一种噬菌体组合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种噬菌体及其应用。


背景技术：

2.鸡输卵管炎的常见病因是由于生物性的致病菌感染引起，大肠杆菌和沙门氏菌是最常见的病原。常见从输卵管中流出一种白色脓样的炎性渗出物，肛门下面的羽毛常被炎性物污染。输卵管发炎时，会导致蛋壳变薄，且沙壳蛋、畸形蛋、破壳蛋比例升高，蛋卖相变差。输卵管炎影响蛋品质下降，严重的可发生炎症扩散和全身感染，引起鸡死亡，造成重大的经济损失。
3.在我国为保证食品安全以及避免鸡蛋中药物残留，产蛋鸡群禁止使用抗生素，目前常用中药等进行调理预防输卵管炎。但是中药存在一些治疗时间长，效果不理想，用药成本高等缺点。目前还没有安全有效的药剂对鸡输卵管炎进行防治。
4.因此，现有技术有待进一步改进。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供了可用于治疗细菌性鸡输卵管炎的两株烈性噬菌体pd07、pyc04及以这两种噬菌体为主要成分的噬菌体组合物，能全面、快速、无残留的杀灭导致鸡输卵管炎的致病菌大肠杆菌与沙门氏菌，提高蛋鸡产蛋率、提高蛋品质、增强蛋鸡的体质和抗病力。
6.本发明的技术方案如下：
7.本发明提供一种用于防治鸡输卵管炎的大肠杆菌噬菌体pd07，保藏号为cgmcc no18865，于2019年11月4日被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。所述噬菌体pd07对鸡源大肠杆菌具有较宽的裂解效果，可用于制备防治鸡输卵管炎的杀菌剂或环境消毒剂。
8.本发明在电子显微镜下观察了噬菌体pd07的形态，其具有呈多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部长径约86.67nm，横径约106.67nm，尾部约120nm，属肌尾噬菌体(图1)。
9.本发明还提供另一种用于防治鸡输卵管炎的沙门氏菌噬菌体pyc04，保藏号为cgmcc no18867，于2019年11月4日被保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。所述噬菌体pyc04对鸡源沙门氏菌具有较宽的裂解效果，可用于制备防治鸡输卵管炎的杀菌剂或环境消毒剂。
10.在电子显微镜下观察了噬菌体pyc04的形态，其呈多面体的头部的横径约60nm，长径约66.67nm，尾长约133.33nm，属长尾噬菌体(图2)。
11.经噬菌体全基因组分析，得到：噬菌体pd07和pyc04的全基因组大小分别为78626bp和41843bp，其中噬菌体pd07基因组g c含量为49.89％，含有271个开放阅读框(orfs)，噬菌体pyc04基因组g c含量为49.50％，含有62个开放阅读框(orfs)。噬菌体pd07
和pyc04不含耐药基因及毒力基因，不含溶原性相关基因。
12.本发明还提供一种用于防治鸡输卵管炎的噬菌体组合物，其包括如上所述的大肠杆菌噬菌体pd07和沙门氏菌噬菌体pyc04。
13.可选地，大肠杆菌噬菌体与沙门氏菌噬菌体的活体数量之比为1:1；每种噬菌体的的含量不低于1
×
108pfu/ml。
14.所述噬菌体组合物中pd07在40～60℃中放置60min，活性稳定，在ph为5
‑
9时，活性稳定；pyc04在40～60℃中放置60min，活性稳定，在ph为5
‑
11时，活性稳定。
15.进一步地，所述噬菌体组合物还包括大肠杆菌噬菌体pd07和沙门氏菌噬菌体pyc04的突变体中的一种或多种。由于噬菌体在复制过程中非常容易发生突变，因而优选的，上述噬菌体的突变体也在本技术请求保护的范围内。通过现有技术中公知的计算机程序可以适当地测定同源性，pd07和pyc04的突变体至少90％与所述噬菌体的天然序列相同；且所述突变体具有与最初的噬菌体大致相同的灭杀病原菌的功能。更优选的，突变体有92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与各自对应的噬菌体的天然序列相同。其中，pd07和pyc04的序列可根据本发明保藏的生物材料通过公知的方法测序得到。噬菌体pd07和pyc04的突变体可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的噬菌体序列，有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多碱基可发生变化。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。
16.进一步地，所述杀菌组合物还包括辅料；所述辅料为sm缓冲液、海藻酸钠、蔗糖、麦芽糖糊精、葡萄糖中的一种或多种。优选的，所述杀菌组合物还包括不同种类细菌的特定病原菌的噬菌体。
17.具体地，所述噬菌体组合物的剂型为粉剂、水剂、冻干剂、凝胶剂、霜剂、膏剂。
18.本发明还提供所述噬菌体组合物在预防或治疗鸡输卵管炎的药物中的应用。应用方法为：将噬菌体组合物作为治疗药物添加到患有鸡输卵管炎的畜禽饲料中，或对畜禽体表喷雾，或给畜禽灌服，或给畜禽肌肉注射，或通过饮水的方式，其中优选的使用饮水方式防治，预防及治疗鸡输卵管炎，提高蛋鸡产蛋率以及产蛋质量。
19.本发明还提供一种用于防治鸡输卵管炎的杀菌剂，其包括上述的噬菌体组合物。
20.在所述的噬菌体组合物在防控鸡大肠杆菌病和沙门氏菌病的应用中，其特征在于，降低鸡群的因大肠杆菌和沙门氏菌引起的输卵管炎发病率和死亡率，降低鸡群大肠杆菌和沙门氏菌引起的腹泻，提高产蛋率和鸡蛋品质。
21.本发明还提供一种环境消毒剂，其有效成分为上述的噬菌体pd07、pyc04或这两种噬菌体组成的的噬菌体组合物；优选地，每种噬菌体的浓度为5
×
108pfu/ml以上。应用方法为：将噬菌体组合物作为环境消毒剂，在屠宰场、畜禽产品加工车间及器具、养殖环境中使用，防止环境中大肠杆菌与沙门氏菌的污染。例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、医疗设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等。
22.优选地，所述环境消毒剂还包含其他用于环境中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分。
23.本发明还提供一种饲料添加剂，其包括上述的噬菌体pd07、pyc04或这两种噬菌体
组成的的噬菌体组合物；优选地，饲料中每种噬菌体的浓度至少为1
×
108pfu/g。
24.此外，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括如上所述的噬菌体组合物。本领域技术人员可根据本发明公开内容和本领域常识利用上述噬菌体组合物制备检测试剂盒，用于检测其特异侵染的宿主病原菌、或用于防控由其宿主病原菌侵染导致的疾病。
25.本发明具有以下有益效果：
26.1、本发明筛选到两株噬菌体，分别为大肠杆菌噬菌体pd07，沙门氏菌噬菌体pyc04，可用于防治由大肠杆菌或沙门氏菌感染导致的疾病，如鸡输卵管炎。
27.2、本发明还提供一种可用于治疗细菌性鸡输卵管炎的噬菌体组合物，噬菌体组合物是通过大肠杆菌噬菌体pd07与沙门氏菌噬菌体pyc04的复配作为有效预防及治疗鸡输卵管炎的成分，与单一裂解性大肠杆菌噬菌体相比，大大拓宽了其杀菌范围，增加其杀菌活性，可提高蛋鸡产蛋率、增强蛋鸡的体质和抗病力。
28.3、本发明涉及的噬菌体从自然界中获得，数量庞大，来源广，容易分离获得，属于天然生物。因此，以裂解性大肠杆菌噬菌体与沙门氏菌噬菌体为主要成分治疗鸡输卵管炎以及作为治疗及预防生物制剂可降低成本低、提供绿色新型生物制剂、无刺激性气味、无环境污染问题。
29.4、本发明设计的噬菌体组合物应用广泛，其不仅可用于环境消毒剂使用，还可为水溶液或冻干制剂药剂，与饲料混合及随水饮用，用于防治由大肠杆菌和沙门氏菌感染导致的疾病，可快速、彻底、安全、无残留的杀灭病鸡体内的大肠杆菌与沙门氏菌，乃至耐药性的大肠杆菌与沙门氏菌。
附图说明
30.图1为大肠杆菌噬菌体pd07的电镜图片；
31.图2为沙门氏菌噬菌体pyc04的电镜图片；
32.图3为大肠杆菌噬菌体pd07的噬菌斑图片；
33.图4为沙门氏菌噬菌体pyc04的噬菌斑图片；
34.图5为大肠杆菌噬菌体pd07的ph稳定性图片；
35.图6为沙门氏菌噬菌体pyc04的ph稳定性图片；
36.图7为大肠杆菌噬菌体pd07的温度稳定性图片；
37.图8为沙门氏菌噬菌体pyc04的温度稳定性图片；
38.图9为大肠杆菌噬菌体pd07的一步生长曲线图片；
39.图10为沙门氏菌噬菌体pyc04的一步生长曲线图片。
具体实施方式
40.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.实施例1噬菌体的分离和制备
42.本发明中的粪液污水、鸡肠道及肝脏等样品采自山东省多个养鸡场。
43.1、致病菌的分离与鉴定
44.从山东某蛋鸡场，收集患有输卵管炎的病鸡进行解剖，从输卵管内分离致病菌。分别在ss培养基培养，对得到的致病菌进行镜检形态鉴定，并通过相应的pcr进行鉴定。
45.结果：在ss培养基上分离到灰白色黑心的小菌落，菌落边缘光滑、凸起，经沙门氏菌特异性引物pcr鉴定为沙门氏菌；ss培养基上还分得红色、周围颜色稍淡的菌落，经大肠杆菌特异性引物pcr鉴定为大肠杆菌。
46.2、大肠杆菌噬菌体与沙门氏菌噬菌体的分离
47.取50ml鸡场的粪液污水或5g鸡肠道及肝脏，加入500μl致病菌，再加入nb培养基至200ml，37℃浸泡孵育过夜。次日，取出5
‑
8ml的液体，11000rpm离心10min，上清液经0.22μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体原液。利用双层平板法分离噬菌体，将噬菌体原液通过倍比稀释，取稀释液各取120μl与120μl致病菌增殖液混合均匀，37℃孵育5min后，置于约60℃保温的上层琼脂(琼脂浓度为0.7％)，混匀后迅速倾倒下层琼脂(琼脂浓度为1.5％)平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃倒置培养3～6h后，获得形成噬菌斑的双层平板。采用不同的致病菌(沙门氏菌或大肠杆菌)，按照上述方法分别分离得到两种噬菌体，将获得的大肠杆菌噬菌体命名为pd07，获得的沙门氏菌噬菌体命名为pyc04。
48.3、大肠杆菌噬菌体pd07与沙门氏菌噬菌体pyc04的纯化和增殖
49.在形成噬菌斑的双层培养基挑取单个噬菌斑，并置于1ml的nb肉汤中37℃，170rpm震荡30min得到噬菌体浸出液。取噬菌体浸出液120μl与120μl相应的致病菌增殖液混合均匀(37℃孵育5min)，置于约60℃保温的上层琼脂(琼脂浓度为0.7％)，混匀后迅速倾倒下层琼脂(琼脂浓度为1.5％)平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃倒置培养3～6h后，再次获得形成噬菌斑的双层平板。在形成噬菌斑的双层培养基上用灭菌镊子挑取单个噬菌斑置于1ml的lb肉汤中，170rpm震荡30min得到噬菌体浸出液。重复以上步骤3次，得到纯化后的噬菌体浸出液，取100μl纯化后的噬菌体与100μl致病菌增殖液于5ml液体nb培养基中，37℃，170rpm振荡培养，直至液体变清亮，将清亮液体11000rpm离心10min，取上清，使用0.22μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体增殖液。
50.大肠杆菌噬菌体pd07在双层琼脂培养基平板上可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径约1mm(见图3)。
51.沙门氏菌噬菌体pyc04在双层琼脂培养基平板上可以形成中等且透亮空斑，周围有晕环，边缘规则，直径约2mm(见图4)。
52.实施例2大肠杆菌噬菌体pd07和沙门氏菌噬菌体pyc04的形态学特性
53.将噬菌体pd07置于透射电镜下进行观察(见图1)。该噬菌体头部呈多面体结构，有细长的尾部，噬菌体头部长径约86.67nm，横径约106.67nm，尾部约120nm。根据病毒分类国际委员会(ictv)的定义，噬菌体pd07的形态符合肌尾噬菌体科的特征，属于肌尾噬菌体科。
54.将噬菌体pyc04置于透射电镜下进行观察(见图2)。该噬菌体头部呈多面体结构，有细长的尾部，噬菌体头部长径约66.67nm，横径约60nm，尾部约133.33nm。根据病毒分类国际委员会(ictv)定义，噬菌体pyc04的形态符合长尾噬菌体科的特征，属于长尾噬菌体科。
55.实施例3噬菌体pd07和pyc04的全基因组分析
56.分别提取大肠杆菌噬菌体pd07和沙门氏菌噬菌体pyc04的基因组，并进行全基因组测序，得到：
57.噬菌体pd07的基因组大小为40629bp，噬菌体pd07为双链dna病毒，全基因组序列a、g、c、t 4种碱基所占的比例分别为23.81％、23.38％、26.51％、26.38％，g c％含量为49.89％。噬菌体pyc04的基因组大小为41843bp，为环形双链dna，基因组序列a、g、c、t 4种碱基所占的比例分别为25.03％、24.94％、24.56％、25.47％，g c％含量为49.50％。
58.经rast预测分析，噬菌体pd07基因组含有271个开放阅读框(orfs)，噬菌体pyc04基因组含有62个开放阅读框(orfs)；使用在线工具blastp和保守域数据库(cdd)分别对噬菌体pd07的271个orfs和噬菌体pyc04的62个orfs蛋白序列进行比对，其中，噬菌体pd07含已知编码功能蛋白24个，其余orfs为假想蛋白；噬菌体pyc04含已知编码功能蛋白17个，其余orfs为假想蛋白。
59.噬菌体pd07的基因组中：
①
与噬菌体宿主识别相关的两个尾部纤维(tail fibers protein)蛋白基因序列(见序列表序列1和序列3)的位置为第35790～第38147、第38384～第38950；其表达的蛋白质序列分别见序列2和序列4；
②
高度保守的末端酶大亚基(terminase large subunit)蛋白基因(见序列表序列5)的位置为第23199～第24962、；其表达的蛋白质序列见序列6；
③
dna聚合酶(dna polymerase)基因的序列见序列表中序列7，其位置为第6872～第9043，其表达的蛋白质序列见序列8；
④
与裂解能力相关的裂解酶(lysozyme)基因序列见序列表中序列9，其位置为第24959～25408，其表达的蛋白质序列见序列10。
60.噬菌体pyc04的基因组中：
①
与噬菌体宿主识别相关的三个尾部纤维(tail fibers protein)蛋白基因序列(见序列表序列11、序列13和序列15)的位置为第2487～4517、第4530～7088、第14375～15544；其表达的蛋白质序列分别见序列12、序列14和序列16；
②
高度保守的末端酶大亚基(terminase large subunit)蛋白基因(见序列表序列17)的位置为第25256～26527；其表达的蛋白质序列见序列18；
③
dna聚合酶(dna polymerase)基因的序列(见序列表序列19)的位置为第38144～40414；其表达的蛋白质序列见序列20；
④
与裂解能力相关的裂解酶(lysozyme)基因序列(见序列表序列21)的位置为第28792～29280；其表达的蛋白质序列见序列22。
61.上述基因的具体信息见下表1。
62.表1基因序列信息表
[0063][0064]
经软件trnascan
‑
se分析两株噬菌体的基因组不含trna基因。经phaster分析二者基因组不含溶原性相关基因。选取源自病原细菌体内溶原性噬菌体的毒力基因和常规耐药基因，将两种噬菌体的基因组通过在线工具cge server进行序列分析，得到：上述两种噬菌体的基因组不含耐药基因及毒力基因(即大肠杆菌耐药基因tem、shv、oxa、teta、aac(3)
‑ⅱ
、aph(3
′
)
‑ⅱ
等和毒力基因irp1、irp2、fyua等；沙门氏菌耐药基因blatem、blapse、aada1、aada2、tetb、sul1、qnrb等和毒力基因spva、spvb、spvc、spvd等)，说明这两种噬菌体其无不良基因，从而保证了两种噬菌体使用的安全性和有效性。
[0065]
实施例4大肠杆菌噬菌体pd07和沙门氏菌噬菌体pyc04的效价测定
[0066]
将增殖好的噬菌体原液做10倍比稀释，取10
‑6、10
‑7、10
‑8，3个稀释度。分别取上述3个稀释度噬菌体120μl和宿主菌悬液120μl混合加入到无菌ep管中，充分混匀。37℃孵育5min后，加入预热融化的0.7％上层琼脂中，混匀，迅速倒入1.5％下层琼脂平板上，倾斜旋转使分布均匀，带琼脂凝固后，倒置37℃恒温箱培养3～6h，观察结果。每个稀释梯度做2个平行，计数时以噬菌斑为30～300之间的稀释度为准，取每个稀释度2个平行的平均值，计算噬菌体的效价。
[0067]
噬菌体效价(pfu/ml)＝平均噬菌斑数
×
稀释倍数
×
10。
[0068]
结果显示：pd07的噬菌体效价为4.5
×
10
10
pfu/ml，pyc04的噬菌体效价为2.5
×
10
11
pfu/ml。
[0069]
实施例5大肠杆菌噬菌体pd07和沙门氏菌噬菌体pyc04的ph稳定性
[0070]
取无菌试管中加入不同ph值(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的nb肉汤4.5ml，各三支，然后将试管置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μl的pd07噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后，立即向混合液中加入适量的1mol/l的hcl或者naoh使混合液的ph值约为7，进行10倍比稀释，取合适稀释梯度测定效价，每个ph值试管设定2个重复。以ph值为横坐标，噬菌体效价的对数值为纵坐标绘制pd07噬菌体ph值稳定性曲线。
[0071]
取无菌试管中加入不同ph值(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的nb肉汤4.5ml，各三支，然后将试管置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μl的pyc04噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后，立即向混合液中加入适量的1mol/l的hcl或者naoh使混合液的ph值约为7，进行10倍比稀释，取合适稀释梯度测定效价，每个ph值试管设定2个重复。以ph值为横坐标，噬菌体效价的对数值为纵坐标绘制pyc04噬菌体ph值稳定性曲线。
[0072]
如图5
‑
6的测试结果显示，pd07在ph 5
‑
9比较稳定，在ph 10作用2h效价开始下降，ph 12或ph 13作用1h效价降低7个数量级或失活；pyc04在ph 5
‑
11效价比较稳定，ph 12或ph 13作用1h效价降低6个数量级或失活。
[0073]
实施例6大肠杆菌噬菌体pd07与沙门氏菌噬菌体pyc04的热稳定性
[0074]
取100μl pd07增殖液分装于无菌ep管中，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中作用20min、40min和60min。每一温度设2个重复。待作用结束后取样，并立即将样品置于冰浴中冷却，进行10倍比稀释，取合适稀释梯度测定效价。以温度为横坐标，以噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制pd07噬菌体热稳定性曲线。
[0075]
取100mlpyc04增殖液分装于无菌ep管中，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中作用20min、40min和60min。每一温度设2个重复。待作用结束后取样，并立即将样品置于冰浴中冷却，进行10倍比稀释，取合适稀释梯度测定效价。以温度为横坐标，以噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制pyc04噬菌体热稳定性曲线。
[0076]
如图7
‑
8的测试结果所示：噬菌体pd07在40～60℃的温度范围内的效价较稳定，在70℃作用20min，其效价降低4个数量级；在80℃作用20min，噬菌体被灭活。噬菌体pyc04在40～60℃的温度范围内的效价较稳定，在70℃作用20min，其效价降低3个数量级，80℃作用20min，该噬菌体被灭活。
[0077]
实施例7大肠杆菌噬菌体pd07与沙门氏菌噬菌体pyc04一步生长曲线测定
[0078]
将感染复数为10的pd07增殖液和大肠杆菌新鲜增殖液各1ml，充分混匀(此时开始计时)，37℃孵育5min，12000rpm离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用5ml nb肉汤洗涤1次(12000rpm离心30s)，弃上清。用预热的nb肉汤混悬沉淀(总体积为5ml)并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养，在0时刻和每隔10min取出150μl，10000rpm离心1min，测定效价，做2个平行，结果取平均值，
[0079]
将感染复数为10的pyc04增殖液和沙门氏菌新鲜增殖液各1ml，充分混匀(此时开始计时)，37℃孵育5min，12000rpm离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用5ml nb肉汤洗涤1次(12000rpm离心30s)，弃上清。用预热的nb肉汤混悬沉淀(总体积为5ml)并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养，在0时刻和每隔10min取出150μl，10000rpm离心1min，测定效价，做2个平行，结果取平均值，
[0080]
以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，分别得到pd07和pyc04噬菌体的潜伏期、爆发期和爆发量。
[0081]
爆发量＝稳定期噬菌体浓度/初始菌浓度
[0082]
测试结果：如图9和图10所示，噬菌体pd07和pyc04在感染初期0～40min内，效价基本保持不变，分别为106pfu/ml和107pfu/ml；而在40～50min内，均进入爆发期，噬菌体效价急剧增加，并在60min后达到稳定，均达到109pfu/ml，通过计算可得出噬菌体pd07和pyc04的爆发量分别为90和94。
[0083]
实施例8噬菌体pd07和pyc04的组合物的制备
[0084]
分别取效价为1
×
10
10
pfu/ml的噬菌体pd07和pyc04的原液，将两株噬菌体等体积的均匀混合于溶液中，制成浓度为1
×
109pfu/ml的噬菌体组合物。
[0085]
实施例9噬菌体的裂解率的检测实验
[0086]
选取实验室保存的大肠杆菌15株和沙门氏菌15株，采用双层平板法检测噬菌体pd07和pyc04的裂解谱。这些菌株是2017～2019年内在山东、广西、河南、安徽、江苏等地的鸡场中患有输卵管炎的病鸡的输卵管内分离鉴定出来的致病菌。检测所用宿主菌信息和裂解结果具体见下表2。
[0087]
表2噬菌体裂解结果
[0088]
[0089][0090]
注： ：裂解，噬菌斑透亮；
‑
：未裂解。
[0091]
实验结果显示：针对临床分离的15株大肠杆菌和15沙门氏菌，噬菌体pd07能够裂解10株大肠杆菌，裂解率高达66.67％；噬菌体pyc04能够裂解12株沙门氏菌，裂解率高达80％；而2株噬菌体的鸡尾酒组合对大肠杆菌和沙门氏菌混合感染具有更好的裂解效果，克服了单株噬菌体的裂解谱的局限。
[0092]
实施例9噬菌体的安全性试验
[0093]
将30只蛋鸡分为试验组(15只)和对照组(15只)。试验组每只鸡口服1ml噬菌体组合物，对照组口服等量的无菌生理盐水。饲养14天观察其临床体征，并解剖鸡观察内脏病变。
[0094]
结果显示，在组合物处理14天后，试验组的蛋鸡没有死亡，且并未观察到呼吸道和消化道的损伤，也没有观察到异常活性。解剖试验组鸡内脏无病变。上述结果表明噬菌体组合物安全、无毒副作用。
[0095]
实施例10噬菌体对输卵管炎的治疗作用试验
[0096]
菌液：大肠杆菌和沙门氏菌分离自临床患输卵管炎病鸡输卵管内，分别选取不同地区分离鉴定的的5株致病性大肠杆菌和5株沙门氏菌增殖菌液，取等量各菌液混合均匀。
[0097]
输卵管炎造模方法：选取200日龄蛋鸡45只，平均分成试验组，对照组，空白组3组，每组15只。对实验组和对照组进行输卵管炎造模。
[0098]
用左手的无名指、食指和小指与大拇指分别固定住两条腿，手掌心紧贴蛋鸡的胸骨末端，然后将手直立，鸡泄殖腔朝上，鸡头朝下，右手拇指和4指呈八字形横跨在泄殖腔两侧的柔软部，轻轻向下一按，同时用支撑母鸡胸部的左手向上一推，即可将输卵管口翻出，另一人将造模的菌液注射进输卵管的子宫部即可。待80％鸡出现精神萎靡，输卵管排出白色脓样分泌物，泄殖腔充血肿胀，糊肛等，开始给药治疗。
[0099]
给药：实验组口服噬菌体组合物1ml(效价1
×
108pfu/ml)，连续给药5天，对照组给同等剂量的无菌生理盐水，共观察10天。观察10天内产蛋情况并记录鸡的产蛋量，蛋质量，输卵管内大肠杆菌和沙门氏菌总数。实验结果见下表3。
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表3噬菌体对输卵管炎的治疗试验
[0101][0102][0103]
注：输卵管拭子分菌量：“ ”数量越多，表示分菌较多，较严重；
[0104]
输卵管解剖病变程度：
“‑”
表示输卵管表面光滑、无出血、卵泡正常；“ ”表示输卵管轻微水肿、无坏死或萎缩，优势卵泡明显；“ ”表示输卵管表面粗糙、大量分泌物，卵泡充血变性、输卵管管壁增厚，水肿；“ ”卵泡充血变性、输卵管水肿、卵黄干酪样物质甚至继发腹膜炎，输卵管表面出现坏死区域或萎缩，伴有恶臭味。
[0105]
实验结果说明：与对照组相比，噬菌体治疗组的产蛋率、蛋品合格率明显有所提高，且输卵管内的病菌和病变程度降低。这说明噬菌体组合物对输卵管炎具有较好的效果。
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实施例11噬菌体治疗细菌性输卵管炎鸡群的现场试验
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在山东青岛某鸡场一鸡舍有8000羽300日龄蛋鸡场爆发严重输卵管炎，该鸡舍产蛋率下降，多脏蛋，血蛋，鸡零星死亡，死亡鸡腹部膨大，经实验室检测输卵管内含大量大肠杆菌，少量沙门氏菌。对该鸡舍进行含有1
×
108pfu/ml噬菌体组合物的饮用水饲养。连续饮水治疗7天后，记录该鸡舍的产蛋量、脏蛋、血蛋量等，并随机解剖5只鸡观察输卵管病理变化。
[0108]
结合表4的结果进一步计算可得：使用噬菌体组合物的饮水治疗7天后，该鸡场内破壳蛋降低96％，粪蛋降低92％，沙壳蛋降低89％，血蛋降低93％，以及死淘数降低91％，产蛋率上升11％。随机解剖的鸡输卵管内无积水、充血、水肿等病理变化，输卵管壁表面光滑，无异常分泌物。上述结果说明：使用本发明的噬菌体组合物治疗后明显改善该鸡舍的输卵管炎。
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表4蛋鸡的噬菌体组合物功效试验结果
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本发明的噬菌体组合物对蛋鸡输卵管炎中的致病菌具有高效的特异性杀灭作用，并且具有优异的耐酸性、耐热性，所以此噬菌体组合物对蛋鸡输卵管炎具有治疗和预防作用，提高蛋鸡的产蛋率和产蛋质量。此外，本噬菌体组合物可作为环境消毒剂消除屠宰场、畜禽产品加工车间及器具、养殖环境中的大肠杆菌与沙门氏菌。另外，本发明所用的噬菌体对蛋鸡无毒副作用，所以，本噬菌体安全高效的。
[0113]
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。