一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及应用的制作方法

1.本发明属于基因工程及酶工程技术领域，尤其是指一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及应用。


背景技术：

2.角蛋白酶具有专一的降解天然角蛋白的功能，是一种有着强生物活性的蛋白酶。大多属于胞外的丝氨酸蛋白酶类，少部分属于结合酶或胞内蛋白酶。目前文献报道的产角蛋白酶微生物主要来源于细菌、真菌或放线菌，这些微生物大多从羽毛，鸟类羽毛或毛发废弃物堆积处分离获得。角蛋白酶相比于其他蛋白酶可以更温和、高效地处理含有角蛋白的原料，同时其可以改善处理后的角蛋白的营养价值。目前，角蛋白酶广泛应用于医药、化工、饲料、纺织、制革等工业中，在生物制剂的制备、废弃生物资源的利用等方面具有重要的应用价值，因此关于角蛋白酶的研究备受关注。
3.高温有利于羊毛、羽毛、头发等角蛋白纤维的快速水解，并且水解过程通常需要持续进行一段时间，这就要求角蛋白酶具有较好的热稳定性能。而目前已报道的多数蛋白酶在工业环境下通常是不稳定的。在前期研究中发现，角蛋白酶kerbp在60℃下的失活半衰期仅约为17min，稳定性不足是制约角蛋白酶应用的瓶颈问题。提高蛋白酶的稳定性，尤其是提高未知结构蛋白酶的稳定性是一项具有挑战性的工作。传统的改造方法，如定向进化，费时费力；完全的理性设计则有局限性，尽管现在所能应用的蛋白质结构数据信息量在迅猛地增加，计算机技术水平也在增强，但是蛋白质构效关系尚未完全解析清楚。目前，计算生物学和定向进化的交叉结合进一步加速了酶的理性改造进程。借助于计算机辅助设计的蛋白质工程改造能够基于精确和全面的结构解析、先进的基因操作以及与多学科技术相结合的新方法为高效生产具有稳定性的酶开辟了新的领域。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明借助于计算机辅助计算与分析，分别对角蛋白酶的高柔性loop区域、钙离子结合区域以及序列中的低频氨基酸进行定点突变和多位点组合突变的方法对短小芽孢杆菌角蛋白酶分子进行改造，构建出一种热稳定性提升的重组角蛋白酶工程菌株，同时也提供了一种有效的酶蛋白热稳定性改造策略。
5.本发明的第一个目的是提供一种角蛋白酶突变体，以氨基酸序列如seq id no.2所示的角蛋白酶为亲本，将亲本角蛋白酶第165位点的丙氨酸、第292位点的天冬酰胺、第170位点的谷氨酰胺、第190位点的亮氨酸、第92位点的组氨酸、第171位点的丝氨酸中至少一处突变为其他的氨基酸。
6.在本发明的一个实施例中，将亲本角蛋白酶第165位点的丙氨酸突变为谷氨酸、第292位点的天冬酰胺突变为苯丙氨酸、第170位点的谷氨酰胺突变为苏氨酸、第190位点的亮氨酸突变为谷氨酰胺、第92位点的组氨酸突变为天冬酰胺和第171位点的丝氨酸突变为甘氨酸中的至少一种突变。
7.在本发明的一个实施例中，将亲本角蛋白酶第165位点的丙氨酸突变为谷氨酸、第292位点的天冬酰胺突变为苯丙氨酸、第170位点的谷氨酰胺突变为苏氨酸、第190位点的亮氨酸突变为谷氨酰胺、第92位点的组氨酸突变为天冬酰胺和第171位点的丝氨酸突变为甘氨酸。
8.本发明的第二个目的是提供一种编码所述角蛋白酶突变体的基因。
9.本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的重组质粒。
10.本发明的第四个目的是提供一种表达所述角蛋白酶突变体的重组菌。
11.在本发明的一个实施例中，所述的重组菌是以芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母或丝状真菌为宿主菌。
12.本发明的第五个目的是提供获得所述角蛋白酶突变体的预测、分析及筛选方法。
13.本发明的第六个目的是提供所述的角蛋白酶突变体在医药、化工、饲料、纺织或制革行业中的应用。
14.所述的角蛋白酶突变体在医药、化工、饲料、纺织或制革行业中的应用。
15.所述的重组菌在医药、化工、饲料、纺织或制革行业中的应用。
16.在本发明的一个实施例中，所述应用具体是将所述重组菌进行发酵，得到角蛋白酶突变体，将所述角蛋白酶突变体应用于医药、化工、饲料、纺织或制革行业中。
17.本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
18.本发明提供了一株基于计算机辅助计算与分析，分别对角蛋白酶的高柔性loop区域、钙离子结合区域以及序列中的低频氨基酸进行定点突变和多位点组合突变的方法。获得了多个热稳定性提升突变体，其中多位点组合突变体在60℃的半衰期为66.1min，是野生型角蛋白酶的3.8倍；最适反应温度为60℃，较野生型提高了20℃。适合于工业化大规模生产，具有更好的应用价值和前景。并且利用计算机辅助计算与分析改造蛋白酶的方法可以成为工业酶热稳定性改造的通用途径。
附图说明
19.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
20.图1是本发明图1为角蛋白酶的高柔性loop区域三维模拟结构；
21.图2为预测的钙离子结合氨基酸在三维结构上的分布示意图；
22.图3为角蛋白酶位点氨基酸频率分析及突变选择；
23.图4
‑
1、图4
‑
2与图4
‑
3为角蛋白酶的高柔性loop区域定点突变结果；
24.图5为角蛋白酶的钙离子结合区域定点突变结果；
25.图6
‑
1、图6
‑
2为角蛋白酶的低频氨基酸突变结果；
26.图7为突变体q170t和a165e热稳定性提升分子机制；
27.图8为突变体q190l结构解析；
28.图9为序列趋同性突变体的结构解析；
29.图10为多位点组合突变结果；
30.图11为角蛋白酶在角蛋白提取中的应用；
31.图12为角蛋白酶在羽毛废弃物降解中的应用；
32.图13为角蛋白酶在制革脱毛中的应用。
具体实施方式
33.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
34.实施例1：角蛋白酶同源模型的构建
35.根据角蛋白酶基因kerbp的氨基酸序列在ncbi数据库中进行同源性比对，选择3种具有高同源性(大于60％)的晶体结构为模板，通过easymodeller软件模拟该角蛋白酶的3d立体结构，利用saves在线分析服务器(http://servicesn.mbi.ucla.edu)的verify 3d功能对所建模型进行质量评估。通过pymol和discoverystudio软件进行立体结构的相关分析操作。
36.实施例2：角蛋白酶的高柔性loop区域计算与分析
37.选用foldunfold以及iupred蛋白无序区结构预测工具对角蛋白酶的序列(seq id no.2)和结构进行分析。结合同源序列比对分析以及结构的可视化分析确定三段高柔性loop区域，分别为loop158
‑
171、loop265
‑
272和loop290
‑
305(图1)。进一步对上述三段loop区域组成氨基酸的b
‑
factor和rmsf通过预测软件predyflexy进行预测和计算，筛选出22个具有较高b
‑
factor和rmsf的氨基酸残基作为定点突变的对象。基于上述筛选的3个高柔性loop上的22个突变位点，本实验通过计算野生型与突变型的吉布斯自由能变的差值(δδg)来判断突变型是否稳定，进一步确定突变氨基酸类型。针对每个突变位点进行了19种氨基酸替换预测，构建虚拟饱和突变体库并根据δδg值进行突变体筛选，确定了19个突变位点共41种突变类型。
38.实施例3：角蛋白酶的钙离子结合区域预测与分析
39.通过在线预测工具ioncom分析角蛋白酶的氨基酸序列，预测了37个与钙离子结合相关的潜在氨基酸残基，进一步将这些氨基酸定位到角蛋白酶的同源模型结构中并从空间位置上将其划分为4组(图2)，通过观察以上4组在三维结构上的特征，确定了一个由氨基酸d149、l183、d184、n185、t186、i187,g188、v189以及l190构成的保守钙离子结合位点cai。针对角蛋白酶保守钙离子结合位点cai区域分析可知，d149,l183,i187,v189和n185为角蛋白酶与钙离子结合位点的保守氨基酸，其中钙离子直接与d149,l183,i187,v189残基配位，而构成穴状loop结构的其他氨基酸残基包括d184、t186、g188、l190起到支撑结构的作用。因此本实验对以上非保守氨基酸残基进行突变，以增强该位点对钙离子的结合能力或更好的维持该结构的稳定性。
40.实施例4：角蛋白酶的“低频”氨基酸计算与分析
41.将角蛋白酶kerbp氨基酸序列(fsata格式)提交在线同源序列比对分析软件consensus finder，以低于10％为低频氨基酸选择范围，将目标蛋白序列中出现频率较低的氨基酸残基替换为同源序列中该位点的“高频氨基酸”。根据分析预测结果共确定了20个突变位点及突变氨基酸(见图3)。
42.实施例5：角蛋白酶突变体的构建
43.根据角蛋白酶kerbp的序列(核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示)，设计定点突变引物(如表1)，对携带角蛋白酶kerbp基因的质粒kerbp/pma5
进行全质粒一步反向pcr。将纯化回收的pcr产物用dpn i酶进行消化处理以除去模板质粒。消化反应结束后，再以70℃反应10min进行灭酶处理，后立即置于冰上冷却，取10μl消化产物转化至克隆宿主e.coli jm 109中。对转化子进行菌落pcr验证，挑取验证正确的转化子进行测序验证，最后将正确构建的定点突变质粒转化到宿主细胞b.subtilis wb600中获得具有目的突变的重组菌，挑取转化子进行测序验证。
44.表1角蛋白酶定点突变引物设计
45.46.47.[0048][0049]
注：斜体字为突变位点
[0050]
实施例6：角蛋白酶活性测定
[0051]
以1％(w/v)可溶性角蛋白为底物进行角蛋白酶活性测定，具体方法如下：
[0052]
在0.5ml经ph 9.0的tris
‑
hcl稀释的酶液中加入0.5ml底物，在50℃水浴中孵育20min后加入1ml的4％tca溶液终止反应，然后将样品于12,000rpm离心5min，取1ml离心后上清液并加入5ml的0.4m na2co3和1ml的福林酚试剂，混合均匀后于40℃水浴中加热20min显色，冷却到室温后于660nm下测定吸光度。对照组先将酶液与tca溶液进行混合，50℃水浴中孵育20min后再加入底物，其余操作与实验组一致。所有实验测定3个平行反应数据，最终结果以平均值
±
标准偏差的形式表示，采用excel中stdev公式进行标准偏差的计算。
[0053]
酶活定义：在上述反应体系中，酶液水解底物使得660nm下吸光度值每增加0.01为一个酶活力单位，u
·
ml
‑1。
[0054]
酶活性测定结果显示，突变体n164v、n164c、n164i、a165e、a165g、q170t、q170a、g262k、n263c、s264m、s267c、s267h、s267e、s270p、s270w、n291c、n291t、n292f、v293c、l190q、h92n、h144d、s171g、t282v较好的保留了酶活，其中突变体n164c的角蛋白酶活性提升了13％(实验结果见图4
‑
1、图4
‑
2与图4
‑
3)；l190q的酶活性提升了69％(实验结果见图5)；s171g的酶活性提升了30％(实验结果见图6
‑
1与图6
‑
2)。
[0055]
实施例7：突变体筛选及热稳定性评价
[0056]
将正确构建的各突变体经牛奶lb平板划线分离出单菌落，挑取透明圈明显的单菌落至装有液体lb培养基(50μg
·
ml
‑1kanr)的孔板中培养8
‑
12h，通过酶活性测定进行突变体的初筛。进一步将初筛的突变株以3％接种量接种至tb发酵培养基(50μg
·
ml
‑1kanr)中发酵培养，每隔12h取样测定酶活进行复筛。取各突变重组酶分别在50℃、60℃、70℃下热处理60min，测定残余酶活；在60℃下分别孵育10min、30min、60min及90min，测定各突变体在60℃下的失活半衰期。
[0057]
通过对角蛋白酶的高柔性loop区域进行定点突变实验验证，获得两个热稳定性提升突变体a165e和q170t，在保持酶活性的基础上使角蛋白酶在60℃的半衰期由突变前17.3min分别提高至28.9min和38.5min(实验结果见图4
‑
1、图4
‑
2与图4
‑
3)。
[0058]
通过对角蛋白酶的钙离子结合区域cai的非保守氨基酸位点进行突变，筛选获得一种同时提高了角蛋白酶活性及稳定性的优势突变体l190q，其60℃下的半衰期提高至28.3min(实验结果见图5)。
[0059]
通过将角蛋白酶序列中出现频率低于10％的氨基酸残基替换为同源序列中该位点的“高频氨基酸”。共构建20个突变体，经过筛选获得两种酶活性和热稳定性同步提升突变体h92n和s171g(实验结果见图6
‑
1与图6
‑
2)。
[0060]
实施例8：突变体热稳定性提升的分子机制
[0061]
为探究突变位点热稳定性提高的分子机制，对改造位点突变前后分子间作用力进行分析，结果发现，170位点由谷氨酰胺突变为苏氨酸后，该位点与205位的天冬氨酸之间新形成一个更短且作用力更强的氢键，推测该氢键作用是使q170t突变体热稳定性提升的主要原因之一。同样，165位点由丙氨酸突变为谷氨酸之后，其与143位点以及164位点氨基酸残基之间形成的氢键距离均缩短，作用力更强，能够更好的维持蛋白的稳定性(实验结果见图7)。
[0062]
对钙离子结合位点氨基酸突变结果表明突变体g188n和g188q的稳定性有所提高，但酶活大幅下降，指出应把钙离子的结合作为一种调控机制看待，在调控蛋白酶的不同生物需求时，扮演着稳定和不稳定状态之间转换的开关作用。因此突变体g188n和g188q可能通过加强与钙离子的相互作用加从而提高了热稳定性，但阻碍了钙离子对酶的激活。而突变体l190q在空间上距离钙离子相对较远，突变后对钙离子影响较小，但其酰胺键易形成分子内或分子间氢键，从而提升了酶蛋白的稳定性(实验结果见图8)。
[0063]
从构建的20个序列趋同性突变体中筛选获得3个使热稳定性或表达量提升的突变体h92n、h144d、s171g，从角蛋白酶的3d同源模型可以观察到上述突变位点均位于蛋白质的表面(见图9)，其中突变体s171g将丝氨酸突变为结构最为简单的甘氨酸，减小了其跨膜阻力，并且丝氨酸为亲水性氨基酸，而甘氨酸的侧链介于极性与非极性之间，因此有利于其跨膜分泌；另外，甘氨酸在水中可电离，可以与水分子形成较为稳定的氢键，有利于提高蛋白质的稳定性。同理，h92n将碱性组氨酸突变为亲水性天冬酰胺，有利于提高其在溶液中的稳定性。
[0064]
实施例9：多位点组合突变
[0065]
通过上述的研究确定了6个在较好保留酶活性的基础上使角蛋白酶kerbp的热稳定性得以提升的突变体a165e和q170t、n292f、l190q、h92n和s171g，它们分别位于高柔性loop158
‑
171、loop290
‑
305、钙离子结合位点cai区域以及酶蛋白的表面。单个区域或位点的突变对整体蛋白的热稳定性提升效果具有一定局限，因此将上述位点进行组合突变，以期通过叠加效应使角蛋白酶的热稳定性得到进一步提升。结果表明，突变体在60℃的失活半衰期分别从17.3min提升至38.5min、48.9min、50.7min、66.1min，并且最适反应温度从40℃提高至60℃(实验结果见图10)。
[0066]
实施例10：角蛋白酶在活性角蛋白提取中的应用
[0067]
将羊毛用洗涤剂清洗两次以除去灰尘和其他杂质，再将洗涤剂冲洗掉，得到干净的羊毛。将洗净烘干的羊毛在索氏萃取器中用丙酮脱脂24小时，然后清洗以去除残留的溶剂。将脱脂的羊毛彻底干燥并剪碎备用。取5g剪碎的脱脂羊毛浸入100ml水溶液中，naoh调节ph为10.0，在65℃搅拌1h，使羊毛纤维溶胀。加入1％的谷胱甘肽在65℃下连续搅拌2
‑
3h预处理羊毛，辅助打开羊毛中的二硫键。将温度降至50℃后加入100ku的角蛋白酶溶液，连续搅拌48h。90℃加热10min使酶失活。将水解液在4℃，8000
×
g条件下离心20min，收集上清液用10kda透析袋在4℃条件下透析48h，每隔4h更换一次蒸馏水。
[0068]
结果表明提取获得了分子量约为45kda和28kda的可溶性羊毛角蛋白，该角蛋白提取物具有良好的生物相容性，表现出明显的促细胞增殖和迁移的作用，并且具有较强的抗氧化性(实验结果见图11)。该角蛋白在医用生物材料领域具有潜在的应用价值。
[0069]
实施例11：角蛋白酶在羽毛废弃物降解中的应用
[0070]
收集羽毛废弃物，清洗烘干后进行剪碎备用。称取1g的羽毛置于500ml三角烧瓶中，加入50ml浓度为0.4％，ph为10的l
‑
半胱氨酸溶液，85℃条件下处理3h.待温度降至室温后每瓶加入50ml角蛋白酶液，在40℃，220rpm条件下进行酶解处理。结果表明，角蛋白酶能够有效降解羽毛，并获得多种必需氨基酸(实验结果见图12)。角蛋白酶不仅解决了羽毛废弃物的回收处理，富含多种氨基酸的降解产物也是一种高品质的饲料添加剂。
[0071]
实施例12：角蛋白酶在制革脱毛中的应用
[0072]
将裁剪成约6cm
×
6cm大小羊皮置于含角蛋白酶10000u活力的粗酶液，在37℃200rpm条件下孵育，定时取出检测羊皮脱毛情况。脱毛结束后，将羊皮用自来水冲洗干净，进一步采用体视显微镜等分析脱毛的效果。由于脱毛效果无量化标准，因此采用感官评价和显微镜观察相结合的观察分析手段。分为三个等级，脱毛效果好：无需用力，轻易可以将毛扯下；脱毛效果一般：须用力可扯下羊毛；未能脱毛：用力也无法扯下羊毛。处理结果显示角蛋白酶可以对羊皮进行脱毛，且脱毛彻底，酶法脱毛的羊皮色浅且质地柔软、手感光滑。经体式显微镜观察显示脱毛后皮的粒面清晰完整(结果见图13)。
[0073]
seq id no.1：
[0074][0075]
seq id no.2：
[0076]
[0077]
[0078][0079]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。