加入线虫培养基中，使培养基中的浓度分别为0.02μm、0.02nm、0.02pm。
[0022]
二、实验方法：
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1、共生菌单菌培养的s.carpocapsae all：将常规固体培养基培养的s.carpocapsae all线虫经清洗后，用无菌pbs缓冲液清洗三次后，以无菌pbs配制成10μl含50感染期线虫的浓度(5000ijs/ml)，装入250ml三角瓶中(装50ml线虫悬液)，置于9
‑
13℃备用。
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2、xenorhabdus nematophila all共生菌液的培养：以lb培养基(121℃灭菌30min)于25℃，120rpm摇床中培养s.carpocapsae all线虫的共生细菌(x.nematophila all)至菌液浓度od
600
值为0.2。以3％的过氧化氢测定共生细菌培养液是否被污染(在超净工作台下，取1ml培养液加入到无菌培养皿中，于培养皿中滴加0.2ml 3％的过氧化氢，约3min后，培养液如果未出现气泡，则表示培养液未发现明显污染；同时划lb平板鉴定培养基是否出现杂菌污染)。
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3、线虫培养基制备：于无菌48孔板中，每个孔中加入0.3ml高压灭菌的强化营养肉汤培养基(la：1.6％营养肉汤，1％玉米油和1.2％琼脂，其余为纯净水)，冷却后使用。
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4、共生细菌接种：于加入la培养基的培养板中每孔加入20μl已培养好且无污染的共生菌溶液，于28℃条件下培养3天。
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5、感染期线虫接种和蛔甙加入：于la培养基且添加共生菌的情况下，以10μl的量加入约50条感染期线虫到孔中。再分别加入10μl不同浓度的蛔甙(均匀喷洒在整个孔中)，使培养基中的浓度分别为0.02μm、0.02nm、0.02pm。以加入等体积无菌pbs为对照。每个处理设置4个孔的重复。
[0028]
6、线虫产量计数：将平板以封口膜封口后，放置25℃下黑暗培养。15d后，于平板中分批加入5ml无菌pbs，清洗其中的线虫到新的无菌平板中(直径＝9cm)，转移到15ml的离心
管中进行定容和取样，混匀后取样计数感染期线虫数量和其它龄期线虫(如母虫、非感染期线虫)数量。
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结果如表1所示：
[0030]
表1：蛔甙对s.carpocapsae all感染期线虫产量(条数/孔)的影响(15天)
[0031][0032][0033]
注：表中数据经过方差分析(turkey)后可知：0.02μm:f＝75.837,df＝11,24,p＝0.000；0.02nm:f＝70.153,df＝11,24,p＝0.000；0.02pm:f＝102.683,df＝11,24,p＝0.000。表中大写字母表示同一处理下不同浓度之间的显著性差异；小写字母表示同一浓度下不同处理之间的显著性差异。
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从表1可以看出，与无菌pbs对照组相比，11种蛔甙都显著提升了s.carpocapsae all线虫的产量。线虫产量因不同的蛔甙以及不同的浓度而异，例如最高产量是浓度为0.02nm的ascr#5、ascr#7和ascr#11获得。