新型冠状病毒DNA疫苗的制作方法

新型冠状病毒dna疫苗
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种新型冠状病毒dna疫苗。


背景技术：

2.新型冠状病毒（sars
‑
cov
‑
2）是具有包膜结构的单股正链rna病毒，极易发生突变。目前根据gisaid数据库公布的新冠病毒谱系信息，突变株包括b.1.1.7突变株、b.1.351突变株、p.1突变株、b.1.2突变株、b.1突变株、b.1.525突变株、b.1.617突变株。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒及中东呼吸综合征（mers）和严重急性呼吸综合征（sars）等较严重疾病，新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等，在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡，具有高传染性和高隐蔽性。综上，急需开发出针对突变株有效的疫苗。
3.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的在于提供一种dna分子组合。
5.本发明的第二目的在于提供一种重组载体组合。
6.本发明的第三目的在于提供一种重组细胞组合。
7.本发明的第四目的在于提供上述dna分子组合、重组载体组合和重组细胞组合的应用。
8.本发明的第五目的在于提供一种dna疫苗。
9.本发明的第六目的在于提供dna疫苗的制备方法。
10.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种dna分子组合，包括编码b.1.351突变株s蛋白的seq id no.1、编码p.1突变株s蛋白的seq id no.2、编码b.1.1.7突变株s蛋白的seq id no.3和编码b.1.617.1突变株s蛋白的seq id no.4。
11.需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中，提及的基因或核苷酸序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条，及其可反推成相应的氨基酸序列或蛋白序列。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链，同时也公开了相应的氨基酸序列或蛋白序列。例如，提及seq id no.1，实际包括其互补的核苷酸序列，也包括其对应的翻译后的氨基酸序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然；本技术中的基因序列包括rna形式或dna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
12.一种重组载体组合，所述重组载体组合为将上述的dna分子组合中序列如seq id no.1
‑
4所示的dna分子分别与骨架载体重组得到。
13.进一步地，所述骨架载体为真核表达载体，所述骨架载体优选为pvax1，进一步优
选地，所述重组载体包括pb.1.351、pp.1、pb.1.1.7和pb.1.617.1。
14.一种重组细胞组合，所述重组细胞组合为将上述的重组载体组合分别导入宿主细胞得到。
15.本发明提供的重组载体组合以及重组细胞组合均是与本发明的dna分子组合相关的生物材料，均可作为生物模块直接应用于不同需求和场景的生产中，避免从头生产的繁琐。其中，重组细胞组合的宿主细胞可以为hek293、cho、cos
‑
7、dh5a、top10、bl21、dh10b等感受态细胞。
16.上述dna分子组合、重组载体组合或重组细胞组合在（a）或（b）中的应用：（a）制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的疫苗；（b）制备预防和/或治疗新型冠状病毒引起的相关疾病的药物；新型冠状病毒包括野生株、b.1.1.7突变株、b.1.351突变株、p.1突变株、b.1.2突变株、b.1突变株、b.1.525突变株或b.1.617突变株中的至少一种。
17.一种dna疫苗，含有本发明的dna分子组合或重组载体组合。
18.进一步地，dna疫苗含有重组载体pb.1.351、pp.1、pb.1.1.7和pb.1.617.1。
19.进一步地，dna疫苗具有如下（1）
‑
（3）至少一种功能：（1）调整机体的免疫功能；（2）抗新型冠状病毒感染；（3）防止免疫病理损伤；新型冠状病毒包括野生株、b.1.1.7突变株、b.1.351突变株、p.1突变株、b.1.2突变株、b.1突变株、b.1.525突变株或b.1.617突变株中的至少一种。
20.进一步地，所述dna疫苗还包括佐剂、载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。
21.在优选的实施方式中，所述佐剂包括铝佐剂和/或tlrs 配体和/或金属离子如mn
2
、zn
2
和/或细胞因子和/或趋化因子佐剂等。
22.进一步地，所述dna疫苗还包括至少一种对新型冠状病毒有治疗作用的药物。
23.上述dna疫苗的制备方法简单，将分别含有seq id no.1
‑
4所示的dna分子的重组载体分别导入宿主细胞，培养宿主细胞，提取重组载体，即得到dna疫苗。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的dna分子组合中seq id no.1
‑
4，是发明人分别针对b.1.351突变株s蛋白、p.1突变株s蛋白、b.1.1.7突变株s蛋白和b.1.617.1突变株s蛋白的编码进行优化，包括将野生型基因信号肽替换为高效表达信号肽，得到。该dna分子组合可以分别表达四种新冠突变株的s蛋白，优势在于在真核表达系统中可以高效转录和表达，同时具有良好的免疫原性。
25.以此dna分子组合作为活性功能成分制备的dna疫苗有效激活机体免疫应答，对于体液免疫应答，在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体，并且对野生（sars
‑
cov
‑
2）、b.1.351突变株、p.1突变株、b.1.617.1突变株等病毒有较好的中和活性；对于细胞免疫应答，不仅能够诱导出高水平的抗原特异性ifn
‑
γ反应、抗原特异性 cd4tnfa t细胞亚群和cd8ifnγ t细胞亚群的产生，而且能够诱导高活性的抗原特异性ctl反应。
26.本发明提供的dna分子组合、dna疫苗等均可在机体内激活体液免疫应答产生的抗
体可以预防新型冠状病毒的侵入，以及激活的细胞免疫应答可进一步清除受新型冠状病毒感染的细胞，以及调节由于抗体依赖性增强的潜在副作用引发的不良反应。所以，本发明提供的dna分子组合、重组载体组合、重组细胞组合等均可预防和/或治疗新型冠状病毒（野生型和突变型）感染，也可以预防和/或治疗新型冠状病毒感染的相关疾病，具有良好的广谱性。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1a为实施例2中pwt和pb.1.351抗原蛋白表达检测结果；图1b为实施例2中pwt和pp.1抗原蛋白表达检测结果；图1c为实施例2中pwt和pb.1.1.7抗原蛋白表达检测结果；图1d为实施例2中pwt和pb.1.617.1抗原蛋白表达检测结果；图2为实施例3中pwt和dna疫苗（pb.1.351、pp.1、pb.1.1.7和pb.1.617.1）初次免疫后第14天抗原特异性抗体结果；图3为实施例3中pwt和dna疫苗（pb.1.351、pp.1、pb.1.1.7和pb.1.617.1）加强免疫后第7天抗原特异性抗体结果；图4为实施例3中pwt和dna疫苗（pb.1.351、pp.1、pb.1.1.7和pb.1.617.1）加强免疫后第7天中和抗体结果；图5为实施例3 pwt和dna疫苗（pb.1.351、pp.1、pb.1.1.7和pb.1.617.1）初次免疫后第14天抗原特异性elisopt结果；图6为实施例3 pwt和dna疫苗（pb.1.351、pp.1、pb.1.1.7和pb.1.617.1）加强免疫后第7天抗原特异性elisopt结果；图7为实施例3 pwt和dna疫苗（pb.1.351、pp.1、pb.1.1.7和pb.1.617.1）加强免疫后第7天抗原特异性cd4tnfa t细胞亚群结果；图8为实施例3 pwt和dna疫苗（pb.1.351、pp.1、pb.1.1.7和pb.1.617.1）加强免疫后第7天抗原特异性cd8tfna t细胞亚群结果；图9为实施例3 pwt和dna疫苗（pb.1.351、pp.1、pb.1.1.7和pb.1.617.1）加强免疫后第7天抗原特异性cd8ifnγt细胞亚群结果；图10为实施例3 pwt和dna疫苗（pb.1.351、pp.1、pb.1.1.7和pb.1.617.1）加强免疫后第7天抗原特异性体内ctl结果。
具体实施方式
29.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
30.除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相
同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
31.下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
32.实施例1：dna疫苗的构建过程1.新冠病毒dna疫苗的制备方法1.1.质粒的构建根据b.1.351突变株序列（epi_isl_860630，gisaid），结合经验优化获得seq id no.1所示核苷酸序列，将如seq id no.1 所示核苷酸序列插入pvax1载体的banh i与xho i 位点间，得到新冠病毒变异株质粒（命名为pb.1.351）。
33.根据p.1突变株序列（epi_isl_811149，gisaid），结合经验优化获得seq id no.2所示核苷酸序列，将如seq id no.2 所示核苷酸序列插入pvax1载体的banh i与xho i 位点间，得到新冠病毒变异株质粒（命名为pp.1）。
34.根据b.1.1.7突变株序列（epi_isl_683466，gisaid），结合经验优化获得seq id no.3所示核苷酸序列，将如seq id no.3 所示核苷酸序列插入pvax1载体的banh i与xho i 位点间，得到新冠病毒变异株质粒（命名为pb.1.1.7）。
35.根据b.1.617.1突变株序列（epi_isl_1669767，gisaid），结合经验优化获得seq id no.4所示核苷酸序列，将如seq id no.4 所示核苷酸序列插入pvax1载体的banh i与xho i 位点间，得到新冠病毒变异株质粒（命名为pb.1.617.1）。
36.根据新冠野生型sars
‑
cov
‑
2序列（mn908947.3，ncbi），优化获得seq id no.5所示核苷酸序列，将如seq id no.5所示核苷酸序列插入pvax1载体的banh i与xho i 位点间，得到新冠病毒野生株质粒（命名为pwt）。pwt野生株疫苗是本公司前期针对野生株的产品，目前即将进入iii期临床，具有非常优秀的免疫效果。
37.1.2.质粒的转化从
‑
80 ℃冰箱中取100
ꢀµ
l dh10b感受态细胞悬液，冰上解冻。加入质粒dna溶液（体积不超过10
ꢀµ
l）轻轻摇匀，冰上放置30 min。42℃水浴中热击70秒，迅速置于冰上冷却5 min。向管中加入0.9ml的lb液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振荡培养45min，使细菌恢复正常生长状态。将上述菌液摇匀后取100
µ
l涂布于含适当抗生素的筛选平板上，正面向上放置，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12
‑
16h。挑选形状均匀的单克隆菌体，使用无菌移液器头将克隆扎取后置入5ml 含有50mg/ml卡那霉素的lb选择培养基中37℃过夜培养。
38.1.3.质粒的提取将上述菌液按照1：1000加入到200
‑
400ml 含有卡那霉素（50mg/ml母液，1：1000使用）的lb选择培养基中，37℃ 200rpm培养12
‑
16h。用endofreen plasmid maxi kit（qiagen，德国）进行质粒提取：将上述培养12
‑
16h的菌液8000rpm 4℃离心10min后弃上清收集菌体，加入10ml buffer p1重悬菌液后加入10ml buffer p2轻轻颠倒4
‑
6次混匀，室温孵育5min充分裂解。向混液中加入10ml buffer p3, 轻轻颠倒4
‑
6次混匀终止裂解后，全部转移至qiafilter cartridge中，室温孵育10min，加入栓塞过滤上清。将滤液转移至干净无内毒素50ml离心管中，加入2.5ml buffer er，轻轻颠倒10次混匀后放于冰上孵育30min。取出qiagen
‑
tip 500加入10ml buffer qbt平衡柱子，将上述液体转移至柱子中，利用重力流
进行吸附质粒，用30ml buffer qc洗涤2次，再用15ml buffer qn进行洗脱。每管样品用10.5ml异丙醇沉淀，4℃，4000g离心30min。弃上清，加入70%乙醇洗涤1次，4℃，4000g离心10min。弃上清，晾干沉淀，每样加入500
µ
l无内毒素水进行重悬质粒，得到dna质粒（pb.1.351、pp.1、pb.1.1.7、pb.1.617.1和pwt）。
39.实施例2：新冠病毒dna疫苗哺乳动物细胞抗原蛋白表达鉴定为了验证实施例1构建的质粒是否在哺乳动物细胞内可以有效表达，因此通过提取抗原蛋白，western blot方法进行鉴定。
40.1.蛋白提取将新冠野生株质粒(pwt）、变异株质粒(pb.1.351)、变异株质粒（pp.1）、变异株质粒（pb.1.1.7）、变异株质粒（pb.1.617.1）分别转染到hek293t细胞株中，转染48小时结束后，去除转染后的培养液，用预冷的pbs洗一遍，弃去pbs，加入150
µ
l裂解液（使用前按1：100加入edta及蛋白酶抑制剂）混匀后吹打10次。置于12,000rpm 4度离心5 分钟。吸出上清至1.5ml离心管中，每样取出50
µ
l上清液，加入12.5
µ
l 5
×
蛋白上样缓冲液，置于沸水中煮沸10min后，瞬离备用。
41.2.样品上样及sds
‑
page电泳将煮沸离心后的上清样本每孔加62.5
µ
l 于sds
‑
page胶孔中，接通电源，调至恒压200v，时间设置45min进行电泳。电泳结束后取出sds
‑
page进行转膜制作。取pvdf膜在甲醇中浸泡30s激活，将pvdf膜置于1x转膜平衡液中1min。
42.3.转膜以正极为底面按照：eblot l1转膜垫片、pvdf膜、凝胶、eblot l1转膜垫片顺序依次叠加，每叠加一次用管子排除层间气泡。封闭：将pvdf膜从取出放入盛有1
×ꢀ
tbst 5%脱脂奶粉的玻璃盒中，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将pvdf膜放入1x tbst中清洗3次，每次 10分钟，摇床90rpm摇动。一抗孵育：将pvdf膜放入一抗溶液（s
‑
ecd/rbd monoclonal antibody(1), 1:2000 稀释）反应，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将pvdf膜放入1
×
tbst中清洗5次，每次10分钟，在摇床中90rpm摇动。二抗孵育：将pvdf膜放入二抗溶液中（bd pharmingen hrp anti h
µ
man igg，1:5000 稀释）反应，在摇床90rpm室温孵育1h。洗涤：将pvdf膜放入1
×
tbst中清洗5次，每次10分钟，摇床90rpm摇动。显色：取化学发光液a液3ml和b液3ml以1：1比例混合后加入到 pvdf膜孵育1
‑
2min，拍照。
43.结论：如图1a
‑
1d所示，新冠野生株、b.1.351变异株（图1a）、p.1变异株（图1b）、b.1.1.7变异株（图1c）、b.1.617.1变异株（图1d）dna疫苗在体外转染48小时后与空载体（pvax1）相比能够在细胞内高水平地表达抗原spike蛋白。
44.实施例3：新冠候选dna疫苗免疫原性验证为了评估实施例1制备的疫苗的免疫原性，以及免疫策略对体液免疫和细胞免疫应答的影响，从卡文斯百格公司购买了无特定病原体的6周龄c57bl/6雌性小鼠，并将其保存在艾棣维欣advaccine 实验室（苏州）的动物设施中。对于dna疫苗的接种：将实施例1所述dna疫苗根据不同分组的注射剂量先后注射到股骨前肌肉，然后进行电脉冲（ep）。电脉冲（ep）装置由两组具有0.2 amp恒定电流的脉冲组成。第二脉冲组被延迟3秒。在每个组中，有两个52 ms的脉冲，脉冲之间的延迟为198 ms。将第一次初免计为0天，第14天进行第二次免疫（加强免疫）。实验分组：（1）对照组载体质粒pvax1
‑
25
µ
g；（2）实验组野生型毒株pwt
‑
25
ꢀµ
g；（3）实验组变异株pb.1.351
‑
2.5
µ
g 变异株pp.1
‑
2.5
µ
g 变异株pb.1.1.7
‑
2.5
ꢀµ
g 变异株pb.1.617.1
‑
2.5
ꢀµ
g（mix
‑
2.5
µ
g）；（4）实验组变异株pb.1.351
‑
10
ꢀµ
g 变异株pp.1
‑
10
µ
g 变异株pb.1.1.7
‑
10
µ
g 变异株pb.1.617.1
‑
10
µ
g（mix
‑
10
µ
g）；第14，21天采集小鼠血液样品，用elisa法测定血清的特异性抗体滴度。在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天，处死被免疫的小鼠，以分析细胞的免疫反应。
45.1.评估dna疫苗引发的抗原特异性体液免疫应答1.1.elisa检测抗体浓度使用基于elisa方法评估针对sars
‑
cov
‑
2 rbd蛋白结合抗体。将nunc 96孔elisa平板在4
°
c下用1
ꢀµ
g / ml sars
‑
cov
‑
2 rbd蛋白（acro biosystems，de，美国）包被过夜。将板洗涤3次，然后用含5％牛血清白蛋白（bsa）的pbs（含0.05％tween 20，即pbst缓冲液）37℃下封闭1小时。将三倍连续稀释的小鼠血清添加到每个孔中，并在37
°
c下孵育1小时。将板再次洗涤五次，然后在37
°
c加入1：8000稀释的山羊抗小鼠igg
‑
hrp（genscript，nj，cn）孵育1小时后，随后检测结合抗体。最后洗涤后，通过使用tmb底物使板显影，并用50μl/孔2m h2so4终止反应。在450 nm和620 nm处读数，血清抗体滴度的终点确定为最高稀释度的倒数，样本最高稀释度比阴性对照的吸光度高2.1倍。(判定标准：实验组：对照组（阴性）od450
‑
620值≧2.1，判定该od值下对应的最高稀释度为血清抗体滴度）。
46.结论：结果如图2和图3所示，新冠mix变异株和野生株候选dna疫苗初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体。上述elisa试验中，采用新冠野生型sars
‑
cov
‑
2 rbd蛋白作为体外包被抗原，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pwt有利，然而本发明提供的新冠mix变异株 dna疫苗无论是2.5
µ
g还是10
µ
g的剂量均取得了明显更优的技术效果，如前所述，pwt是拥有非常优秀免疫效果的前期产品，更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。
47.1.2．假病毒中和抗体检测将 1x10
4 /孔的 huh
‑
7 细胞接种在含有 10% fbs 的 dmem 中的 96 孔板中。在感染前将接种的细胞培养八小时。为了检测中和抗体滴度，将小鼠血清（从 1:40 稀释开始）在 dmem 培养基中按 1:2 连续稀释，总共稀释九个稀释度。随后，将稀释的血清样品与 sars
‑
cov
‑
2 各变异假病毒在 37℃下孵育 30分钟后将混合物加入到huh
‑
7细胞中进行感染。进一步孵育12小时后，用新鲜的 dmem 培养基（含2% fbs）替换上清液。再培养48小时后去除细胞上清液，使用萤火虫荧光素酶测定试剂盒（promega）和酶标仪检测裂解后细胞内的绝对荧光素发光值，并通过将与同板中的病毒对照孔进行标准化来计算相对值。中和抗体滴度使用 graphpad prism 9计算，并定义为血清稀释度的倒数（减去细胞对照孔中的背景rlu后，rlu 与病毒对照孔中的rlu相比减少了50%）。
48.结论：结果如图4所示，新冠mix变异株候选dna疫苗加强免疫后第7天，对野生、b.1.351、p.1、b.1.617.1等病毒均能够有较好的中和活性，说明新冠mix变异株候选dna疫苗有广谱保护的潜力。
49.2.进一步评估dna疫苗引发的抗原特异性细胞应答预测并合成了s抗原特异性表位肽的多肽库（s peptide），并用该肽库刺激疫苗免疫后的小鼠脾细胞。
50.2.1.免疫细胞特异性刺激检测细胞免疫反应
我们通过elispot分析，研究dna疫苗是否可以促进细胞免疫。分别在初次免疫后14天和加强免疫后7天分离脾细胞，进行ifn
‑
γ 阳性细胞elispot实验。
51.2.2分离脾细胞在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天，无菌环境中进行，将小鼠安乐死，取出脾脏，研磨成单细胞悬液；离心收获细胞，红细胞裂解液重悬后裂解，含fbs的pbs终止裂解；过滤，对制备好的单细胞悬液计数；将单细胞悬浮在补充有10％fbs，1％青霉素/链霉素的rpmi1640培养基中。
52.2.3 ifn
‑
γ elispot实验通过使用小鼠ifn
‑
γ elispot试剂盒（dakewe，sz，cn）进行ifn
‑
γelispot测定。将通过上述方法分离的每只小鼠的脾脏细胞悬液以250,000的密度接种到每个包被有抗ifn
‑
γ抗体的孔中，并在37℃的co2培养箱中用sars
‑
cov
‑
2 rbd肽库刺激20小时，每孔中肽库浓度为10μg/ml（终浓度）（溶于rpmi 10％fbs）。根据产品说明书进行操作。培养基和pma /iono分别作为阴性和阳性对照。阳性斑点通过ispot reader（aid，德国stra
ß
berg）进行定量检测。通过减去阴性对照孔来计算每百万个细胞的斑点形成单位（sfu）。
53.结论：ifn
‑
γelispot结果如图5
‑
6所示，新冠mix变异株和野生株候选dna疫苗初次免疫后第14天、加强免疫后第7天均能有效诱导出高水平的抗原特异性ifn
‑
γ反应。上述试验elispot试验中，采用新冠野生型sars
‑
cov
‑
2 rbd蛋白作为体外刺激肽，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pwt有利，然而本发明提供的新冠mix变异株dna疫苗也取得了显著的技术效果，在初次免疫后第14天无论是2.5
µ
g还是10
µ
g的剂量组，加强免疫后第7天10
µ
g剂量组均较pwt野生型dna疫苗取得了明显更优的技术效果，如前所述，pwt是拥有非常优秀免疫效果的前期产品，更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。3.进一步评估疫苗引发的抗原特异性细胞免疫应答的影响，尤其是cd4和cd8 t细胞功能的影响，在加强免疫后7天分离脾细胞，进行流式细胞仪检测实验。
54.分离脾细胞：在加强免疫后7天，无菌环境中进行，将小鼠安乐死，取出脾脏，研磨成单细胞悬液；离心收获细胞，红细胞裂解液重悬后裂解，含fbs的pbs终止裂解；过滤，对制备好的单细胞悬液计数；将单细胞悬浮在补充有10％fbs，1％青霉素/链霉素的rpmi1640培养基中。
55.流式细胞仪检测实验：通过上述方法获得的来自每只小鼠的脾脏细胞悬液，37℃，5％co2下用sars
‑
cov
‑
2 rbd肽库或pma /iono刺激，同时利用1μg/ ml的brefedlin a阻断（bd，ca，美国）6小时。对脾细胞进行胞外及细胞内细胞因子染色，将刺激的脾细胞用fvd
‑
efl
µ
or780染色，然后洗涤，并在室温下于黑暗中分别用抗小鼠cd4，cd8a抗体染色30分钟。用固定/通透缓冲液透化细胞，并用抗小鼠ifn
‑
γ和抗小鼠tnf
‑
α在4℃下进行45分钟细胞内染色。将细胞洗涤两次，并用200
µ
l pbs重悬，然后使用流式细胞仪（thermofisher，ma，美国）进行采集，然后用flowjo软件（bd，ca, 美国）进行分析。
56.结论：结果如图7
‑
9所示，新冠mix变异株和野生株候选dna疫苗加强免疫后第7天, 能够显著诱导抗原特异性 cd4tnfa t细胞亚群和cd8ifnγ t细胞亚群的产生。上述试验facs试验中，采用新冠野生型sars
‑
cov
‑
2 rbd蛋白作为体外刺激肽，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pwt有利，然而本发明提供的新冠mix变异株dna疫苗取得了相当的显著的技术效果，如前所述，pwt是拥有非常优秀免疫效果的前期产品，更说明了本发明疫苗的良好
免疫原性和广谱性。
57.4.免疫细胞特异性刺激检测体内ctl反应由于ctl反应在抵抗病毒感染和消除病毒感染细胞方面起着关键作用，为了探索实施例1对细胞毒性t细胞功能的影响，在加强免疫后的第7天进行体内ctl检测。
58.取空白c57bl/6小鼠脾脏细胞（1.5x108）与10
µ
g s peptide pool共孵育，另取空白 c57bl/6小鼠脾脏细胞（1.5x108）不孵育多肽。37℃ 5% co2培养4h。用eflour450标记细胞，多肽孵育组（1x107细胞/ml 5
µ
m，高染）,无多肽孵育对照组（1x107细胞/ml 0.5
µ
m，低染）。高染细胞与低染细胞按照1:1的比例混合，最终总细胞浓度为2x107细胞 /ml。通过尾静脉注射，将4x106混合细胞注射免疫组小鼠体内，4h后取脾脏细胞，流式上机，收集样本。体内杀伤率计算公式如下。
59.其中t代表targets群，nt代表non targets群。
60.结论：结果如图10所示，新冠mix变异株和野生株候选dna疫苗加强免疫后第7天能够诱导了相当的高活性的抗原特异性ctl反应。
61.综上，由实施例1
‑
4的结果可知，本发明的变异株dna疫苗不仅在哺乳动物细胞内能够有效转录和表达；而且b.1.351、p.1、b.1.1.7、b.1.617.1变异株混合后的变异株具有免疫原性，表现在体液免疫和细胞免疫应答中，对于体液免疫应答，mix变异株dna疫苗在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体，并且对野生、b.1.351、p.1、b.1.617.1等病毒有较好的中和活性；对于细胞免疫应答，mix变异株dna疫苗不仅能够诱导出高水平的抗原特异性ifn
‑
γ反应、抗原特异性 cd4tnfa t细胞亚群和cd8ifnγ t细胞亚群的产生，而且能够诱导高活性的抗原特异性ctl反应。
62.值得注意的是，pwt野生株疫苗是本公司前期针对野生株的产品，目前即将进入iii期临床，具有非常优秀的免疫效果。上述试验中例如elisa、elispot和facs的检测中，试验均采用的是新冠野生型 sars
‑
cov
‑
2 rbd蛋白作为体外包被抗原或者体外刺激肽，该条件均是对新冠野生型核酸疫苗pwt有利，然而本发明提供的新冠mix变异株dna疫苗也取得了显著的，甚至明显更优的技术效果，尤其是抗体水平，更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。
63.尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。