一种荧光硅量子点的表面功能化方法及其产品和应用与流程

1.本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种荧光硅量子点的表面功能化方法及其产品和应用。


背景技术：

2.半导体量子点是指导电性能介于金属与绝缘体之间的一类固体纳米材料，由于表面效应、量子尺寸效应、量子隧道效应和量子限域效应的影响，其性能不同于一般的半导体材料，在光、电、热、磁等方面均表现出特殊的性质，拥有广阔的发展前景。半导体量子点可分为三大类：
ⅲ‑ⅴ
族量子点(inas、gasb、gan)、
ⅱ‑ⅵ
族量子点(cdte、znse、cdte)和ⅳ族量子点(si、ge)。其中，硅是一种间接带隙半导体，传统的硅纳米材料发光很弱，但是，当其尺寸不断减小时，量子尺寸效应使其荧光强度增强。而且，相比于传统的
ⅲ‑ⅴ
族量子点和
ⅱ‑ⅵ
族量子点，硅量子点毒害小，对环境友好，地壳内储量丰富，光稳定性强，并且已经开发出简单高效的合成方法，使得其在光电子学，太阳能转换等领域有着广泛的应用。特别重要的是，由于硅量子点优秀的生物相容性，使其在生物成像领域有着广泛的应用。
3.在生物成像领域中，传统用于生物成像的是一些小分子荧光染料，比较常见的为fitc、syto、pi、溴化乙锭等传统染料和荧光蛋白，但此类荧光物质一般光漂白效应较强，荧光性质不稳定，价格昂贵，且具有潜在的毒性，合成步骤复杂等缺点。而硅量子点(siqds)光稳定性强，抗光漂白能力强，且具有良好的生物相容性，使其在生物成像领域越来越受欢迎。将具有靶向识别能力的分子，或具有治疗功能的化合物或基团连接在siqds的表面，可实现特殊的生物医学功能，进而扩展siqds的在生物成像中的应用。
4.传统上，siqds的表面功能化需依赖特殊的化学基团进行复杂的活化反应，导致其很难在生物医学成像方面成为普适性的纳米平台。因此，迫切需要开发一种简单的，通用的功能化方法来对硅量子点表面进行修饰以满足荧光硅量子点在生物成像方面的应用。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种荧光硅量子点的表面功能化方法，将仿贻贝聚多巴胺材料涂敷在siqds表面，进而使siqds可适用于各种功能分子连接，从而简易高效的实现siqds表面的功能化，表面功能化后的荧光硅量子点可作为纳米探针应用于生物成像中。
6.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
7.本发明提供了一种荧光硅量子点的表面功能化方法，该方法包括以下步骤：
8.s1、将还原剂溶解于水中，加入硅烷偶联剂，搅拌混匀后进行水热反应，最后经透析、干燥获得荧光硅量子点；
9.s2、将步骤s1的荧光硅量子点分散于tris缓冲液中，然后加入盐酸多巴胺搅拌反应一段时间，获得聚多巴胺包裹的荧光硅量子点溶液；
10.s3、在步骤s2的聚多巴胺包裹的荧光硅量子点溶液中加入功能化分子，搅拌反应
一定时间后经透析、干燥即可实现荧光硅量子点的表面功能化。
11.本发明通过溶液还原法，使用还原剂还原硅烷偶联剂，并在水热条件下制备了荧光硅量子点；在tris缓冲液的存在下，通过多巴胺的聚合作用和聚多巴胺的黏附机理，将多巴胺和硅量子点通过简单的混合，获得了表面聚多巴胺改性的荧光硅量子点；通过聚多巴胺表面上具有化学活性的邻苯二酚和醌基，可将具有硫醇或胺等亲和官能团的分子通过席夫碱反应或迈克尔加成反应负载在荧光硅量子点表面。通过聚多巴胺表面上大量的芳环，可将一些具有共轭结构的分子通过物理相互作用(如π
‑
π堆积、氢键)负载在其表面。整个过程无需温度和压力的特殊控制，无需在活化剂的作用下进行复杂的活化反应，只需要简单的搅拌，即可在荧光硅量子点表面接枝小分子化合物、聚合物、氨基酸、dna等功能化分子。由此获得一种荧光硅量子点表面功能化的通用化方法。
12.优选地，步骤s1中，所述还原剂选自柠檬酸三钠、抗坏血酸钠、玫瑰红、硼氢化钠、草酸钠、亚硫酸钠、和邻苯二酚中的一种或多种。具体地，所述还原剂选自玫瑰红。
13.优选地，步骤s1中，所述还原剂的浓度为(3
‑
20)mg/ml。具体地，所述还原剂的浓度为5mg/ml。
14.优选地，步骤s1中，所述硅烷偶联剂选自3
‑
氨基丙基三甲氧基硅烷、n
‑
甲基
‑3‑
氨丙基三甲氧基硅烷、(n,n
‑
二甲氨基丙基)三甲氧基硅烷、γ
‑
(乙二胺基)丙基三甲氧基硅烷、3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷中的一种或多种。具体地，所述硅烷偶联剂选自3
‑
氨基丙基三甲氧基硅烷(aptms)。
15.优选地，步骤s1中，所述还原剂与硅烷偶联剂的质量体积比为10
‑
50mg:0.5
‑
10ml。具体地，所述还原剂与硅烷偶联剂的质量体积比为20mg:1ml。
16.优选地，步骤s1中，所述水热反应为120
‑
180℃水热反应1
‑
6h。具体地，所述水热反应为160℃水热反应4h。
17.优选地，步骤s2中，所述tris缓冲液的浓度为5
‑
20mm/ml。具体地，所述tris缓冲液的浓度为10mm/ml。
18.优选地，步骤s2中，所述荧光硅量子点与tris缓冲液的料液比为2mg:5
‑
50ml。具体地，所述荧光硅量子点与tris缓冲液的料液比为2mg:10ml。
19.优选地，步骤s2中，所述tris缓冲液的ph值为8
‑
9。具体地，所述tris缓冲液的ph值为8.5。
20.优选地，步骤s2中，所述荧光硅量子点与盐酸多巴胺的质量比为(0.5
‑
5):1。具体地，所述荧光硅量子点与盐酸多巴胺的质量比为2:1。
21.优选地，步骤s2中，所述搅拌反应为100
‑
200rpm搅拌反应0.5
‑
3h。具体地，所述搅拌反应为150rpm搅拌1h。
22.优选地，步骤s3中，所述功能化分子包括具有氨基或巯基或共轭结构的小分子化合物、聚合物、氨基酸、dna。进一步地，所述功能化分子包括sh
‑
peg(巯基
‑
聚乙二醇)、mpa(3
‑
巯基丙酸)、chc(2
‑
巯基乙胺盐酸盐)、tet(四环素)、d
‑
丙氨酸、sh
‑
dna【3'巯基修饰的dna(5
’‑
tccatgacgttcctgacgtt
‑3’
，sh
‑
dna)】。
23.优选地，所述功能化分子与盐酸多巴胺的质量比为1
‑
6:1。具体地，所述功能化分子与盐酸多巴胺的质量比为2:1。
24.本发明还提供了采用上述的表面功能化方法制备得到的荧光硅量子点。
25.本发明通过在聚多巴胺包裹的荧光硅量子点表面分别接枝细菌代谢活性分子d
‑
丙氨酸(d
‑
ala)、四环素(tet)、2
‑
巯基乙胺盐酸盐(chc)，sh
‑
peg、3
‑
巯基丙酸(mpa)和sh
‑
dna，分别制备得到表面功能化后的荧光硅量子点siqds@pda/d
‑
ala、siqds@pda/tet、siqds@pda/chc、siqds@pda/peg、siqds@pda/mpa、siqds@pda/dna。
26.本发明还提供了上述的荧光硅量子点作为纳米探针在生物成像方面的应用。
27.本发明的荧光硅量子点表面功能化方法是一种基于荧光硅量子点表面功能化的通用化方法，仅需要通过简单的搅拌而无需复杂的活化反应即可实现荧光硅量子点的表面功能化。本发明获得的荧光硅量子点siqds的最佳激发波长510nm，发射波长530nm，荧光量子产率44.73％。合成所得的荧光硅量子点尺寸约为4nm。经过聚多巴胺修饰后的siqds@pda，其最大激发波长510nm，发射波长530nm，荧光性质没有明显改变。pda负载后所得的siqds@pda的尺寸约为9nm，而siqds表面的pda膜厚度约为2.5nm。在聚多巴胺表面的邻苯二酚、醌基以及大量的芳环的存在下，具有氨基、巯基或具有共轭结构的功能化分子可负载在siqds@pda表面，从而使表面功能化后的荧光硅量子点可作为纳米探针应用于生物成像中。比如，通过在siqds@pda表面修饰具有细菌代谢活性的d
‑
丙氨酸(d
‑
ala)，可实现对革兰氏阳性菌的选择性标记，获得的siqds@pda/d
‑
ala可标记革兰氏阳性菌的生物膜，且相比于传统荧光染料具有更好的荧光稳定性。
28.优选地，所述应用包括在细菌及生物膜成像。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
30.本发明提供了一种荧光硅量子点的表面功能化方法，首先通过水热法合成了荧光性质良好的荧光硅量子点，再通过多巴胺的自聚合作用和聚多巴胺的黏附特性，制备了表面聚多巴胺负载的硅量子点(siqds@pda)，最后通过接枝各种功能化分子(小分子化合物、聚合物、氨基酸、dna等)实现了荧光硅量子点的表面功能化；同时，各种功能化分子在siqds@pda表面的成功修饰，也验证了siqds@pda具有普适性功能化的特点。在实现功能化的整个过程中，本发明没有使用任何活化剂，从而有效改善了传统功能化方法对昂贵活化剂的依赖。同时，本发明所制备的siqds@pda可以实现各种功能化分子的简便快速接枝，从而实现不同的生物成像需求。比如，通过接枝具有细菌代谢活性的生物分子，实现了针对革兰氏阳性菌的选择性成像，且获得的纳米探针相比于传统荧光染料具有更好的荧光稳定性。
附图说明
31.图1为siqds(a)、聚多巴胺涂覆的siqds(siqds@pda)(b)的荧光光谱图；
32.图2为荧光硅量子点(siqds)(a)和表面聚多巴胺涂覆的荧光硅量子点(siqds@pda)(b)的透射电子显微(tem)形貌图以及通过tem图获得的粒径分布图；
33.图3为siqds和聚多巴胺涂覆的siqds的x射线光电子能谱(xps)图；
34.图4为siqds、siqds@pda/d
‑
ala以及siqds@pda/tet的傅里叶变换红外吸收光谱(ft
‑
ir)图；
35.图5为siqds@pda、siqds@pda/mpa、siqds@pda/chc、siqds@pda/dna、siqds@pda/peg的电位图和荧光发射光谱图；
36.图6为siqds、siqds@pda对金黄色葡萄球菌以及siqds@pda/d
‑
ala对金黄色葡萄球
菌和大肠杆菌的成像效果图；
37.图7为siqds@pda/d
‑
ala和syto9对金黄色葡萄球菌生物膜在白光照射不同时间下的3d荧光图。
具体实施方式
38.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
39.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
40.实施例1 siqds@pda的合成
41.具体合成方法包括以下步骤：
42.(1)合成绿色发光荧光硅量子点(siqds)：
43.将20mg玫瑰红加入4ml水中，搅拌三分钟后，获得浓度为5mg/ml的玫瑰红溶液，再往其中加入1ml硅烷偶联剂3
‑
氨基丙基三甲氧基硅烷(aptms)，搅拌五分钟后，将混合液体转移至10ml聚四氟乙烯内衬的水热反应釜中，置入箱式加热炉中于160℃下水热反应4h；再将反应液转移至500da的透析袋内，纯水透析48小时后收集透析后的液体，冻干三天后获得荧光硅量子点干粉。
44.使用荧光光谱仪对siqds@pda的荧光特性进行了分析(图1)，由荧光图可以看出，荧光硅量子点的最大激发波长为510nm，最大发射波长为530nm(图1a)；当siqds被聚多巴胺包裹后其荧光特性未受到影响(图1b)。同时，通过稳态瞬态荧光光谱仪测得siqds的量子产率为44.73％。
45.(2)合成表面聚多巴胺包裹的荧光硅量子点(siqds@pda)：
46.将2mg步骤(1)中制备得到的荧光硅量子点干粉分散于10ml浓度为10mm的tris缓冲液(ph＝8.5)中，随后加入1mg盐酸多巴胺，150rpm搅拌1h后，将反应液转移至1000da的透析袋内，纯水透析48小时后收集透析后的液体，冻干三天后获得表面聚多巴胺包裹的荧光硅量子点(siqds@pda)。
47.通过透射电子显微镜(tem)对合成的siqds以及siqds@pda进行形貌及尺寸表征(图2)。tem照片显示，相比于siqds，siqds@pda的周围出现一层衬度较小的膜状物质，表明pda在siqds表面的成功涂覆。从tem照片中还可以看出，siqds@pda的分散较为均匀，未观察到明显的团聚现象，表明siqds@pda具有较好的分散稳定性。通过对多张tem照片进行粒径统计分析发现，相比于平均粒径约4nm的siqds，siqds@pda的平均粒径增加到9nm左右，表明siqds表面的pda壳厚度约为2.5nm。
48.通过x射线光电子能谱(xps)对siqds和siqds@pda的表面元素进行表征(图3)。由xps图可以看出，与siqds相比，siqds@pda表面的c元素的含量有了明显的提高，这是因为pda具有大量的苯环结构，c元素含量丰富导致siqds表面被聚多巴胺涂覆后其表面的c元素含量得到显著的提升。
49.实施例2 siqds@pda的应用
50.(1)siqds@pda/d
‑
ala的合成
51.d
‑
丙氨酸(d
‑
ala)是细菌细胞壁肽聚糖的主要成分之一，可以通过细菌代谢作用直接整合在细菌细胞壁表面。其中，革兰氏阳性菌细胞壁表面有厚的肽聚糖层，而革兰氏阴性菌则仅含有一层薄的肽聚糖膜，并且在该膜表面还有一层厚的脂多糖层。因此，d
‑
ala可更好地与革兰氏阳性菌的细胞壁结合。
52.为了证实所制得的siqds@pda可作通用的功能化纳米平台，在其表面接枝了细菌代谢活性分子d
‑
丙氨酸(d
‑
ala)，具体制备方法如下：
53.将实施例1中步骤(1)制得的2mg荧光硅量子点干粉分散于10ml浓度为10mm的tris缓冲液(ph＝8.5)中，随后加入1mg盐酸多巴胺，150rpm搅拌1h后，再加入2mg d
‑
丙氨酸(d
‑
ala)，继续搅拌反应1h，将反应液转移至1000da透析袋内，纯水透析48小时后，收集透析后的液体，4℃保存。
54.通过红外光谱对siqds@pda/d
‑
ala进行表征(图4)。可以看出，1459cm
‑1处的峰来自于d
‑
ala中饱和c
‑
h键的弯曲振动，1410cm
‑1处的峰来自于d
‑
ala表面羧基中o
‑
h键的振动，1205cm
‑1处的峰则来自于羧基中c
‑
o键的振动，证明了d
‑
ala的成功涂覆。
55.(2)siqds@pda/tet的合成
56.制备方法同siqds@pda/d
‑
ala的合成，不同之处在于将2mg的d
‑
ala换成2mg的四环素(tet)。
57.通过红外光谱对siqds@pda/tet进行表征(图4)。可以看出，1648cm
‑1处有着一个较强的峰，该峰来自于tet酰胺结构中c＝o键的伸缩振动，1480cm
‑1处的吸收峰则来自于tet中饱和c
‑
h键的弯曲振动峰，证明了tet的成功涂覆。
58.(3)siqds@pda表面的普适性功能化
59.本实施例的制备方法同siqds@pda/tet的合成，不同之处在于将2mg的四环素分别换成6mg的2
‑
巯基乙胺盐酸盐(chc)，6mg的巯基
‑
聚乙二醇(sh
‑
peg)、6mg的3
‑
巯基丙酸(mpa)和5μl的3'巯基修饰的dna(5
’‑
tccatgacgttcctgacgtt
‑3’
，sh
‑
dna)。并且将搅拌时间增加至两小时，siqds@pda/peg使用3500da透析袋除杂，siqds@pda/dna使用10000da透析袋除杂。
60.通过表面电位分析法研究pda介导的siqds表面功能化，并通过荧光发射光谱来表征功能化后的荧光性质变化(图5)。可以看出，pda修饰的siqds表面电荷为
‑
16.6
±
1.2mv，负电荷的产生归因于pda表面酚羟基的存在。但由于mpa表面具有羧基，当接枝在纳米颗粒上时，可以在颗粒表面引入更多的负电荷，使得siqds@pda/mpa的表面负电荷进一步增加为
‑
19.9
±
0.28mv。chc分子含有质子化的氨基，当其作为功能分子接枝在纳米颗粒上时，会在纳米颗粒表面引入正电荷。因此，siqds@pda/chc的表面电荷为6.58
±
1.32mv，表明chc的成功接枝。peg是一种电中性的水溶性聚合物，其在纳米颗粒表面的修饰能中和纳米例子本身的电荷性质。因此，siqds@pda/peg的表面电荷为
‑
0.61
±
0.7mv，证明了peg的成功接枝。dna是带有强负电荷的核酸分子，其在纳米颗粒表面的修饰能大大提高纳米粒的负电荷性质。因此，siqds@pda/dna表面电荷为
‑
27.9
±
0.6mv，证明了dna的成功修饰。此外，荧光光谱表明这五种功能分子的修饰并没有改变siqds荧光发射峰的位置(5b)。
61.实施例3 siqds@pda/d
‑
ala的细菌成像测试
62.1、成像测试：
63.(1)取500μl过夜培养【采用无菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tsb)培养】的金黄色
葡萄球菌(1
×
108cfu/ml，s.aureus)或大肠杆菌(1
×
108cfu/ml，e.coli)悬浮液，置于高压蒸汽灭菌后的1.5ml离心管内，然后分别与700μl浓度为70μg/ml的siqds、siqds@pda、siqds@pda/d
‑
ala共培养三小时；
64.(2)清洗载玻片和盖玻片：首先将盖玻片和载玻片放入250ml的烧杯中，加入约200ml的超纯水超声清洗10min后，倒掉超纯水；再加入200ml无水乙醇继续超声清洗10min，倒掉无水乙醇，再加入200ml超纯水，超声清洗10min后，倒掉超纯水，将盖玻片和载玻片转移至玻璃瓶内备用；
65.(3)对步骤(1)中共培养后的细菌混合液以7000rpm的转速离心5min，吸走上清液，将细菌重新悬浮于100μl无菌磷酸盐缓冲液(pbs)中，吹打均匀后，取50μl滴在清洗后的载玻片上，并使用清洗后的盖玻片盖在菌液上部以起到固定作用。将玻片放在正置荧光显微镜下观察，首先使用明场观察细菌形态，随后使用488nm的暗场激发来观察细菌被荧光标记的情况。
66.2、测试结果：
67.如图6所示，实施例2获得的siqds@pda/d
‑
ala在488nm激发下对金黄色葡萄球菌有明显的成像效果，而对大肠杆菌则无明显成像效果，而siqds与siqds@pda对金黄色葡萄球菌均无明显成像效果。可见，采用本发明方法制备得到的siqds@pda/d
‑
ala实现了针对革兰氏阳性菌的选择性成像。
68.实施例4 siqds@pda/d
‑
ala对生物膜成像及荧光稳定性测试
69.1、成像测试
70.取80μl siqds@pda/d
‑
ala(浓度为70μg/ml)和购自thermofisher scientific的传统荧光染料syto9(3μl稀释于1ml pbs中)分别滴在金黄色葡萄球菌生物膜表面【以海藻酸钠
‑
明胶的混合液(10ml海藻酸钠
‑
明胶的混合液包含500μl浓度为1
×
106cfu/ml的细菌悬浮液，质量分数为2.5％的海藻酸钠，质量分数为8％的明胶，溶剂为水)为材料采用3d生物打印机(生产厂家为envisiontec，germany；型号为envision one cdlm)打印制成】。置于激光共聚焦显微镜下488nm激发观察，并扫描3d成像图谱。将被染色后的生物膜置于白光下照射0、5、20min后，继续扫描3d图像，以对比siqds@pda/d
‑
ala与syto9的光漂白效应。
71.2、测试结果
72.如图7所示，在未经白光照射时，siqds@pda/d
‑
ala和syto9均可以对生物膜染色。当二者暴露于白光中5min时，siqds@pda/d
‑
ala染色的生物膜荧光信号基本没有变化，而syto9的荧光强度开始下降。在曝光20min后，siqds@pda/d
‑
ala组生物膜的荧光强度虽有所降低，但仍有大量荧光信号被检测到，而syto9组生物膜的荧光强度则有很大程度的减弱。上述结果表明，相比于传统的syto9染料，基于siqds的荧光纳米探针具有良好的抗光漂白效果，适合于长时间动态荧光观察与成像。值得一提的是，传统syto9染料疏水性较强，使用时往往要借助于有机溶剂dmso进行溶解，这也限制了syto9染料在体内的实时荧光跟踪，而本发明的siqds材料则不存在这一缺陷。
73.以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。